Negli anni a cavallo fra 1890 e il 1914 la Stazione Zoologica di Na-poli (SZN), fondata nel 1872 dal biologo evoluzionista tedesco AntonDohrn, uno dei principali sostenitori delle teorie di Darwin (Groebene Ghiselin 2009), è stata teatro di importanti scoperte nel campo dellabiologia sperimentale. Complice degli eventi di quel periodo, non atorto definito la “golden era” dell’embriologia sperimentale (Fantini2000), è stato l’embrione di riccio di mare che, sin dalla scoperta dellafusione dei pronuclei nella formazione di un unico nucleo zigotico adopera dei fratelli Hertwig (1887) e di Hermann Fol (1877), si è rivelatoun modello eccezionale per gli studi sul ruolo svolto dal nucleo nellosviluppo embrionale di tutti gli animali, compreso l’uomo (Davidson1998). Ne sono testimonianza gli esperimenti condotti nel 1891 allaSZN dal biologo tedesco Hans Driesch, con i quali egli dimostrò che ilnucleo di ciascun blastomero derivante dalle prime divisioni dell’uovofecondato di riccio di mare conteneva tutte le informazioni necessarieper un corretto sviluppo embrionale (Driesch 1892). L’importanza diqueste scoperte è stata recentemente rivalutata in occasione della pub-blicazione della prima sequenza di un genoma di riccio di mare (Da-vidson 2006; Pennisi 2006).

Questo breve saggio si propone di rivisitare un celebre esperi-mento, non a caso ritenuto non solo una pietra miliare della ricerca ric-cio di mare ma anche una scoperta fondamentale della biologia(Davidson 2006), condotto da un altro biologo tedesco assiduo fre-quentatore della SZN tra il 1889 e il 1914, Theodor Boveri. L’analisi ditale esperimento, spesso citato come quello “della dispermia nel ricciodi mare” (Sander 1993), permise a Boveri di dimostrare per la primavolta l’individualità dei cromosomi e fu definito da Edmund B. Wilson«Boveri’s crowning achievement, whether in respect to excellence ofmethod or importance of result» (Wilson 1918, pp. 74-75).

1

GLI ESPERIMENTI DI THEODOR BOVERIALLA STAZIONE ZOOLOGICA 100 ANNI DOPO

Figura 1: ritratto di Theodor Boveri prima del 1915. DaTheodor Boveri 1862-1915 aus: Hans Stubbe: KurzeGeschichte der Genetik bis zur Wiederentdeckung GregorMendels. Jena, 2. Auflage 1965. Quelle dort: aus Forscherund Wissenschaftler im heutigen Europa Bd. 2: Erforscherdes Lebens. Oldenburg/ Hamburg: Stalling.

Figura 2: le fasi della mitosi e il comportamento dei cromosomi nella meiosi secon-do Weismann. Le illustrazioni sono tratte da Weismann 1891 (A, B) e Weismann 1892(I, II, III, IV).

Le conoscenze sul nucleo al tempo di BoveriNon si possono apprezzare a pieno i progressi concettuali conse-

guiti da Boveri attraverso il suo più noto esperimento senza analizzarebrevemente le conoscenze precedenti allo stesso sull’organizzazionedella cromatina e il suo ruolo nello sviluppo embrionale. Negli anni acavallo tra fine ’800 e inizi del ’900 era già noto che il numero di cro-mosomi rimane costante tra una mitosi e l’altra, ma a stento si eranonotate le differenze di dimensioni di ciascuno dei cromosomi e menoche mai queste venivano considerate significative; di conseguenza,quasi nessuno sentiva l’esigenza di considerare i singoli cromosomicome distinti l’uno dall’altro. Ad esempio August Weismann, una delleprincipali autorità nel campo, ed anch’egli ospite della SZN negli anni1891-2, nella sua celebre Keimplasmatheorie ipotizzò che la cromatinafosse organizzata nel nucleo come un singolo filamento (vedi figura 2,schema A) che veniva a frammentarsi in singoli cromosomi di ugualetaglia solo al termine della profase (figura 2, schema B).

