HOLOTYPE HLA™ 96/11 CONFIGURAZIONE A CE C B CE …CE+User+Manuals... · RACCOMANDAZIONE CIRCA...

0086

PreparazionedelDNAperanalisidisequenziamentosuIlluminaMiSeq

HOLOTYPEHLA™96/11CONFIGURAZIONEA&CE

ECONFIGURAZIONEB&CE(REF:H32EREF:H34)

ISTRUZIONID’USOVERSIONE102/05/2018

Perusodiagnosticoinvitro

V1

OmixonHolotype96/11CONFIGURAZIONEConfigurazioneA&CEeConfigurazioneB&CEIstruzionid’usoversioneV1.Perusodiagnosticoinvitro.Copyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Proprietarioeriservato

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IndiceINFORMAZIONISULPRODUTTORE.......................................................................................................................7

SIGNIFICATODEISIMBOLI....................................................................................................................................7

CONTENUTODELKITHOLOTYPEHLA-96/11CONFIGURAZIONEA&CE(REF:H32)OCONFIGURAZIONEB&CE(REF:H34)............................................................................................................................................................8

SCATOLACOMPONENTIPRIMER.......................................................................................................................................8SCATOLACOMPONENTIREAGENTIPERPREPARAZIONELIBRERIE..............................................................................................8PIASTRAA96POZZETTICONADATTATORI..........................................................................................................................9WORKBOOKEXCEL.......................................................................................................................................................9SOFTWARE–OMIXONHLATWIN...................................................................................................................................9

TRASPORTOECONSERVAZIONE...........................................................................................................................9

AVVERTENZEEPRECAUZIONI.............................................................................................................................10

LIMITAZIONINOTEDELPRODOTTO.................................................................................................................................10

INFORMAZIONIPERLASICUREZZA.....................................................................................................................10

PARAMETRIDIPRESTAZIONE.............................................................................................................................11

ASSISTENZATECNICA.........................................................................................................................................11

SupportoTelefonico:........................................................................................................................................11

APPARECCHIATURE,REAGENTIEFORNITURE.....................................................................................................12

RACCOMANDAZIONITECNICHEESULLEAPPARECCHIATURE..................................................................................................12RACCOMANDAZIONISUIREAGENTIASSOCIATI...................................................................................................................12

CapacitàKitReagentiMiSeq............................................................................................................................13ATTREZZATURECONSIGLIATE.........................................................................................................................................13

AVVISOLEGALE..................................................................................................................................................14

DESTINAZIONED’USO........................................................................................................................................14

NOTAIMPORTANTEPRIMADIINIZIARE.............................................................................................................15

RACCOMANDAZIONECIRCAL’ESTRAZIONEDIDNAGENOMICO............................................................................................15

PRINCIPIODELMETODO.....................................................................................................................................15

SOMMARIODELLEFASI......................................................................................................................................17

GLOSSARIO/DEFINIZIONI....................................................................................................................................18

FASE1–PREPARAZIONEMASTERMIXPERAMPLIFICAZIONEHLA......................................................................19

ELENCOREAGENTI......................................................................................................................................................19PROTOCOLLO.............................................................................................................................................................19

Mastermix:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1eDQA1.................................................................20Mastermix:HLA-DRB4.....................................................................................................................................20Mastermix:HLA-DQB1serie3.........................................................................................................................20

FASE2–AMPLIFICAZIONEHLACLASSEIEII.......................................................................................................21


MastermixpiùTaqpolimerasi:HLA-A,B,C,DRB1/3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1eDQA1...............................22MastermixpiùTaqpolimerasi:HLA-DQB1serie3..........................................................................................22


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AmplificazioneclasseI(HLA-A,BeC)..............................................................................................................22AmplificazioneclasseII(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1eDQB1)....................................23Dimensioniprevisteampliconi.........................................................................................................................23

FASE3–QUANTIFICAZIONEENORMALIZZAZIONEAMPLICONI(UTILIZZANDOUNFLUORIMETROPERPIASTRE)24


Combinazioneampliconi..................................................................................................................................26PurificazionePCRExoSAP-ITExpress................................................................................................................26

FASE4–PREPARAZIONELIBRERIA......................................................................................................................27


Mastermixframmentazione............................................................................................................................28Programmaframmentazione...........................................................................................................................28Mastermixriparazioneestremità....................................................................................................................29Programmariparazioneestremità...................................................................................................................29Mastermixligazione........................................................................................................................................30Programmaligazione.......................................................................................................................................30Combinazioneepurificazionelibreria..............................................................................................................31

FASE5–SCELTADELLEDIMENSIONIDELLALIBRERIA.........................................................................................33


FASE6–QUANTIFICAZIONEDELLALIBRERIACONUNOSTRUMENTOQPCR........................................................34


PrimermixqPCR...............................................................................................................................................34MastermixqPCR..............................................................................................................................................35

FASE7–SEQUENZIAMENTOSUILLUMINAMISEQ..............................................................................................37

ELENCOREAGENTI......................................................................................................................................................37CapacitàKitReagentiMiSeq............................................................................................................................37

PROTOCOLLO.............................................................................................................................................................37

FASE8–ANALISIDATIDISEQUENZIAMENTOHLA..............................................................................................39

PROTOCOLLOAUTOMATIZZATO.....................................................................................................................................39InstallazioneITeconfigurazione......................................................................................................................39Protocolloperanalisi.......................................................................................................................................39

PROTOCOLLOSERVERMANUALE....................................................................................................................................39InstallazioneITeconfigurazione......................................................................................................................39Protocolloperanalisi.......................................................................................................................................39

PROTOCOLLODESKTOPMANUALE..................................................................................................................................39InstallazioneITeconfigurazione......................................................................................................................39Protocolloperanalisi.......................................................................................................................................40

FIGURESUPPLEMENTARI....................................................................................................................................41

ESEMPIODISCHEMAPERPIASTRAAMPLICONI,PIASTRAAMPLIFICAZIONE,PIASTRADILUIZIONE,PIASTRAQUANTIFICAZIONEAMPLICONI(PERUNLOCUSINDIVIDUALE)EPIASTRAREAZIONE............................................................................................................41ESEMPIODIPIASTRAQUANTIFICAZIONESTANDARD............................................................................................................41ESEMPIODIPIASTRAPERQUANTIFICAZIONELIBRERIACONQPCRKAPA................................................................................42


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APPENDICE1:PIPPINPREP.................................................................................................................................43

PROGRAMMAZIONEPIPPINPREP...................................................................................................................................43ESECUZIONEDIUNACORSASUPIPPINPREP.....................................................................................................................43

APPENDICE2:QUANTIFICAZIONEAMPLICONIUTILIZZANDOUNOSTRUMENTOPERQPCR.................................46


APPENDICE3:QUANTIFICAZIONELIBRERIECONUNCOLORANTEFLUORESCENTEINTERCALANTENELDSDNA...48



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Cronologiarevisioni–Noteeaggiornamentiimportanti

Versione Data Autore Sommariodellemodifiche Autorizzatada

Datadiemissione

V1 14/12/2017 TündeVágó Primaversione,bozza EfiMelista 02/05/2018


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Liberatoria

Omixonhacompiutoilmassimosforzopergarantirel’accuratezzadellepresentiIstruzionid'uso(IFU).TuttaviaOmixonescludequalsiasiresponsabilitàpereventualiimprecisioniodomissioni.Le informazioni nelle presenti IFU sono soggette amodifiche senzapreavviso.Omixonnon siassumealcunaresponsabilitàpereventualiimprecisionichepotrebberoesserecontenutenellepresentiIFU.

OmixonsiriservaildirittodiapportaremiglioramentiallepresentiIFUe/oaiprodottiquidescrittiinqualsiasimomentosenzapreavviso.

Qualoranelpresentemanualesirilevasseroinformazioninoncorrette,ingannevolioincomplete,vi saremo grati per qualsiasi commento e suggerimento. Vogliate inviarceli all’[email protected].


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InformazionisulproduttoreRagionesociale:OmixonBiocomputingLtd

Indirizzo:Fehérváriút50-52/6

Città:Budapest

Codicepostale:H-1117

Paese:Ungheria

Significatodeisimboli

LOTTO/Numerolotto

Numerodiriferimento/catalogo

ConsultareleIstruzionid’uso

ContienereagentepernumeroNditest

Fabbricante.Ladataindicatainsiemealsimbolosiriferiscealladatadiproduzione

Temperaturadiconservazioneraccomandata

Datadiscadenza

Dispositivomedico-diagnosticoinvitro

ContieneunricambioRicambio


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Contenuto del kit Holotype HLA-96/11 ConfigurazioneA&CE(REF:H32)oConfigurazioneB&CE(REF:H34)

ScatolacomponentiprimerLa scatola dei componenti primer contiene soluzioni specifiche pronte all’uso di primer perl’amplificazionemiratatramite long-rangePCRdeigeniHLAA,B,C,DRB1,DRB3,DRB4,DRB5,DPA,DPB1,DQA1eDQB1. Inaggiunta,essacontienedue tipidiadditiviperPCR (Enhancer1eEnhancer2).

Primermix N.RIF. Reaz. Vol./prov. N.prov. Codif.coloreHLA-A P012 96 220μL 1 GialloHLA-B P022 96 220μL 1 RossoHLA-C P032 96 220μL 1 ArancioHLA-DRB1/3 P042 96 220μL 1 VerdeHLA-DRB4 P072 96 220μL 1 BiancoHLA-DRB5 P112 96 220μL 1 RosaHLA-DPA1 P132 96 220μL 1 NeroHLA-DPB1 P072 96 220μL 1 ViolaHLA-DQA1 P082 96 220μL 1 MarroneHLA-DQB1(serie3) P122 96 220μL 1 BluEnhancer1 E01 96 1100μL 1 TrasparenteEnhancer2 E02 96 300μL 1 Trasparente

ScatolacomponentireagentiperpreparazionelibrerieLa scatola componenti preparazione librerie fornisce reagenti per la preparazione di librerie(frammentazione,riparazioneblunt-endeadenilazionedelleestremitàdegliampliconi,ligazionedisequenzediadattatoriindicizzati)apartiredagliampliconiHLA.

