Gli Gli SiRNASiRNA e loro uso e loro uso terapeutico contro il terapeutico contro il

cancro.cancro.

Nanotecnologia:

artefatti con proprietà emergenti

Prima generazionePrima generazione

Liposomi e particelle di

albumina

Seconda generazione

Particelle:

attive da sé

attivate da raggi attivate da raggi

ablazione termica

Terza generazioneTerza generazione

Farmaci multistadio

gli gli siRNAsiRNA

Small interfering RNA , conosciuti anche come “short interfering RNA”

o silencing RNA, sono piccolissimi RNA formati da 20-25 nucleotidi di

cui due alle estremità non appaiati.

Ad ogni estremità 5’ si trova il gruppo fosfato, alle 3’ il gruppo Ad ogni estremità 5’ si trova il gruppo fosfato, alle 3’ il gruppo

ossidrile.

Affinchè si possano formare è necessaria la presenza di :

�filamento di ds RNA o sh RNA

� DICER

� Proteine Argonaute

� complesso del RISC

formazione formazione siRNAsiRNA

Filamenti di RNA progenitori del siRNa che interagiranno col DICER.

Complesso enzimatico della famiglia delle RNA polimerasi III. E’ un endonucleasi specifico che,attaccandosi alla catena polinucleotidica, genera il siRNA

.

Complesso del silenziamentoIndotto.Esso riduce il siRNA in un singolo filamento.

Proteina Argonauta

processo di processo di silenziamentosilenziamento

STORIA degli siRNA

� 1998 scoperta siRNA

� 2000 ricerca ROCHE

� 2003 pubblicazione sul WALL STREETJOURNAL

� 2006 NOBEL FIRE e MELLO

� 2007 primo farmaco brevettato ROCHE

� 2008 pubblicazione su NATURE per l’uso nella

NANOTECNOLOGIA NANOTECNOLOGIA

SCOPERTA degli siRNA1998

Prima applicazione delle teorie su piante

di PETUNIA

Prima applicazione delle teorie su piante

di PETUNIA

Successivo esperimento su animali:

Mancata espressione di determinati geni

in Caenorhabditis elegans dopo essere stato trattato con i siRNA

(problemi al tessuto nervoso,cutaneo..etc)

Ricerca

�2000 start

�2003 wall street journal

�2007 brevettato farmaco “ALNYLAM”

Nobel 2006

FIRE MELLO

FIRE MELLO

Per la scoperta del fenomeno

del silenziamento genico

mediante l’ interferenza degli RNAi

MAURO FERRARIMAURO FERRARI

VETTORI AL SILICIO

Terapia non efficace:

•Difficile permeabilità•Tossicità

Soluzione: Soluzione:

“una mezza noce di cocco”

•veicolo multistadio•Completamente biodegradabile•Vogliono personalizzarlo a livello subcellulare!

MATERIALI E METODI

Western blot. • in questo studio tramite western blot si è usato un anticorpo primario antiEphA2 evidenziato con perossidasi coniugata ad IgG (Amersham) earricchito con un kit di che utilizza la chemiluminescensa potenziata (Pierce).• per confermare un uguale caricamento, le membrane sono state testate perla β-actina

MATERIALI E METODIMATERIALI E METODI

Fabbricazione di particelle siliciche e porose

Chimica di superficie di S1MP

Immunoistochimica.• Ki67 e frammenti di EphA2 sono stati ottenuti con formalina fissata esezioni di tumore (8-µm di grandezza) incorporate con paraffina.• Per la valutazione della proliferazione cellulare; quali indice di proliferazionesi è contato il numero di cellule Ki67-positive rispetto al totale delle cellule in5 campi di cultura scelti casualmente in aree necrotiche con ingrandimento di100 volte.• I dati sono stati espressi come percentuale di cellule Ki67-positive.• Per misurare la densità del micronatante, quale indice di proliferazione si ècontato il numero di vasi CD31-positivi in 5 campi di cultura scelticasualmente in aree necrotiche ad ingrandimento di 100 volte.

Preparazione di siRNA liposomale

DOPC siRNA

Sicurezza dello studio in vivo (chimica sanguigna e citochine).