2

Inoltre, cosa ancora più importante, Weismann pensava che cia-scuno dei cromosomi presenti in profase contenesse l’intero genoma,in varie copie (vedi schema in figura 2 I-IV), che si erano accumulatein generazioni precedenti ed erano ritenute i depositari di qualsiasi trat-to ancestrale esibito dall’individuo (Weismann 1982). Sulla linea di que-sto pensiero ne conseguiva che anche un singolo frammento di unoqualsiasi dei cromosomi poteva essere sufficiente a dirigere l’ontogene-si, e questo ovviamente implicava che anche una combinazione aber-rante dei cromosomi non poteva avere nessun effetto nocivo sullo svi-luppo embrionale.

È interessante notare che lo stesso Boveri, poco prima di condur-re gli esperimenti su uova dispermiche, era convinto del fatto che “cia-scuno dei cromosomi contenuti in una cellula uovo [al momento dellafecondazione] contiene tutte le ‘qualità cromatiniche’ di quella specie”(Boveri 1902, p. 43). Fu grazie agli esperimenti condotti sin dal 1892 daHans Driesch alla Stazione Zoologica – e qui possiamo ipotizzare chei due biologi tedeschi, entrambi in visita a Napoli nello stesso periodoe perfino ospiti della stessa pensione, avessero avuto più di un’oc-casione per scambiarsi idee sull’argomento – che Boveri ad un certopunto, prima del 1902, cambiò idea.

L’idea di BoveriNel 1904 Boveri scrive: «... alcune riserve si stavano insinuando in

me riguardo lo sviluppo patologico di embrioni derivanti da uovadispermiche, già osservato in particolare da Driesch nel riccio di mare(Driesch 1892). Driesch aveva coltivato singolarmente un numero con-siderevole di uova dispermiche di riccio di mare ed aveva osservatoche invariabilmente queste si sviluppavano in blastule patologiche (lecosì dette stereoblastule); nessuna di queste inoltre era in grado digastrulare. Nell’ipotesi in cui tutti i cromosomi erano equivalenti, e con-siderando tutte le [precedenti] osservazioni ed esperimenti sullo svilup-po in echinoidi, non ero assolutamente in grado di concepire una pos-sibile causa per questo comportamento patologico. Fu così che quan-do la scoperta di Herbst (1900) [che aveva lavorato per molti anni allaSZN ed ivi aveva dimostrato che l’acqua di mare priva di ione calcioinduceva dissociazione in singoli blastomeri dell’embrione di riccio dimare] ebbe fornito un metodo sicuro per separare i blastomeri senzadanneggiarli, divenne infine ovvio che le uova dispermiche dovesseroessere usate per studiare il problema dell’equivalenza dei cromosomi»(Boveri 1904, pp. 44-45). Così ovvio che lo stesso Boveri non volevache l’idea si diffondesse troppo, come ebbe a dire molto esplicitamen-te in una sua lettera a Hans Spemann: «A proposito, ti vorrei chiedere

3

4

Figura 3: ipotesi di distribuzione dei cromosomi in embrioni quadripolari derivantida uova dispermiche. Copia di Fig. 48 a und b pubblicata da Boveri in Ergebnisse überdie Konstitution der chromatischen Substanz des Zellkerns (BOVERI 1904).

di non parlare per ora dell’esperimento di dispermia. La cosa in sé èmolto semplice, almeno una volta si è incappati nell’idea di provarla»(in Baltzer 1961, p. 119).

L’esperimento di BoveriBoveri, secondo a nessuno come citologo, ovviamente accettò la

sfida. Ma, come sua abitudine, ponderò sul problema per molti anniprima di rendere pubblici i risultati del suo esperimento e le relativeconclusioni (cosa che avvenne solo nel 1907). Le argomentazioni quidi seguito riportate provengono da un saggio da lui pubblicato a metàstrada tra l’esperimento stesso e la sua pubblicazione definitiva. In-nanzitutto egli analizzò in dettaglio il dilemma di Driesch: «In una cel-lula uovo dispermica, la divisione di entrambi i centrosomi dello sper-ma di regola dovrebbe generare quattro “poli”. La cellula uovo si divi-de simultaneamente in quattro cellule. La nostra domanda è: come sa-ranno distribuiti i cromosomi tra i quattro blastomeri primari? Assu-miamo per semplicità un numero di quattro cromosomi per ogni pro-nucleo. Ognuno dei dodici cromosomi si distribuirà a caso tra due deiquattro poli. Si può qui vedere che il contenuto in cromatina differiscetra i quattro blastomeri in numero e tipo; solo nella cellula in basso asinistra sono presenti tutti e quattro i tipi di cromosomi. Fig. 48a rap-presenta uno dei casi possibili; Fig. 48b mostra gli stadi successivi dopola divisione dell’uovo in quattro cellule [vedi figura 3]. Si può vedereche il contenuto in cromatina differisce tra i quattro blastomeri innumero e tipo; ed è solo nella cellula in basso a sinistra che tutti e quat-tro i tipi sono presenti» (Boveri 1904, pp. 44-46).