Reagente N.RIF. Reaz. Vol./prov. N.prov. Codif.coloreEnz.framment.(A) R11 96 278μL 1 GialloTamponeFfamment.(B) R21 96 278μL 1 RossoEnz.Riparaz.Estrem.(C) R31 96 162μL 1 VerdeTamp.Riparaz.Estr.(D) R41 96 324μL 1 ArancioEnz.ligazione(E) R51 96 324μL 1 BluTamp.ligazione(F) R61 96 1800μL 2 Nero


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Piastraa96pozzetticonadattatoriIlcomponente“piastraa96pozzetticonadattatoriindicizzati”contieneadattatoriindicizzatiperNGSpronti all’uso (oligonucleotidiDNAadoppio filamento) in5μLdi soluzioneper generaresingolelibrerieperNGS.Questapiastraa96pozzetticonadattatoriindicizzaticontieneunnumerodi adattatori indicizzati sufficiente a generare 96 librerie NGS indipendenti e la successivaidentificazionedeicampioni.

Versionekit Reagente N.RIF. Reaz. Vol/pozzetto

N.diPiastre

H32 PiastraadattatoriA(i1-96) N1 96 5μL 1H34 PiastraadattatoriB(i97-192) N2 96 5μL 1

WorkbookExcelPer facilitare il protocollo Holotype HLA 96/11 viene fornito unWorkbook Excel completo dicalcoli,layoutpiastre,registrazionedati,generazionedelfogliocampioniperMiSeqemoltoaltro.Senonneaveteunacopia,[email protected].

Software–OmixonHLATwinContattatesales@omixon.compericreditiOmixonHLATwinassociaticonilvostroacquistodelkitHolotypeHLA96/11.

Notaimportante:Siraccomandal’impiegocombinatodeitrecomponentidelkitOmixonHolotypeHLA96/11conilsoftwareOmixonHLATwinperunprocessodiagnosticoinvitrointegrale.ConsultatelaSezioneAvvertenzeeprecauzionicircalelimitazionid’usodelprodotto.

Sono disponibili componenti di ricambio previa apposita richiesta da parte dell’utilizzatore.Omixon fornisce le confezioni completedi tutti i componenti, non flaconi singoli. [email protected].

TrasportoeconservazioneIlprodottovienespeditoinscatoled’imballodipolistiroloconghiaccioseccoeall’arrivodovràessereconservatoa-20°C.Sietepregatidiconvalidareilvostroprocessodicontrolloemonitoraggiodellatemperaturadeicongelatoriedieffettuareinterventidimanutenzioneregolari.Seconservatia-20°C,ikitnonapertisonostabilifinoalladatadiscadenza(indicatasull’etichettadelkit).Dopo l’apertura, si raccomandanomax. quattro (4) cicli di congelamento/scongelamento pergarantirelastabilitàdelprodotto.Seconservatia-20°C,ikitapertisonostabilifinoa3mesi.


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AvvertenzeeprecauzioniLimitazionid’usodelprodotto

Pergarantireprestazioniottimali,usateilkitHolotypeHLA24/7eilsoftwareOmixonHLATwinper la tipizzazione dell’HLA mediante NGS con i componenti, i reagenti e le attrezzatureraccomandatinellasezione“Apparecchiatureereagenti”.L’impiegodi componentie reagentidiversidaquelli specificati inquesta sezionevaverificatoevalidatodall’utilizzatore.NonricostituirenédiluireireagentiinvolumidiversidaquellidescrittinellepresentiIFU.Nonutilizzarevolumideireagentiminoridiquellispecificati. Incasocontrario,potrannoverificarsideglierroridiprestazione.OmixonnonpuòfornirealcunsupportopereventualiproblemirisultantidalmancatorispettodellefasiprevistenelprotocollodescrittonellepresentiIFU.Incasodidannivisibiliaisuoicomponenti,nonutilizzareilprodotto(flaconiopiastradanneggiati,tappiallentati,ecc.).

LimitazioninotedelprodottoConsultareildocumento“ProductKnownLimitationsGuide”(Limitazioninotedelprodotto)circale ambiguità e le limitazioni del software note del prodotto Holotype HLA. Il documentoè distribuita insieme alle IFU ed è anche disponibile sul sito web Omixon nella sezioneMyHolotype/SupportandServices/HLATwin Instructions forUse,oppurepuòessere richiestaall’[email protected].

InformazioniperlasicurezzaPrimadiiniziare,leggerelesezioni“Informazioniperlasicurezza”e“Noteimportanti”circareagentiokitspecificatiin“Apparecchiature,reagentieforniture”.Quando si lavora con sostanze chimiche, indossare sempre camici, guantimonousoeocchialiprotettivi adatti. Per maggiori informazioni, consultare le schede di sicurezza (SDS) reperibilipressoirispettivifornitori.UnapanoramicadeicomponentichimicideireagentidelprodottopuòesseredesuntadagliSDSdelkitHolotypeHLA96/11,disponibilisurichiesta.Icomponentidelprodottovannosmaltiticomerifiutimedicigenerici.


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ParametridiprestazionePrincipaliparametridiprestazionestabilitiinbaseallavalidazionedelprodotto.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensibilità 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Specificità 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Precisione 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Accuratezza 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Riproducibilità 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Ripetibilità 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

AssistenzatecnicaPerassistenzageneralesuquestoprotocollocontattatesupport@omixon.com

SupportoTelefonico:StatiUniti|+1(617)500-0790Europa|+36705748001RestodelMondo|+1(617)500-0790


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Apparecchiature,reagentieforniture

Raccomandazionitecnicheesulleapparecchiature§ Termociclatoreconbloccoa96pozzetti§ Fluorimetroperpiastre(oqualsiasistrumentoingradodirilevarefluorescenzadapiastra

a96pozzetti,dautilizzareincombinazioneconilsistemaPromegaQuantiFluordsDNA)§ PippinPrep(Cat#PIP0001)oBluePippin(Cat#BLU0001)dellaSAGEScience§ StrumentoperqPCRconformatoperpiastrea96o384pozzetti§ FluorimetroQubit(n.cat.Q33216,ThermoFisherScientific)(opzionale)§ IlluminaMiSeq(n.cat.SY-410-1003)§ PC64-bitconmin.4coree16GBdiRAM§ Spaziodiarchiviazionedatialungotermine(circa2TBdidatiperMiSeqall’anno)

Raccomandazionisuireagentiassociati§ Kitperlong-rangePCRdellaQiagen(n.cat.206401,206402o206403)

§ Ciascuncampionerichiede4,4μLdiTaqpolimerasi§ Ilkitperlong-rangePCR(n.cat.206401)(20)contiene8μLdiTaqpolimerasi§ Ilkitperlong-rangePCR(n.cat.206402)(100)contiene40μLdiTaqpolimerasi§ Ilkitperlong-rangePCR(n.cat.206403)(250)contiene100μLdiTaqpolimerasi

§ ExoSAP-ITdellaAffymetrix(n.cat.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLo75001-10ML)§ Ciascuncampionecombinatoinpoolrichiede4μLdienzimaExoSAP-IT§ Iln.cat.75001-200contiene200μLdienzimaExoSAP-ITExpress§ Iln.cat.75001-1-MLcontiene1mLdienzimaExoSAP-ITExpress§ Iln.cat.75001-4X-1MLcontiene4mLdienzimaExoSAP-ITExpress§ Iln.cat.75001-10MLcontiene10mLdienzimaExoSAP-ITExpress

§ KitperQuantificazioneLibreria–Illumina/UniversaldellaKAPABiosystems(n.cat.KK4824)§ KitperSaggiQubitdsDNABR(n.cat.Q32850oQ32853)(opzionale)

§ Iln.cat.Q32850contiene100saggi§ Iln.cat.Q32853contiene500saggi

§ QuantiFluordsDNASystemdellaPromega(n.cat.E2670)§ BiglieAgencourtAMPureXPdellaBeckmanCoulter(n.cat.A63880,A63881oA63882)

§ OgnisequenziamentoHolotypeHLArichiedeunmassimodi900μLdibiglieAMpureXP§ Iln.cat.A63880contiene5mLdibiglieAMPureXP§ Iln.cat.A63881contiene60mLdibiglieAMPureXP§ Iln.cat.A63882contiene450mLdibiglieAMPureXP

§ Cassettagel,1,5%diagarosio, senzacolorantecon standard interno (MarkerK/R2),perPippinPrep/BluePippin(n.cat.CDF1510perPippinPrepeBDF1510perBluePippin)

§ Etanoloperusoinbiologiamolecolare(alcolanidro)§ Acquaperusoinbiologiamolecolare(privadiDNasieRNasi)§ Idrossidodisodio§ TamponeTE1×(pH8,0)§ KitReagentiMiSeqdellaIllumina


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CapacitàKitReagentiMiSeq

KitreagentiIlluminaMiSeq

TempoOre

Campioni96/11

Std500Cycle(MS-102-2003)

~39 96


~24 72

Micro300Cycle(MS-103-1002)

~19 20

Nano500Cycle(MS-103-1003)

~28 8


~17 4

Attrezzatureconsigliate§ Provettepermicrocentrifugada1,5mL§ Provettelow-bindpermicrocentrifugada1,5mL§ Provette low-bindpermicrocentrifugada2,0mL (raccomandataEppendorfDNALoBind

Cat#022431048)§ Provetteaparetesottileda0,5mlperlostrumentoQubit(raccomandateQubitAssaytubes

Cat#Q32856)§ Pipetteavolumeregolabile(capacità1,0–1000μL)§ Pipette8canaliavolumeregolabile(capacità1,0–100μL)§ Piastrea96pozzetticompatibiliconiltermociclatore§ Piastreottichea96pozzetticompatibiliconilfluorimetroperpiastre§ Piastrea96pozzetticompatibiliconlostrumentoqPCR§ Pellicolesigillantiperpiastreperusogenerale§ Pellicolesigillantiperpiastrecompatibiliconitermociclatori(testateperlong-rangePCR)§ PellicolesigillantiperpiastreottichecompatibiliconlostrumentoqPCR(opzionali)§ Supportomagneticoperprovettedamicrocentrifugada2mL§ Rackrefrigerantia96pozzetti(2pezzi)§ Provetteconicheda50mL§ Reservoirda50mL


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AvvisolegaleLe IFU relative a Holotype HLA 96/11 e il rispettivo contenuto sono di proprietà di OmixonBiocomputingLimited(“Omixon”),esonodestinatiunicamenteall'usodell'unoopiùprodottiividescritti da parte del cliente come previsto dal contratto e a nessun altro scopo. Il presentedocumentoeilsuocontenutonondovrannoessereutilizzatinédistribuitipernessunaltroscoponédivulgati,descrittioriprodottiinaltromodosenzailconsensoscrittodiOmixon.Conilpresentedocumento,Omixonnon trasferisce alcuna licenzadi sfruttamentodel suobrevetto,marchio,copyright,néalcundirittotutelatodallaleggeodirittisimiliditerzeparti.