• Campioni di plasma sono stati raccolti dal seno retro-orbitale edulteriormente analizzati con metodi bioumorali ematici [lattato deidrogenasi(LDH), azotemia (BUN), e creatinina] e produzione di citochinaproinfiammatoria.

MATERIALI E METODI

Cellule di carcinoma ovarico

MATERIALI E METODI

proinfiammatoria.• come controllo negativo sono stati usati equivalenti campioni contenentiacido silicico quale prodotto di degradazione delle particelle siliciche esoluzione salina.• I livelli di citochina nel supernatante sono stati testati usando un kit conmetodica ELISA secondo le istruzioni della ditta Bio-Rad.

Campionamento del vettore multistadio

Linee cellulari e coltura

Modello “in vivo” di carcinoma ovarico e

trattamento del tessuto

Analisi atomica dello spettro di emissione per la concentrazione in silicico del plasma accoppiato induttivamente.

•Gli organi sono stati fatti in pezzi, paccati sul fondo di una provetta, e poianalizzati per la concentrazione in silicio usando la spettroscopia di emissioneatomica del plasma accoppiato induttivamente.• E’ stato rinvenuto silicio ad una λ rispettivamente di 250.69, 251.43, 251.61, e

MATERIALI E METODIMATERIALI E METODI

� Western Blot

� Immunoistochimica• E’ stato rinvenuto silicio ad una λ rispettivamente di 250.69, 251.43, 251.61, e288.158 nm e come controllo interno è stato usato dell’ ittrio (1 ppm) per lanormalizzazione.•Tutti i risultati sono stati espressi come percentuale di dose iniettata.

�Spettro di emissione della concentrazione plasmatica di silicio

S1MP-EphA2 siRNA DOPC

EphA2

ß-Actina

MATERIALI E METODI

• Microscopia elettronica a trasmissione del tessuto (TEM)

• Dimensione campione ed analisi statistica

• Sicurezza dello studio in vivo

RISULTATI E CONCLUSIONI

�Ottimizzazione legame

�Vettore”-siRNA

� EphA2 over espresso

nel 70% dei casi

�Espressione ridotta dell’80%

RISULTATI E CONCLUSIONI

�Vettore”-siRNA

�Tempi di degradazione

�Durata effetto“silencer”

�Espressione ridotta dell’80%

RISULTATI E CONCLUSIONI

Campioni di tessuto renale ed epatico

trattati con S1MP-Alexa555-siRNA-DOPC

dopo 10 giorni dalla somministrazione

Campioni di tessuto renale ed epatico

trattati con Alexa555-siRNA-DOPC

dopo 10 giorni dalla somministrazione

RISULTATI E CONCLUSIONI

Analisi immunoistochimiche dell’espressione

di EphA2 nel tumore HeyA8

RISULTATI E CONCLUSIONI

Confronto con le tecniche precedenti:

�Maggiore riduzione della massa

tumorale

�Riduzione delle quantità di farmaco

iniettate alle cavie

�Diminuzione della vascolarizzazione

delle cellule tumorali

RISULTATI E CONCLUSIONI

Effetti della terapia del siRNA

sull’angiogenesi e sulla proliferazione cellulare

RISULTATI E CONCLUSIONI

Biodistribuzione:Biodistribuzione:

Esperimenti

FEGATO RENE

RISULTATI E CONCLUSIONI

S1MP IN TESSUTI DEL FEGATO E DEI RENI

RISULTATI E CONCLUSIONI

S1MP IN TESSUTI DEL FEGATO E DEI RENI

FEGATO RENE

Storiografia

• http://www.memsindustrygroup.org/files/public/MEMS-ferrari.pdf• http://www.memsindustrygroup.org• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/• http://www.roche.it• http://www.nobelprize.org/• http://www.siRNA.gene-quantification.info• http://www.proteinlounge.com• http://www.proteinlounge.com• parte del materiale riguardante l’esperimento è stata fornita dallo stesso Mauro Ferrari

Prof. Cinzia Di Pietro

Roberta MannaMassimiliano MoranoMassimiliano MoranoMaria Chiara MilanaAndreana MaglittoStefano MarlettaTommaso Piticchio