5

Figura 4: il risultato dell’esperimento di Boveri. È qui riportata una copia della Fig.4 a-d pubblicata da Boveri in Die Entwicklung dispermer Seeigel-Eier. Ein Beitragzur Befruchtungslehre und zur Theorie des Kerns (Zellenstudien VI) (Boveri 1907).

Prima di tornare alle considerazioni di Boveri sul famoso esperi-mento di dispermia, è importante ricordare qui l’esperimento di Drieschgià citato che rappresenta l’esperimento-controllo per Boveri. Usandoancora le sue parole: «Consideriamo un uovo fecondato normalmente;questo si dividerà in quattro cellule dopo due divisioni cellulari e quin-di risulta identico al doppio fecondato dopo la prima divisione. Se unosepara un singolo ¼-blastomero dell’embrione normale dagli altri tre,allora si otterrà, come mostrato da Driesch (1982), un pluteo normalema ovviamente più piccolo, il che per estrapolazione prova che tutti equattro i blastomeri hanno questa abilità» (Boveri 1904, p. 47). Questadimostrazione si rendeva necessaria per fare un confronto con i blasto-meri ottenuti da uova dispermiche quadripolari (il cui destino è riporta-to in figura 4): «Se si separano i quattro blastomeri derivanti da un uovodispermico, avviene qualcosa completamente differente. All’inizio que-sti si sviluppano … più o meno patologicamente; in un secondo mo-mento, e questo è il punto importante: i quattro blastomeri derivanti da

Da questo se ne deduce quanto Boveri dimostrò sperimentalmen-te separando i blastomeri mediante il metodo di Herbst: «Le quattro cel-lule derivanti dalla divisione simultanea di una cellula uovo dispermi-ca sono essenzialmente equivalenti in tutte le loro proprietà del cito-plasma, inclusi i centrosomi. Se lo sviluppo patologico delle uova di-spermiche derivasse da un’anomalia nel citoplasma, allora la discen-denza di tutte e quattro cellule dovrebbe essere aberrante allo stessomodo; se derivasse da una distribuzione anomala della cromatina, allo-ra ci si dovrebbe aspettare che le quattro cellule differiscano nel lorofato. L’esperimento ha condotto a quest’ultimo risultato nella manierapiù spettacolare» (Boveri 1904, p. 47). Questo importantissimo risultatoè illustrato in un disegno pubblicato da Boveri vari anni dopo (riporta-to in figura 4).

un singolo uovo e quindi cresciuti in condizioni identiche si sviluppa-no di norma in maniera diversa, in particolare in grado diverso. Lo svi-luppo fino allo stadio di blastula è quasi sempre normale, ma poi inco-minciano ad affiorare le differenze: un quarto [di quelli che Boveri chia-mava Simultanvierer, ovvero blastomeri derivati dalla divisione simulta-nea di embrioni quadripolari come quello riportato in figura 3], infatti sidegrada in cellule singole [d in figura 4], mentre gli altri rimangono anuotare per parecchi giorni come larve; di queste, una può magari rima-nere allo stadio di blastula [c in figura 4], una terza giunge alla gastru-lazione prima di bloccare il suo sviluppo in questo stadio [b in figura 4],mentre la quarta può anche formare spicole e mostrare una suddivisio-ne del suo intestino, così iniziando in parte la sua trasformazione in plu-teo [a in figura 4]» (Boveri 1904, pp. 47/48).