Omixon HLA Twin (“Software”) è concesso in licenza al cliente nei termini e condizioni dellaOmixonHLATwinEULA(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Incasodimancataaccettazionedeitermini e delle condizioni qui riportati, Omixon non vi rilascia la licenza e non vi autorizzaautilizzarenéainstallareilSoftware.

Le istruzioni fornite nel presente documento devono essere osservate scrupolosamente edesplicitamentedapersonalequalificatoeopportunamenteaddestratopergarantirel'usocorrettoesicurodeiprodottiquidescritti.Primadiutilizzare taliprodotti, ilpresentedocumentodeveesserelettoecompresointuttelesueparti.

QUALORAILDOCUMENTONONVENGALETTOINTEGRALMENTEEOSSERVATOESPLICITAMENTE,TUTTE LE ISTRUZIONI IN ESSO CONTENUTE POSSONO COMPORTARE DANNEGGIAMENTO DEIPRODOTTI,LESIONIALLEPERSONE,INCLUSIUTILIZZATORIOTERZEPERSONE,EDANNIADALTREPROPRIETÀ.

OMIXON NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILITÀ DERIVANTE DA UN USO IMPROPRIO DEIPRODOTTIDESCRITTIQUI(INCLUSELOROPARTIOSOFTWARE)ODAQUALSIASIUSODIESSINONPREVISTODALLEAUTORIZZAZIONI EPERMESSI SCRITTI EDESPLICITI CONCESSIDAOMIXON INRELAZIONEALL'ACQUISIZIONEDITALIPRODOTTIDAPARTEDELCLIENTE.

PERUSODIAGNOSTICOINVITRO©2017OmixonBiocomputingLtd.Tuttiidirittiriservati.

Destinazioned’usoIl prodottoHolotypeHLA96/11 – ConfigurazioneA&CE e ConfigurazioneB&CE (designato“HolotypeHLA”)èunacombinazionedireagentipertestdiagnostici invitroeunsoftwareperl'analisi di dati (Omixon HLA Twin™) ed è destinato all'identificazione e alla definizione degliantigeni leucocitari umani (HLA) di classe I e II e alla tipizzazione HLA con l’impiego dellapiattaforma di sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS)Illumina®MiSeq.HolotypeHLAfornisceinformazionisull’istocompatibilitàumanadeilociHLAdiclasseI(A,BeC)eII(DPA1,DPB1,DQA1,DQB1,DRB1,DRB3,DRB4eDRB5)impiegandoDNAgenomicoumano.

IlsoftwareOmixonHLATwin™inclusonelprodottoHolotypeHLAserveainterpretareeconciliarei dati di sequenziamento generati sul sistema Illumina® MiSeq, consentendo una precisa


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tipizzazioneHLAalivelloallelicoinunsolopassaggio,conpercentualediambiguitàmoltobassaal2°campo.

IlprodottoHolotypeHLAèprevistoperusodiagnosticoinvitrodapartedioperatorisanitari,cometecnicidilaboratorioemedici,preparatinelcampodellatipizzazioneHLAinlaboratoridiagnosticiaccreditatiEFIoASHIoingradodilavorareinaccordoconlespecificheEFIoASHI.

Notaimportanteprimadiiniziare

Raccomandazionecircal’estrazionediDNAgenomicoIlDNAgenomicoumanodovràesserepreparatoutilizzandokitperlapreparazionedelDNAbencollaudati, disponibili in commercio, che ne garantiscano la coerenza. Indipendentementedall'approccio, per avere risultati solidi è necessario che la concentrazione e la purezza sianodeterminateinmodoaccurato.

IlDNAdev'essereprivodicontaminantichepossanosuccessivamenteinfluenzarnel’amplificazione,lapreparazionedellelibrerieelefasidisequenziamento(es.alcol,sali,tensioattivi,formaldeideed eparina). Il sangue non va raccolto in provette eparinizzate e non si dovranno utilizzarecampionidisangueprovenientidapazientiinterapiaconeparinanécampionilipemicioemolizzati.

IlDNAgenomicoestrattopuòessereusatoimmediatamentesediscioltoinacquaprivadinucleasi,oconservatoperlunghiperiodia-20°Coatemperatureinferiori.Siconsiglial’usodiacquaperlapreparazionedelgDNA,poichél’EDTAnelbufferTEpuòinibirelereazionidellalong-rangePCR.Perridurreladegradazionevannoevitaticicliripetutidigelo-disgelo.

Al finediottenere100-150ngdiDNAgenomicodipartenzaperogniamplificazionemediantePCR, è altamente raccomandata una concentrazione pari a 20-30 ng/μl di DNA. È altamenteraccomandatol’impiegodiunmetododiquantificazionemediantefluorescenzaalfinedideterminarelaconcentrazionedigDNA.

Sonoaltamenteraccomandativaloridelrapportodiassorbanzadi260nm/280nme260nm/230nmparia1,7–2.

Perl’amplificazionediHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1/DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1eHLA-DQB1,sonorichiesti1,0-1,5µgdigDNA.

PrincipiodelmetodoPermoltianni, la comunitàHLAha lavoratoallo sviluppodiunmetodopercaratterizzareconprecisionel'elevatopolimorfismodeigeniHLAedeiloroprodotti.L'avventodellaPCR,combinataconaltretecnologie(sequenziamentodiSanger,SSOP,SSP,Luminex),haconsentitodimiglioraresignificativamente il rilevamento di polimorfismi HLA, sebbene con diverse limitazioni cheimpedisconodicaratterizzareesaurientementeigeniHLA.Letecnologiesviluppatenelcorsodegliultimi anni, designate collettivamente sequenziamento di nuova generazione (NGS), hannooffertonuoveopportunitàcheconsentonolacaratterizzazionecompletadeigeniHLAinmodalità


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aploide.L'NGShaduecaratteristiche importanti:1) il sequenziamentoclonaledi frammentidiDNA, e 2) la produttività elevatissima. L'NGS consente di stabilire la fase dei polimorfismi,eliminandocosì tutte leambiguità,econsente la tipizzazioneHLAal3°o4°camposenza testreflex, in tal modo introducendo un approccio potenzialmente risolutivo al problema dellatipizzazioneHLA.Ilprotocollodescrittoquisfruttaquestatecnologiaecombinal’amplificazionemediantelong-rangePCRdigeniHLAconilsequenziamentosullapiattaformaIlluminaMiSeq.Piùinparticolare,igeniHLAA,B,C,DPA1,DQA1eDQB1vengonoamplificatiperl'interalunghezzacodificantefinoaincludereelementidelleUTR5’e3’,mentreigeniDRB1,DRB3eDRB4vengonoamplificatidall'introne1all'introne4eigeniDRB5eDPB1vengonoamplificatidall'introne1allaUTR3’.Gliampliconivengonoquindiprocessatiattraversounaseriedifasi:

1. frammentazionedegli ampliconi aunadimensioneappropriataper il sequenziamento sullapiattaformaIllumina,

2. riparazioneblunt-endeadenilazionedelleestremitàdegliampliconiframmentati

3. ligazione di sequenze adattatrici che vengono usate nell'intero processo sul MiSeq percatturare,amplificareesequenziareilDNA.Gliadattatoriincludonoancheunindicecostituitodaunabrevesequenza,univocaperciascunadattatore,cheidentificailmaterialedipartenzadellalibreria(campione/locus).

Dopolacombinazionedellelibrerieindicizzateinununicopool, laselezionedimensionaleelaquantificazione, il campionevienecaricatosulMiSeqper il sequenziamento.L'interoprocessorichiede3-5giorni,asecondadellasceltadeltipodicellaaflussodellapiattaformaIllumina.Ilsommariodellefasidelprotocolloèriportatonellafigurasotto:


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SommariodelleFasi


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Glossario/Definizioni§ Piastraampliconi–Nomealternativodellapiastradiamplificazione.§ Piastraquantificazioneampliconi–piastraa96pozzetticompatibileconilfluorimetroper

piastreincuigliampliconidiluitivengonoquantificati.§ Piastraamplificazione–Piastraa96pozzettiperPCRusataperamplificareilociHLA.§ Libreriafinale–Libreriacheincludetuttelelibreriecampionipronteperesseresequenziate

inunasingolacorsasuMiSeq§ Piastradireazione–Piastraincuivengonocondottelesuccessivereazionidiframmentazione,

riparazioneblunt-end/adenilazioneeligazionedegliadattatoriindicizzatiallelibreriecampioni§ Piastrareagenti–Serveperaliquotareivarireagentiusatiperprepararelelibrerie§ Libreriacampioni–UnalibreriapreparatacombinandoinpooltuttiilociHLAperundato

campione§ Piastra libreriecampioni:Piastracontenenteunalibreriacampioni(tutti i locicombinati)

perpozzetto§ Piastraquantificazionestandard–Piastraa96pozzetticompatibileconilfluorimetroper

piastre in cui vengono posti gli standard di DNA per consentire la quantificazione degliampliconi.


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Fase1–PreparazionemastermixperamplificazioneHLADurata:~2oreLoscopodiquestafaseèprepararemastermixlocus-specificheperamplificareindividualmenteognunodei locusHLAdesiderati. I lociamplificatipermezzodiquestoprotocollosonoHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1/DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1eHLA-DQB1.

Nota: Le master mix preparate in questa fase includono tutti i reagenti necessari perl'amplificazioneaeccezionedellamisceladiTaqpolimerasi

ElencoreagentiComponente Conservazione Provenienza

PrimermixHLA-A -20°C OmixonPrimermixHLA-B -20°C OmixonPrimermixHLA-C -20°C OmixonPrimermixHLA-DRB1/DRB3 -20°C OmixonPrimermixHLA-DRB4 -20°C OmixonPrimermixHLA-DRB5 -20°C OmixonPrimermixHLA-DPA1 -20°C OmixonPrimermixHLA-DPB1 -20°C OmixonPrimermixHLA-DQA1 -20°C OmixonPrimermixHLA-DQB1(serie3) -20°C OmixonEnhancer1 -20°C OmixonEnhancer2 -20°C OmixonTamponelong-rangePCR(10×) -20°C QiagendNTP(10mMciascuno) -20°C QiagenH2Operusoinbiologiamolecolare -20°C Qiagen

Protocollo1.1 –Prelevaretuttelemiscelediprimer,gliEnhancer1e2,idNTPeiltamponeperlong-range

PCR(10×)dalluogodiconservazioneelasciarescongelareatemperaturaambiente.

1.2 – Preparare l’Enhancer combinato: aggiungere 132 μL di Enhancer 2 nella provettacontenenteEnhancer1.RietichettarelaprovettaEnhancer1con“Enhancercombinato”.Metteredapartel’Enhancer2rimanenteperusarlonellareazionedellalong-rangePCRdiDRB4.

1.3 –Preparareunamastermixperciascunaprimermixsecondoletabelleriportatediseguito:


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Mastermix:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1eDQA1

Reagente Volume/campione/locus Volume/96campioni/locusPrimermix 2μL 204μLTamponelong-rangePCR(10×) 2,5μL 255μLdNTPmix(10mMciascuno) 1,25μL 127,5μLH2Operusoinbiologiamolecolare 13,85μL 1412,7μLVolumetotale 19,6μL 1999,2μL

Mastermix:HLA-DRB4

Reagente Volume/campione/locus Volume/96campioni/locusPrimermix 2μL 204μLTamponelong-rangePCR(10×) 2,5μL 255μLdNTPmix(10mMciascuno) 1,25μL 127,5μLEnhancer2 0,6μL 61,2μLH2Operusoinbiologiamolecolare 13,25μL 1351,5μLVolumetotale 19,6μL 1999,2μL

Mastermix:HLA-DQB1serie3

Reagente Volume/campione/locus Volume/96campioni/locusPrimermix 2μL 204μLTamponelong-rangePCR(10×) 2,5μL 255μLdNTPmix(10mMciascuno) 1,25μL 127,5μLEnhancercombinato 5,6μL 571,2μLH2Operusoinbiologiamolecolare 7,85μL 800,7μLVolumetotale 19,2μL 1958,4μL

1.4 –Agitaremediantevortexciascunamastermixecentrifugareper1secondo.Metterelemastermixsughiaccio.

1.5 –DiluiretuttiigDNAfinoaunaconcentrazionedi30ng/μL(ilvolumeminimoè55μL).

Nota: Holotype HLA include reagenti sufficienti per 96 reazioni più un volumeaddizionalepercompensareperditedipipettamentoeamplificazionifallite.


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Fase2–AmplificazioneHLAclasseIeIIDurata:~8oree10minutiLoscopodellaFase2èamplificareilociHLA.LeamplificazionidiHLAclasseIeclasseIIsonostateottimizzateutilizzandoduesetdistintidicondizioniPCR.UnavoltacompletatelereazionidiPCR,l’amplificazionevieneverificatamedianteelettroforesisugeldiagarosio(opzionale).

Suggerimento–Benchél’elettroforesisugeldiagarosio(fase2.5)siaraccomandata,essanonènecessariaper completare con successo il protocolloHolotypeHLA.Nella fase di quantificazione degli ampliconi (Fase 3), qualsiasi concentrazionesuperiorea50ng/μLèconsiderataun’amplificazioneriuscita.L’elettroforesisugeldiagarosiorappresentaunafaseimportantedicontrollodellaqualitàenondeveessere omessa se non si ha sufficiente esperienza con il protocollo completoHolotypeHLA.


MastermixHLA-A -20°C Fase1MastermixHLA-B -20°C Fase1MastermixHLA-C -20°C Fase1MastermixHLA-DRB1/DRB3 -20°C Fase1MastermixHLA-DRB4 -20°C Fase1MastermixHLA-DRB5 -20°C Fase1MastermixHLA-DPA1 -20°C Fase1MastermixHLA-DPB1 -20°C Fase1MastermixHLA-DQA1 -20°C Fase1MastermixHLA-DQB1(serie3) -20°C Fase1Taqpolimerasi -20°C QiagengDNA 4°C UtilizzatoreH2Operusoinbiologiamolecolare 20°C Utilizzatore

Protocollo2.1 –Prelevarel'enzimaTaqpolimerasidalluogodiconservazione,centrifugarloeaggiungerlo

a ciascunamastermix secondo le tabelle riportate sotto, sciacquando a fondo i puntalipipettandosuegiù:


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Master mix più Taq polimerasi: HLA-A, B, C, DRB1/3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1eDQA1

Reagente Volume/campione/locus Volume/96campioni/locusMastermixdafase1 19,6μL 1999,2μLTaqpolimerasi 0,4μL 40,8μLTotale 20μL 2040μL

MastermixpiùTaqpolimerasi:HLA-DQB1serie3

Reagente Volume/campione/locus Volume/96campioni/locusMastermixdafase1 19,2μL 1958,4μLTaqpolimerasi 0,8μL 81,6μLTotale 20μL 2040μL

2.2 –AgitaremediantevortexperbrevetempoecentrifugaretuttelemastermixconleTaqpolimerasi. Pipettare 20 μL di ciascuna master mix con le Taq polimerasi nelle singoleposizionidellepiastrePCRa96pozzetti.

Nota:LeamplificazionidiclasseIeclasseIIsonostateottimizzateutilizzandodueprogrammi di PCR differenti, quindi le master mix di classe I e classe II nondovrannoesserepostenellastessapiastra.

2.3 –Aggiungere5μLdiciascungDNAdiluitonelpozzettoappropriatodellepiastrepreparatenellafaseprecedente.Miscelaremediantepipettamento.Sigillareconunapellicolatermicaeispezionarevisivamenteciascunpozzetto.Centrifugaretuttelepiastreperamplificazioneinunacentrifuga.

2.4 –PosizionarelepiastreperamplificazioneneltermociclatoreedavviareiprogrammiperamplificazionediclasseIeclasseIIcomeindicatonelletabelleriportatesotto:

AmplificazioneclasseI(HLA-A,BeC)

Numerodicicli Temperatura Tempo1 95°C 3minuti

3595°C 15secondi65°C 30secondi68°C 5minuti

1 68°C 10minuti1 4°C ∞


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AmplificazioneclasseII(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1eDQB1)

Numerodicicli Temperatura Tempo1 95°C 3minuti

3593°C 15secondi60°C 30secondi68°C 9minuti

1 68°C 10minuti1 4°C ∞

Nota:Verificareilbuonesitodell'amplificazionefacendocorrere2μLdiciascunampliconeinungeldiagarosiostandardal2%a250Vper30minuti.(Opzionale)

Dimensioniprevisteampliconi

LocusHLA Dimensioniprevisteampliconi(kb)HLA-A,BeC ~3

HLA-DRB1/DRB3 ~4,3HLA-DRB4 ~4,2HLA-DRB5 ~4,2HLA-DPA1 ~5,7HLA-DPB1 ~6,7HLA-DQA1 ~6

HLA-DQB(serie3) ~6,6

È possibile interrompere lametodica inmodo sicuro un questa fase. Gli ampliconipossonoessereconservatia4°Cperunanotteoa-20°Cperpiùtempo.


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Fase 3 – Quantificazione e normalizzazione ampliconi(utilizzandounfluorimetroperpiastre)Durata:~2oreSi raccomanda di eseguire la quantificazione e normalizzazione ampliconi per garantire laprecisione della quantità di materiale di partenza nelle fase di preparazione della libreria(opzionale).LaconcentrazionedegliampliconivienemisuratautilizzandoilsistemaQuantiFluordsDNA,checontieneuncolorantefluorescenteingradodilegarsialDNAedunostandarddiDNAperlaquantificazioneprecisadipiccolequantitàdiDNAadoppiofilamento(dsDNA).PeristruzionisucomeeffettuarelaquantificazionediampliconiutilizzandounostrumentoperqPCRconsultarel'Appendice2.

Suggerimento–Benchélaquantificazioneampliconisiaraccomandata,essanonè necessaria per completare con successo il protocollo Holotype HLA. Lanormalizzazioneampliconinonrichiedeunamisuraprecisadellaconcentrazionedegli ampliconi. In alternativa, potete utilizzare una stima delle concentrazionidegli ampliconi basata sull’esperienza o sull’elettroforesi su gel di agarosio. Laquantificazione ampliconi rappresenta una fase importante di controllo dellaqualità e non deve essere omessa se non si ha sufficiente esperienza con ilprotocollocompletoHolotypeHLA.