L’esperimento di Boveri oggiIl famoso esperimento della dispermia in uova di riccio di mare

condotto alla SZN da Boveri è stato recentemente rivisitato nel miolaboratorio nell’ambito di un documentario per il canale BBC4 (Cell:The Chemistry of Life, 19 agosto 2009. Prodotto e diretto da AlisonRooper). Come si può osservare in figura 5, utilizzando le moderne tec-niche di visualizzazione del DNA mediante fluorofori specifici, è moltofacile apprezzare al microscopio di oggi il diverso contenuto cromati-nico dei nuclei ottenuti dopo la prima divisione in uova dispermicherispetto ad embrioni fecondati normalmente (si confronti B con D). Èinvece molto difficile concludere qualcosa riguardo alla distribuzionedei cromosomi tra i vari nuclei osservando le sole immagini in luce nor-male (A e C di figura 5) seppur ottenute con microscopi ben più poten-ti di quelli utilizzati da Boveri.

Boveri non aveva alcun mezzo per stabilire il numero di cromo-somi nei suoi embrioni dispermici, cosa che da sola avrebbe provatoche lo sviluppo anormale di questi embrioni era dovuto alla perdita dispecifici cromosomi. Quanto al giorno d’oggi risulta evidente al micro-scopio a fluorescenza (come mostrato in figura 5D) non era direttamen-te osservabile e, cosa forse anche più significativa, andava contro lenozioni correnti al tempo di Boveri. Eppure egli, dalla sola analisi degliesperimenti di dispermia, raggiunse attraverso prove indirette quelleconclusioni che gli permisero di scoprire una verità fondamentale dellabiologia. Per costruire le sue prove indirette Boveri seguì due strade.

La prima di queste era basata sulla sua precedente scoperta, pub-blicata nel 1905, del fatto che la superficie di un nucleo è proporzio-nale al suo contenuto cromatinico (Boveri 1905). Boveri ora avevanotato che tra i blastomeri isolati da embrioni dispermici quadripolari(i famosi Simultanvierer) quelli che possedevano nuclei particolarmen-

6

te grandi presentavano uno sviluppo fortemente aberrante, mentreinvece blastomeri con nuclei più piccoli del normale – e quindi con unridotto contenuto in cromatina – spesso davano risultati migliori.Questa importantissima osservazione escludeva quindi la possibilitàche la quantità della cromatina era la causa dello sviluppo aberrante,e suggeriva che tale causa si doveva invece ricercare nell’assenza diuno o più cromosomi di una qualità particolare. Per dirlo con parolesue: «Quindi quanto rimane è che, non un certo numero, ma una certacombinazione di cromosomi è richiesta per uno sviluppo normale, equesto non può significare altro che i singoli cromosomi devono pos-sedere qualità diverse» (Boveri 1902, p. 75).

7

Figura 5: l’esperimento di dispermia oggi. Nella figura sono riportate foto rappre-sentative di embrioni fecondati in condizioni normali (A e B) ed embrioni polisper-mici (C e D) ottenuti mediante fecondazione con eccesso di sperma in acqua dimare artificiale a basso contenuto (50 mM) di ione sodio. Le foto in A e C sono stateottenute mediante un moderno microscopio invertito (Axiovert) utilizzando la tec-nica del contrasto di fase. Le immagini in B e D sono state ottenute ad un micro-scopio a florescenza (Axioimager) eccitando con luce ultravioletta. I nuclei in blu inB e D sono stati evidenziati dopo fissaggio degli embrioni mediante trattamento conil colorante Hoechst. L’embrione in C rappresenta il tipico risultato di una divisionesimultanea a tre di un embrione dispermico tripolare (o Simultandreier), mentrel’embrione riportato in D mostra chiaramente il differente contenuto cromatinico deiquattro poli in un embrione quadripolare (o Simultanvierer) in la cui divisione cel-lulare non è ancora completa.

La seconda linea di evidenze indirette si basava su un argomentopuramente statistico, supportato da una simulazione fatta con palline dilegno distribuite a caso su una tavola (vedi figura 6), poi comparata airisultati sperimentali ottenuti da una paziente osservazione – con l’aiutodalla moglie, Marcella O’Grady Boveri, in visita a Napoli negli anni1901 e 1902 – dello sviluppo di migliaia di Simultanvierer. Scopo prin-cipale di queste simulazioni era di calcolare con quale frequenza ci sipoteva aspettare che ciascun blastomero derivante dalla divisione di unuovo dispermico ricevesse almeno un cromosoma di ogni tipo, condi-zione ormai ipotizzata da Boveri come indispensabile per uno svilup-po normale. Queste frequenze erano poi confrontate con le percentua-li di plutei apparentemente normali ottenuti da uova dispermiche sianel caso della divisione tripolare (per la quale, dopo 200 iterazioni ditipo Simultandreier, la “macchina casuale” di Boveri prevedeva l’11%di configurazioni normali o “salutari”), sia nel caso della divisione qua-dripolare (per la quale, dopo 100 iterazioni di tipo Simultanvierer, lafrequenza di configurazioni normali prevista dalle simulazioni eranulla).