PiastraamplificazioneclasseI 4°C Fase2PiastraamplificazioneclasseII 4°C Fase2StandarddiLambdaDNA(100ng/μL) 4°C PromegaColoranteQuantiFluordsDNA(200×) 4°C PromegaTamponeTE20×(pH7,5) 4°C PromegaH2Operusoinbiologiamolecolare 20°C-25°C UtilizzatoreExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix


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Protocollo3.1 –PreparareglistandarddiDNAmediantediluizioneserialedellostandarddiLambdaDNA

(100ng/μL)fornitonelkitQuantiFluorsecondolatabelladidiluizioneriportatasotto:

Etichettasullaprovetta

DNAdipartenza

Vol.diDNA(μL)

Vol.diTE1x(μL) Conc.finale(ng/μL)

Standard1 LambdaDNA 7,5μL 492,5μL 1,5ng/μLStandard2 Standard1 250μL 250μL 0,75ng/μLStandard3 Standard2 250μL 250μL 0,38ng/μLStandard4 Standard3 250μL 250μL 0,19ng/μLStandard5 Standard4 250μL 250μL 0,09ng/μLStandard6 Standard5 250μL 250μL 0,05ng/μLBianco Bianco 0μL 250μL 0ng/μL

3.2 – Preparare le piastre per quantificazione ampliconi (vedere figure supplementari).Aggiungerealiquotedi99μLdi tamponeTE1×a ciascunpozzettodellapiastraotticaa96pozzettiperilnumerototalediampliconidaquantificare.

3.3 – Aggiungere 1 μL di amplicone di ciascun pozzetto delle piastre ampliconi ai pozzetticorrispondentidellepiastreperquantificazioneampliconi.Miscelaremediantepipettamento.

3.4 –PreparareunasoluzionedilavorodiQuantiFluorDye1×utilizzandolaformulaseguente:0,5 μL di QuantiFluor Dye (200X) + 99,5 μL di tampone TE 1×. Preparare sufficienteQuantiFluorDye1×affinchéciascuncampione(dituttiquellinellepiastreampliconi)estandard(intotale14)ricevaun'aliquotaparia100μL.

3.5 – Preparare una piastra per quantificazione standard e piastre per quantificazioneampliconi.Aggiungerealiquotedi100μLdisoluzionedilavorodiQuantiFluorDye1×nellevarie posizioni delle piastre ottiche a 96 pozzetti che si useranno come piastraquantificazionestandardeallepiastrequantificazioneampliconipreparatenellafase3.2.

3.6 – Utilizzando gli standard preparati sopra, aggiungere 100 μL di ciascuno standard, induplicato,apozzettiindividualinellapiastraquantificazionestandard(totale14pozzetti).Miscelaremediantepipettamento.

3.7 –Miscelareagitandoaccuratamentemediantevortexecentrifugare.

3.8 –Effettuarelaletturadellapiastraquantificazionestandardedellepiastrequantificazioneampliconisulfluorimetro.

3.9 – Calcolare la concentrazione di DNAnelle piastre quantificazione ampliconi utilizzandoi valori di RFU letti. Fare riferimento alla tabella diluizione nel workbook fornito perassistenzaneicalcoli.


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3.10 –DiluireilDNAnellepiastreampliconiconH2OperusoinbiologiamolecolareinmodochelaconcentrazionefinalediDNAsiaapprossimativamenteparia67ng/μL.

§ SelaconcentrazionediDNAè150ng/μLomaggiore:aggiungere25μLdiH2O§ SelaconcentrazionediDNAè100-150ng/μL:aggiungere10μLdiH2O§ SelaconcentrazionediDNAèminoredi100ng/μL:nonaggiungereH2O.

Combinazioneampliconi3.11 –Combinaretutti i lociperciascuncampione inun'unicapiastraampliconi.Combinare i

volumiindicatidaciascunlocusperottenereunvolumefinaledi35μLsecondolatabellariportatasotto:

LocusHLA VolumecombinatoA 3,5μLB 3,5μLC 3,5μL

DRB1/DRB3 3,5μLDRB4 3,5μLDRB5 3,5μLDPA1 3,5μLDPB1 3,5μLDQA1 3,5μL

DQB1serie3 3,5μL

3.12 – Aggiungere 4 μL di ExoSAP-iT Express in ciascuna libreria campioni. Sciacquare beneipuntalipipettandosuegiù.Sigillarelapiastraconunapellicolatermicaecentrifugare.

3.13 –Posizionarelepiastreampliconiinuntermociclatoreedeseguireilseguenteprogramma:

PurificazionePCRExoSAP-ITExpress

Numerodicicli Temperatura Tempo1 37°C 4minuti1 80°C 1minuto1 4°C ∞

È possibile interrompere lametodica inmodo sicuro un questa fase. Gli ampliconipossonoessereconservatia4°Cperunanotteoa-20°Cperpiùtempo.


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Fase4–PreparazionelibreriaDurata:~3oreDurantequestafase,gliampliconicombinativengonopreparatiperilsequenziamentosuIlluminaMiSeq. Gli ampliconi vengono frammentati per via enzimatica, le estremità vengono riparateeadenilate,egliadattatoriindicizzativengonoligatialleestremità.Successivamente,lelibrerievengonocombinateesottoposteadun'unicafasedipurificazioneeconcentrazioneutilizzandobiglieAMPureXP.

Nota:Omixonraccomandavolumimaggioridiquellinecessariper96campioniinquantomoltideglienzimietamponisonoviscosiesirischiaun’eccessivaperditadimaterialenelcorsodeipipettamenti.


Piastraampliconicombinati 4°C Fase3Enz.framment.(A) -20°C OmixonTamponeFfamment.(B) -20°C OmixonEnz.Riparaz.Estrem.(C) -20°C OmixonTamp.Riparaz.Estr.(D) -20°C OmixonEnz.ligazione(E) -20°C OmixonTamp.ligazione(F) -20°C OmixonPiastraadattatori -20°C OmixonBiglieAMPureXP 4°C BeckmanCoulterEtanoloall’80%(fresco) 20°C-25°C UtilizzatoreH2Operusoinbiologiamolecolare 20°C-25°C Utilizzatore

Protocollo4.1 –Accendereiltermociclatore.Verificarecheilcoperchioriscaldatosistiariscaldando.

Nota: Accertarsi di agitare accuratamente mediante vortex l’enzima diframmentazione(A)primadell’uso.

4.2 –Preparareilmastermixperframmentazionesecondolatabellasotto:


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Mastermixframmentazione

Reagente Volumeperlibreria(μL)

Volumiraccomandatiper96librerie(μL) Codif.colore

Enz.framment.(A) 2μL 220,8μL GialloTamponeFfamment.(B) 2μL 220,8μL RossoVolumetotale 4μL 441,6μL

4.3 –Preparareunapiastra reagenti: porreunanuovapiastraPCRa96pozzetti suun rackrefrigeranteperPCReaggiungerelastessaquantitàdellemastermixperframmentazioneaciascunpozzettodiun’unicacolonna.

Nota:LareazionediframmentazioneèstatastudiatapergarantireDNAdilunghezzaidealeper il sequenziamento su IlluminaMiSeq.È importantemantenere i reagentifreddi fino a che la reazione viene avviata nel termociclatore per prevenire unaframmentazioneeccessiva.Si raccomanda l’usodipipettemulticanaleperridurrealminimoleprobabilitàchesiverifichiunaframmentazioneeccessiva.

4.4 –Centrifugare lapiastraampliconicombinatiper10secondieporlasughiaccioosuunbloccorefrigerato.

4.5 –Preparareunapiastradireazione:porreunapiastraPCRa96pozzettinuovasuunbloccorefrigerato.

4.6 –Aggiungere4μLdimastermixperframmentazionedallapiastrareagentiaipozzettidellapiastradireazionecorrispondentiaicampioninellapiastraampliconicombinati.Siraccomandal’usodiunapipettamulticanale.

4.7 – Trasferire 16 μL di ciascun amplicone dalla piastra ampliconi combinati al pozzettocorrispondente sulla piastra di reazione utilizzando una pipetta multicanale. Miscelaremediantepipettamento.

4.8 –Coprirelapiastradireazioneconunapellicolatermicaecentrifugareper10secondi.

4.9 –Incubarelapiastradireazioneinuntermociclatoreconilseguenteprogramma:

Programmaframmentazione

Numerodicicli Temperatura Tempo1 37°C 10minuti1 70°C 15minuti1 4°C ∞

Èpossibileinterromperelametodicainmodosicurounquestafase.Lelibreriepossonoessereconservatea4°Cperunanotteoa-20°Cperpiùtempo.

4.10 –Prepararelamastermixperlariparazioneestremitàsecondolatabellariportatasotto:


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Mastermixriparazioneestremità

Reagente Volumeperlibreria(μL)

Volumiraccomandatiper96librerie(μL) Codif.colore

H2Operusoinbiologiamolecolare 1,25μL 139,2μL Enz.Riparaz.Estrem.(C) 1,25μL 139,2μL VerdeTamp.Riparaz.Estr.(D) 2,5μL 278,4μL ArancioVolumetotale 5μL μL

4.11 – Aggiungere aliquote di master mix per riparazione estremità in una unica colonnainutilizzatadellapiastrareagenti.

4.12 –Centrifugarelapiastradireazione(contenenteicampioniframmentati)per10secondi.Aggiungere5μLdimastermixperriparazioneestremitàdallapiastrareagenti inciascunpozzettodellapiastradireazione.Siraccomandal’usodiunapipettamulticanale.Miscelaremediantepipettamento.


4.14 –Incubarelapiastradireazioneinuntermociclatoreconilseguenteprogramma:

Programmariparazioneestremità



4.15 – Prelevare la piastra adattatori indicizzati dal luogo di conservazione e far scongelarea temperatura ambiente subito dopo l'avvio del programma riparazione estremità neltermociclatore.Quandolapiastraadattatorièatemperaturaambiente,centrifugarlaper3minutia3000giri/minuto.

4.16 –Staccareconcautelalapellicolasigillantedallapiastraadattatori.Dopoaverrimossolapellicolasigillante,nonagitarelapiastraadattatoriperevitarecontaminazioniincrociate.

4.17 –Trasferirel'interovolumediciascunpozzettodallapiastradireazione(25μL)nelpozzettocorrispondentenellapiastraadattatori.


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Nota: Se NON si prevede di utilizzare l'intera piastra adattatori, è possibileutilizzaresoltantoilnumeronecessariodiadattatori.Tagliarelapellicolasigillantedellapiastra tra i pozzetti dautilizzaree i pozzetti da conservare. Staccare concautela la pellicola sigillante dalla piastra adattatori, lasciando la pellicola inposizionesuipozzettidaconservare.

a. Trasferire25μLdaciascuncampionesottopostoariparazionedelleestremitàdella piastra di reazione a un pozzetto nella piastra adattatori, miscelandoaccuratamenteconunapipetta.

b. Trasferire la totalitàdi ciascuncampionedallapiastraadattatorinelpozzettooriginaledellapiastradireazione.

c. Sigillarenuovamentelapiastraadattatorieriportarlaa-20°C.Pereseguirelefasiresiduedescrittenelmanuale,utilizzarelapiastradireazionealpostodellapiastraadattatori.

4.18 –Prepararelamastermixperligazione.Prepararemastermixperligazionesufficienteperciascuncampione.

Mastermixligazione

Reagente Volume(μL) Volumiraccomandatiper96librerie(μL) Codif.colore

Enz.ligazione(E) 2,5μL 252,5μL BluTamp.ligazione(F) 30μL 3030μL NeroVolumetotale 32,5 3282,5μL

4.19 – Pipettare la master mix ligazione in 3 colonne inutilizzate della piastra reagenti. Siraccomandal’usodiunapipettamulticanale.

4.20 –Aggiungere32,5μLdimastermixligazioneinciascunpozzettodellapiastradireazione.Siraccomandal’usodiunapipettamulticanale.Miscelaremediantepipettamento.


4.22 –Incubarelapiastradireazioneneltermociclatoreconilseguenteprogramma:

Programmaligazione




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Combinazioneepurificazionelibreria4.23 –AttenderechelebiglieAMPureXPraggiunganolatemperaturaambiente.Accertarsiche

essesianoomogenee(assenzadigrumioagglomerati).Preparare5mLfreschidietanoloall'80%(4mLdiEtOH+1mLdiH2O).

4.24 – Creare la libreria combinando un'aliquota da ciascun amplicone combinato, cioè unalibreriacampione-specifica,inun’unicaprovettapermicrocentrifugalow-bindda2,0mL.

a. Per 16 o più campioni – Calcolare la quantità di ciascuna libreria campione dacombinareinsiemeinuna libreriasingoladivolumetotaleparia900μL.Dividerei900 μL per il numero di librerie campione. Questo è il volume dell'aliquota daprelevaredaciascunalibreriacampioneedapipettarenellalibreria.

b. Permeno di 16 campioni – Trasferire 60 μL di ciascuna libreria campione in unalibreria.

4.25 –Aggiungere900μLdibiglieAMPureXPnellaprovettadella libreria.Miscelarea fondoagitandotramitevortexecentrifugarebrevemente.Nonfarsepararelebiglie.Incubarelalibreriaper10minutiatemperaturaambiente.

Nota:Senelpoolfinalevisonomenodi900μLdilibreria,aggiungereunaquantitàequivalentedi biglieAMPureXP. Il rapporto trapool finaleebiglieAMPureXPdovràessereparia1:1.

4.26 –Inserirelaprovettadellalibreriasuunsupportomagneticoeincubareper10minuti.

4.27 – Lasciando bloccata la provetta sul supporto magnetico, rimuovere con cautela edeliminareilsurnatante,facendoattenzioneanontoccarelebiglie.

4.28 –Lasciandobloccatalaprovettasulsupportomagnetico,aggiungere~1,5–2mLfreschidietanolo all'80% alla provetta della libreria. Il volume di etanolo aggiunto dovrà esseresufficienteacoprirelebiglie.

Nota:Aggiungerel'etanolofacendolocaderesullatodellaprovettaoppostoaquellodovesisonodepositatelebiglie.

4.29 – Incubare la provetta della libreria a temperatura ambiente per 30 secondi; quindirimuovereconcautelaedeliminareilsurnatante.

4.30 –Ripeterelefasi4.28e4.29.

4.31 –Centrifugarebrevemente laprovettadella libreriaerimetterlasulsupportomagneticoconilcoperchioaperto.Eliminarel'etanoloresiduoconunapipetta.Nontoccarelebiglie.


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Nota:Accertarsicheilpelletdibiglienoncontengaetanoloresiduo.Atalescopo,puòessered’aiuto ruotare laprovetta suun supportomagneticopereliminarel'etanolosenzaagitareilpelletdibiglie.

4.32 –Farasciugareall'arialebiglieper5-8minutisulsupportomagnetico,finoacheilpelletdibiglieèasciutto.

4.33 –Rimuoverelaprovettadellalibreriadalsupportomagneticoedeluirecon31μLdiacquaperusoinbiologiamolecolare.Nontoccarelebiglieconilpuntaledellapipetta,altrimentivirimangonoattaccate.

4.34 –Agitaremediante vortex la libreriaper risospendere completamente lebiglie. Se sulleparetilateralirimangonodellegoccioline,centrifugareperqualchesecondo.Accertarsichelebiglierimanganoinsospensione.

4.35 –Incubarelalibreriaatemperaturaambienteper2minuti.

4.36 –Inserirelaprovettadellalibreriasulsupportomagneticoper2minuti.

4.37 – Raccogliere la libreria: mantenendo la provetta della libreria finale nel supportomagnetico,trasferire31μLdelsurnatanteinunanuovamicroprovettalow-bindda1,5ml.

Èpossibileinterromperelametodicainmodosicurounquestafase.Lelibreriepossonoessereconservatea-20°Cperperiodiditempoprolungati.


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Fase5–SceltadelledimensionidellalibreriaDurata:~1oraLafase5procedeallasceltadelledimensionidellalibreriaprovenientedallaFase4utilizzandoilsistemaPippinPrep.IlPippinPreppuòselezionareautomaticamenteunagammadidimensionidiframmentidiDNAedeluirliinunacameradiraccolta.Nota:AlpostodelPippinPrepèpossibileutilizzareilBluePippin.Consultarel'Appendice1perleistruzionid'usodelPippinPrep.


Cassettageld’agarosioall’1,5%,senzacolorante 20°C-25°C SageScienceMiscelasoluz.caricam./marcatore(K)Pippin 4°C SageScienceLibreriacombinata 4°C Fase4

Nota:IlmarcatoreKvausatoconilPippinPrep.IlBluePippinusailmarcatoreR2.

Protocollo5.1 –PortarelasoluzionedicaricamentoconmarcatoreKatemperaturaambiente.

5.2 –Combinare31μLdelpoolcon10μLdisoluzionedicaricamentoconmarcatoreK.

5.3 –Agitaremediantevortexecentrifugare.

5.4 –ImpostareilsistemaPippinPrepperraccogliereframmentidiDNAtra650e1300bps.Caricareilcampioneda40μLnellaportacampioneeavviarelacorsa.Laduratadellacorsaèdi45-50minuti.

5.5 –Raccoglierel'interocontenuto(circa40μL)dallaportadieluizionedelPippinPrepetrasferirloin una nuova microprovetta low-bind da 1,5 ml. Questa è la libreria con frammentiselezionatiperdimensione.

Èpossibileinterromperelametodicainmodosicurounquestafase.Lelibreriepossonoessereconservatea-20°Cperperiodiditempoprolungati.


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Fase6–QuantificazionedellalibreriaconunostrumentoqPCRDurata:~1orae15minutiÈnecessarioquantificare la libreriasottopostaaselezionedimensionalepergarantire risultatiottimali con il sequenziatore Illumina MiSeq. La concentrazione della libreria coi frammentiselezionatipuòessereaccuratamentemisuratamedianteqPCR.Opzionalmente,èpossibileusare ilkitQubitdsDNABReunamacchinaQubitpermisurare laconcentrazionedellalibreria.Pertaleprotocollo,vederel’Appendice3.


PrimerPremixIllumina10× -20°C KAPABiosystemsMastermixKAPASYBRFASTqPCR2× -20°C KAPABiosystemsStd1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsStandardDNAIllumina -20°C KAPABiosystemsH2Operusoinbiologiamolecolare 20°C-25°C UtilizzatoreTamponeTE1×(pH8,0) 20°C-25°C UtilizzatoreLibreriaconframmentiselezionati 4°C Fase5

Protocollo1 –PrepararelaPrimerMixqPCRutilizzandoilPrimerPremixIllumina10×elaMasterMix

KAPASYBRFASTqPCR2×:

Nota: IreagentidelkitKAPASYBRFASTqPCR(MasterMixqPCR,PrimerPremixe soluzioni ROX) vengono combinati quando si utilizza il kit per la prima volta.Questa soluzione combinata è stabile per almeno 30 cicli di congelamento/scongelamento. Consultare la documentazione KAPA per determinare seèraccomandatalaROXperlostrumentoqPCRindotazione.

PrimermixqPCR

Reagente Volume(mL)PrimerPremixIllumina10× 1mLMastermixKAPASYBRFASTqPCR2× 5mLVolumetotale 6mL


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2 –PrepararelamastermixqPCR.

MastermixqPCR

Reagente Volume(μL)PrimermixqPCR 228μLH2Operusoinbiologiamolecolare 76μLVolumetotale 304μL

3 –Preparareunadiluizioneserialedellalibreriaconframmentiselezionati.

a. Preparareunadiluizione1:1000aggiungendo1μLdiLibreriaconframmentiselezionatia 999 μL di tampone TE 1× (pH 8,0), sciacquando accuratamente il puntale dellapipetta.Agitaremediantevortexecentrifugare.

b. Preparareunadiluizione1:2000aggiungendo100μLdelladiluizione1:1000a100μLditampone1×TE(pH8,0).Agitaremediantevortexecentrifugare.

4 –PreparareunapiastraperquantificazioneqPCRutilizzandounanuovapiastracompatibileconilsistemaqPCRindotazione.

5 –Pipettare16μLdiMasterMixqPCRintriplicatoperglistandard1-4,ladiluizione1:1000eladiluizione1:2000(vederefiguresupplementari).

6 – Aggiungere aliquote di 4 μL di standard 1-4, diluizione 1:1000 e diluizione 1:2000 aipozzetticorrispondenti.

7 –SigillarelapiastraquantificazioneqPCRecentrifugarlaper10secondi.

Nota:EvitarediformarebolleneipozzettidellapiastraquantificazioneqPCR.Senecessario,centrifugarepereliminarelebolle.

8 Impostare i triplicatidi1:1000e1:2000comecampionibersaglioedefiniregli standard(punti:4,concentrazioniiniziali:20pM,diluizione:1:10).Perdeterminarelaconcentrazionedi DNA della libreria con frammenti selezionati, avviare il seguente programma sullamacchinaqPCR:

Numerodicicli Temperatura Tempo1 95°C 5minuti25

(nocurvadimelting)95°C 30secondi60°C 90secondi(acquisizionedeidati)

9 –PerconvertireilrisultatoottenutodallaqPCRdaunaconcentrazioneinpManM,inserirei risultati in “Media quantità” dei due replicati della libreria nella schedadelWorkbookOmixondenominata“Quantificazionelibreria”.

10 – Usando i volumi indicati nel workbook, diluire 10 μL della libreria con frammentiselezionatifinoaunaconcentrazionedi2nMconH2Osterileinunanuovamicroprovettalow-bindda1,5mL.Conservarea-20°Clarestantelibreriaconframmentiselezionati.


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Èpossibileinterromperelametodicainmodosicurounquestafase.Lelibreriepossonoessereconservatea-20°Cperperiodiditempoprolungati.Incasodiconservazioneper periodi prolungati, si raccomanda vivamentedi effettuareuna riquantificazionedellalibreriaprimadicaricarlasuMiSeq.


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Fase7–SequenziamentosuIlluminaMiSeqDurata:~24-40oreIlluminaMiSeqèunostrumentoperNGSautomatizzatoingradodisequenziarela libreriaconframmentiselezionatipreparatanellefasiprecedenti.Alterminedellacorsadisequenziamentovieneeffettuatoautomaticamenteildemultiplexingdeicampioniindicizzati.

Suggerimento–PermonitorarelareazionedisequenziamentopoteteaggiungerePhiXall'1%comecontrolloaddizionale.ConsultareladocumentazioneIlluminasulcontrolloPhiXperulterioriinformazioni.


Cartucciareagenti -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaCellaaflussoMiSeq 4°C IlluminaLibreriaa2nM 4°C Fase6NaOH1No2N 20°C-25°C UtilizzatoreH2Operusoinbiologiamolecolare 20°C-25°C Utilizzatore

CapacitàKitReagentiMiSeq

KitreagentiIlluminaMiSeq

TempoOre

Campioni96/7


~39 96


~24 96

Micro300Cycle(MS-103-1002)

~19 28


~28 12


~17 6

Protocollo7.1 –PreparareilMiSeqsecondoiprotocollistandardIllumina.


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7.2 –Preparareunalibreriadenaturata1nM:Combinare10μLfreschidiNaOH0,2Ne10μLdellalibreriaconframmentiselezionatidiluitaa2nMinunanuovamicroprovettalow-bindda1,5mL.Agitaremediantevortexecentrifugare.Incubarequestalibreriadenaturata1nMatemperaturaambienteper5minuti.

7.3 –Preparareunalibreriadenaturata20pM:Aggiungere980μLdiHT1refrigeratoai20μLdellalibreriadenaturata1nM.Agitaremediantevortexecentrifugare.

7.4 –Preparareunalibreriadenaturata9pM:Aggiungere550μLdiHT1refrigeratoe450μLdellalibreriadenaturata20pMaunamicroprovettalow-bindda1,5mL.Agitaremediantevortexecentrifugare.

7.5 – Trasferire 600 μL della libreria denaturata 9 pM nella posizione di caricamento dellacartucciareagentiMiSeq.

Suggerimento–SiconsigliadiutilizzareilworkbookfornitopercreareilfogliocampionirichiestoperilMiseq.


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Fase8–AnalisidatidisequenziamentoHLAIlluminaMiSeqprocessalalibreriacombinata9pMegeneradatidisequenziamentonellaformadi file fastq. Consultare il Manuale HLA Twin per l'installazione corretta di HLA Twin e perinformazionisull'interpretazionedell'analisidigenotipizzazionedeidatidisequenziamento.Peraiutonellaconfigurazionedelprotocolloautomatizzatoedomandecircal'installazioneol'analisideidati,[email protected].

Protocolloautomatizzato

InstallazioneITeconfigurazione1. InstallareHLATwinServersulserver.

§ InstallareHLATwinClientsuunPCclient.AlserversipossonocollegarepiùclientHLATwin.§ Contattare l’assistenzaOmixon ([email protected])per istruzioni circa l’installazione

delprotocolloautomatizzato.

Protocolloperanalisi1. LanciareHLATwinClientedeffettuareillogin.

2. Idatisonostatigiàelaboratiosonoinfasedielaborazione.RiesaminareirisultatiutilizzandoilsistemaasemaforoinHLATwin.

3. Esportareirisultatidigenotipizzazionee/olesequenzediconsenso,comerichiesto.

Protocolloservermanuale

InstallazioneITeconfigurazione§ InstallareHLATwinServersulserver.§ InstallareHLATwinClientsuunPCclient.

Protocolloperanalisi§ LanciareHLATwinClientedeffettuareillogin.§ SelezionareidatiMiSeqinformatofastqofastq.gzeavviarel’interpretazionedeidaticon

HolotypeHLA.§ Al termine della tipizzazione Holotype HLA, riesaminare i risultati utilizzando il sistema

asemaforoinHLATwin.§ Esportareirisultatidigenotipizzazionee/olesequenzediconsenso,comerichiesto.

Protocollodesktopmanuale

InstallazioneITeconfigurazione§ InstallareDesktopHLATwin.


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Protocolloperanalisi6 LanciareHLATwineeffettuareillogin.

7 SelezionareidatiMiSeqinformatofastqofastq.gzeavviarel’interpretazionedeidaticonHolotypeHLA.

8 Al termine della tipizzazione Holotype HLA, riesaminare i risultati utilizzando il sistemaasemaforoinHLATwin.

9 Esportareirisultatidigenotipizzazionee/olesequenzediconsenso,comerichiesto.


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Figuresupplementari

Esempiodischemaperpiastraampliconi,piastraamplificazione,piastradiluizione,piastraquantificazioneampliconi(perunlocusindividuale)epiastrareazione

Esempiodipiastraquantificazionestandard


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EsempiodipiastraperquantificazionelibreriaconqPCRKAPA


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Appendice1:PippinPrep

ProgrammazionePippinPrep1. Cliccaresullascheda“ProtocolEditor”ecliccaresulpulsante“New”.

2. Cliccaresull'iconacartellaafiancodelcampoCassetteeselezionare“1.5%DFMarkerK”perilPippinPrepo“1.5%DFMarkerR2”perilBluePippin.

3. Nellalaneprevistaperlacorsa:

a. Evidenziareilcampo“Range”.b. In“RefLane”impostareilnumerodilaneincuisiprocederàallaseparazione.c. Impostareilcampo“Start*”a650.d. Impostareilcampo“End*”a1300.

4. Nelcampo“ReferenceLane”,selezionarelalaneincuisiprocederàallaseparazione.

5. Cliccaresulpulsante“SaveAs”eassegnareunnomealprogramma.

EsecuzionediunacorsasuPippinPrep1. AccendereilPippinPrepconilpulsantepostosulretrodeldispositivo.

2. ControllarevisivamenteilPippinPrep.Accertarsichei5LEDsianoaccesiechel'internodeldispositivosiapulitoeasciutto.

3. Cliccare sul logo Sage Science in basso a destra su schermo. Inserire una password. Lapassworddidefaultè“pips”.

4. Cliccaresullascheda“FactorySetup”verificandocheilvaloredi“Base-to-Threshold”sia0.02.

5. InserireildispositivodicalibrazionenelPippinPrep,accertandosichelastrisciascurasiarivoltaversoilbassoecopraiLED.

6. NellabarraMain,cliccaresulpulsante“Calibration”.

7. Nellafinestra“Calibration”,verificarecheilcampo“TargetIpHmA”siaimpostatoa0.80(0.60perBluePippin),quindipremereilpulsante“Calibrate”.

8. Andareallascheda“Protocols”.Cliccaresulpulsante“Load”eselezionareilprogrammaperHolotypeHLAelalanespecificachesiintendeutilizzare.Accertarsiche:

a. Lalanecorrettasiaaccesa.b. L’indicatorediselezione“Broadspectrum”siaacceso.c. Lalanediriferimentosialastessasullaqualesiintendeeseguireilprogramma.

9. Andareallascheda“Main”.Accertarsiche:

a. Ilprogrammacheavetecaricatoèquelloselezionato.b. Lalanediriferimentoappropriatasiaselezionataesiaanchelastessaincuicorreràil

campione.


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10. Ispezionarelacassetta.Primadirimuoverelapellicolasigillantedaipozzetti,osservarepervedere se dietro la porta di eluizione sono presenti delle bolle. Se vi sono delle bolle,picchiettaredelicatamenteeruotarelacassettatralemaniperfarlefuoriuscire.

11. Inserirelacassetta,conlapellicolaancoraacoprireipozzetti,nelPippinPrep.

12. Staccareconcura lapellicola, accertandosidi rimuovere lapellicoladal latopulitodellacassetta(lane5)aquelloeventualmentegiàusato(lane1).Perevitarecontaminazioni,fareattenzioneanonspargeredelliquidonelrimuoverelapellicola.

13. Rimuovere l'intero volumedi tamponedallaportadi eluizionedella lane che si intendeutilizzareeaggiungere40μLditamponeperelettroforesifresconellastessaporta.

14. Coprireconunastrisciasottiledipellicolaleportedieluizione.

15. Sequalcheserbatoioèpienopermenodi3/4delvolumevarabboccatocontamponeperelettroforesi. Non riempire eccessivamente i pozzetti. Il livello del tampone deveraggiungereappenalaplastica,perimpedirefuoriuscitequandosichiuderàilcoperchiodelPippinPrep.Aggiungeretamponepartendodaipozzettipulitifinoaquelliusati(dalane5alane1).

16. Accertarsicheciascunodeipozzettidicaricamento(diagarosio)sianoriempiticontamponeperelettroforesi.Illivellodeltamponedovràessere“appena”sopral'agarosio,edapparirecompletamentepiatto.

17. Chiudere lentamente il Pippin Prep, accertarsi che il tampone non tocchi il coperchioquandosichiudeildispositivo.

18. Eseguireiltestdicontinuità.Quandoisensorisiseccanoleggermente,ècomunecheiltestdicontinuitàpossafallireunavolta.Sefallisce,eseguireiltestancoraunavolta.Unavoltacompletatoiltestdicontinuità,aprirelentamenteilPippin.AccertarsicheilcoperchiodelPippinPrepnonabbiatrascinatofluidoattraversolacassetta.

19. Agitare mediante vortex brevemente la soluzione di caricamento con marcatore Kecentrifugarla.Aggiungere10μLdisoluzionedicaricamentoconmarcatoreKai~30μLdilibreria.

20. Agitaremediantevortexlalibreriabrevementeecentrifugarla.

21. Rimuovere40μLditamponedalpozzettoconilcampionechesiintendeutilizzare.

22. Aggiungere~40μLdilibreriaconmarcatoreKalpozzettoconilcampionedautilizzare.

23. Contrassegnarelalanechesistautilizzandoconleinizialideltecnicoeladata.

24. ChiudereilPippinPrepecliccaresulpulsante“Start”.Accertarsichelalaneappropriatasiastataattivata.Ilcampionedevecorrerepercirca45minuti.

25. Al terminedel programma, aprire con cautela il PippinPrep.Controllare se il coperchiotrascinadelliquidolungolacassetta.

26. Toglierelapellicolasulleportedieluizione,facendoattenzioneanontoccareilliquido.


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27. Trasferiretuttoilvolumedallaportaeluizioneinunanuovaprovettalow-bindda1,5ml.

28. Coprireipozzettiaperticonduepezzidipellicolasigillante.Lasciareunalinguettasullatopulito.Questofaciliteràlarimozionedellapellicoladallatopulitodautilizzare.

29. Inserirelacassettasigillatanelsuoblisteremetterladaparte.

30. Prendere la cassettadi lavaggioe riempirla conacquaMilliQ.Chiuderedelicatamente ilcoperchiodelPippinPrep,controllaresedelliquidoèstatotrascinatolungolacassettadilavaggio.

32. LasciareilPippinPrepchiusoperqualchesecondo.

33. Aprire il Pippin Prep, controllare se del liquido è stato trascinato lungo la cassetta dilavaggio.

34. Rimuoverelacassettadilavaggio,svuotarlaelasciarlaasciugare.

35. AsciugareilPippinPrepechiuderlodelicatamente.

36. Selezionareilpulsante“ShutDown”nelmenuPippinPrep.


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Appendice2:QuantificazioneampliconiutilizzandounostrumentoperqPCRDurata:2ore


TamponeTE20×(pH7,5) 4°C PromegaStandarddiLambdaDNA(100ng/μL) 4°C PromegaColorantedsDNAQuantiFluor200× 4°C PromegaH2Osterile 20°C-25°C UtilizzatorePiastra(e)amplificazioneclasseI 4°C Fase2Piastra(e)amplificazioneclasseII 4°C Fase2

Protocollo2. Creareunadiluizioneserialeutilizzandomicroprovetteda1,5mLelostandarddiLambda

DNAQuantiFluor(100ng/μL).Consultarelatabelladidiluizioneriportatasotto:

Etichettasullaprovetta

DNAdipartenza

Vol.diDNA(μL)

Vol.diTE1x(μL)

Conc.finale(ng/μL)

Standard1 LambdaDNA 7,5μL 492,5μL 1,5ng/μLStandard2 Standard1 250μL 250μL 0,75ng/μLStandard3 Standard2 250μL 250μL 0,38ng/μLStandard4 Standard3 250μL 250μL 0,19ng/μLStandard5 Standard4 250μL 250μL 0,09ng/μLStandard6 Standard5 250μL 250μL 0,05ng/μLStandard7,bianco Bianco 0μL 250μL 0ng/μL

3. Prepararelepiastrediquantificazioneampliconi(vederefiguresupplementari).Aggiungerealiquotedi49,5μLditamponeTE1×aciascunpozzettodellapiastraa96pozzettiper ilnumerototalediampliconidaquantificare.

4. Aggiungere0,5μLdiampliconidallepiastreampliconiapozzettiindividualisullepiastrediquantificazioneampliconi.Miscelaremediantepipettamento.

5. PreparareunasoluzionedilavoroQuantiFluorDye1×utilizzandolaformulaseguente:0,25μLdiQuantiFluorDye(200X)+49,75μLditamponeTE1×.PrepararesufficienteQuantiFluorDye1× affinché ciascun campione (di tutti quelli nelle piastreAmpliconi) e standard (intotale14)ricevaun'aliquotaparia50μL.


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6. Preparare una piastra quantificazione standard e le piastre quantificazione ampliconi.Aggiungere aliquote di 50 μL di soluzione di lavoro di QuantiFluor Dye 1× nelle varieposizionidellepiastreottichea96pozzettiutilizzandoilformatodellapiastraquantificazionestandardedellepiastrequantificazioneampliconi(vederefiguresupplementari).

7. Utilizzandoglistandardpreparatisopra,aggiungere50μLdiciascunostandard,induplicato,apozzettiindividualidellapiastraquantificazionestandard(totale14pozzetti).

8. Miscelareaccuratamentetramitevortexecentrifugare.

9. InserireciascunapiastraquantificazionenellamacchinaperqPCRunaallavoltaedeseguireilseguenteprogramma:

Numerodicicli Temperatura Tempo1 25°C 10secondi

225°C 15secondi25°C 30secondi(acquisizionedati)

10. CalcolarelaconcentrazionediDNAnellepiastrequantificazioneampliconiutilizzandoidatiRFUgrezzigeneratidallostrumentoperqPCR.

11. DiluireilDNAnellepiastreampliconiconH2OsterileinmodochelaconcentrazionefinalediDNAsiaapprossimativamenteparia67ng/μL.

§ SelaconcentrazionediDNAè150ng/μLomaggiore:aggiungere25μLdiH2O§ SelaconcentrazionediDNAè100-150ng/μL:aggiungere10μLdiH2O§ SelaconcentrazionediDNAèminoredi100ng/μL:aggiungere0μLdiH2O.


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Appendice 3: Quantificazione librerie con un colorantefluorescenteintercalanteneldsDNADurata:~15minutiLaconcentrazionedella libreriacon frammenti selezionatipuòessereaccuratamentemisuratamedianteuncolorantefluorescenteintercalanteneldsDNA,comeSYBRgreenoequivalente.Ikiteidispositividisponibili incommercioatalescopoincludono,traglialtri, il lettoreQubitdellaThermo Fisher (utilizza il kit per saggi Qubit Broad Range dsDNA) e il lettore Quantum dellaPromega(utilizzailcolorantefluorescentedsDNAQuantiFluor).Poichéildispositivopiùutilizzatoè il Qubit, viene qui descritto il metodo previsto per tale dispositivo. Se si utilizzano altri kitedispositivi,seguireleistruzionidelfabbricante.

Nota: Questo metodo fluorimetrico per dsDNA determina rapidamenteeaccuratamentelaconcentrazionedellalibreriaconframmentiselezionatifinale.IlmetodomisuratuttoildsDNApresentenellalibreria.


KitpersaggiQubitdsDNABR temperaturaambiente ThermoFisherStandardQubitdsDNABR 4°C ThermoFisherLibreriaconframmentiselezionati 4°C Fase5

Protocollo6.1 –PortareglistandardQubitatemperaturaambiente.PreparareleprovetteQubit(500μL,

a parete sottile) per la libreria, in duplicato, e i due standard. Agitaremediante vortexecentrifugareglistandardelalibreria.

6.2 –Aggiungere995μLditamponee5μLdicoloranteinunaprovettapermicrocentrifugada1,5ml.Agitaremediantevortexecentrifugare.

6.3 –Trasferire190μLdalmixreagentialleprovetteQubitperiduestandard.Trasferire198μLdalmixreagentialledueprovetteQubitperiduplicatidellalibreria.

6.4 –Aggiungere10μLdallostandard1allaprovettaQubitcorrispondenteeagitaremediantevortexper2secondi.Ripetereperlostandard2.

6.5 –Aggiungere2μLdallalibreriaalleprovetteQubitcorrispondentieagitaremediantevortexper2secondi.

6.6 –IncubareleprovetteQubitatemperaturaambienteper2minuti.

6.7 –AccendereildispositivoQubiteselezionareilprotocolloBR.


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6.8 –InserirelaprovettaQubitconlostandard1neldispositivoepremereGO.Ripetereperlostandard2.

6.9 –InserirelaprovettadellalibrerianelQubitepremereGO.Ripetereperilreplicato.

6.10 –PerconvertireilrisultatoottenutodalQubitdaunaconcentrazioneinng/μLanM,inserirelaconcentrazionemediadeiduereplicatidellalibrerianellaschedadelWorkbookOmixondenominata“Quantificazionelibreria”.

6.11 – Utilizzando i risultati della misurazione con Qubit, diluire 10 μL della Libreria conframmenti selezionati fino a una concentrazione di 2 nM con H2O sterile in una nuovamicroprovettalow-bindda1,5mL.Conservarea-20°Clarestantelibreriaconframmentiselezionati.

Èpossibile interrompere lametodica inmodosicurounquesta fase. Le libreriepossonoessere conservate a -20 °Cperperiodi di tempoprolungati. In casodiconservazioneperperiodiprolungati,siraccomandavivamentedieffettuareunariquantificazionedellalibreriaprimadicaricarlasuMiSeq.

HOLOTYPE HLA™ 96/11 CONFIGURAZIONE A CE C B CE …CE+User+Manuals... · RACCOMANDAZIONE CIRCA...

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