8

Figura 6: la “macchina casuale” ideata da Boveri per simulare la distribuzione deicromosomi nei blastomeri derivanti da embrioni quadripolari (Simultanvierer). Lamacchina consisteva di una tavola circolare coperta da una tovaglia. Su questa sortadi “cellula uovo” piatta Boveri faceva cadere a caso tre “set di cromosomi” ciascu-no rappresentato da palline di legno numerate da 1 a 18 (il numero tipico di cro-mosomi in un nucleo aploide). Ciò fatto, sistemava una sorta di croce di legno sullatavola a creare quattro quadranti (come nel pannello Fig. LXI) in modo da assegna-re così un certo assortimento di “cromosomi” ad ognuno delle “piastre metafasiche”derivanti da un embrione quadripolare in divisione (rappresentato, ruotato di 45gradi, nella figura 3 di questo saggio, alias Fig. 48b in Boveri 1904). Le palline eranoquindi trasferite in una tavola per la conta (come nel pannello Fig. LXII) ed i con-teggi erano eseguiti per coppie di colonne adiacenti (inclusa la coppia I e IV) rag-gruppate in modo da trovare il corredo cromosomico che ciascun polo del fusoavrebbe ricevuto dalle due piastre metafasiche ad esso associate (da Boveri 1907).

9

Le sottilissime differenze osservate tra le percentuali ottenute me-diante simulazione con la “macchina casuale” e le percentuali di pluteinormali ottenute sperimentalmente (8% per i Simultandreier e 0,0013%per i Simultanvierer) furono ampiamente discusse da Boveri nel lavo-ro del 1907, fornendo svariate spiegazioni tutte plausibili. L’accordo traprevisioni e dati sperimentali, insieme alle altre osservazioni preceden-temente citate, fu così spettacolare da convincere la maggior parte deibiologi suoi contemporanei del fatto che la dispermia genera embrioniaberranti perché singoli cromosomi verrebbero ad essere segregati, equindi esclusi, tra un blastomero o l’altro.

ConclusioniCom’è ormai ben noto – e n’è testimonianza l’Erinnerungen an

Theodor Boveri scritto da Wilson nel 1918 – l’analisi fatta da Boveri deisuoi “esperimenti naturali” e le conclusioni che lui ne trasse, hannorappresentato una delle svolte fondamentali verso la teoria cromosomi-ca dell’ereditarietà: senza l’“individualità” dei cromosomi – ad esserepiù precisi, senza l’unicità funzionale dei singoli cromosomi – a nessu-no sarebbe venuto in mente di correlare il passaggio dei cromosomi dauna generazione all’altra con la trasmissione dei fattori ereditari dimo-strata da Gregor Mendel. E questo invece è esattamente quanto fatto daTheodor Boveri e Walter Sutton, più o meno l’uno indipendentementedall’altro, negli anni 1902-3, gettando così le basi della citogenetica.

Ripetere l’esperimento di dispermia e analizzare oggi, con il baga-glio di conoscenze accumulate fino ai nostri giorni, la sequenza didimostrazioni proposte da Boveri più di un secolo fa, rende ancora piùapprezzabile la genialità e l’unicità di questo scienziato, peraltro perce-pita anche dai suoi contemporanei, come si evince da quanto Wilsonscriveva nel 1918: «... Boveri stood without a rival among the biologi-sts of his generation; and his writings will long endure as classicalmodels...» (Wilson 1918). Ed è quindi con le parole di Wilson che vor-rei chiudere questo breve saggio, piccolo omaggio ad un grande maes-tro: «For, as the interests of his life reached far beyond the limits of thelaboratory ... so his work was remarkable not alone for what he did butalso in the manner of its doing. That work was in high degree original,logical, accurate, thorough. It enriched biological science with some ofthe most interesting discoveries and fruitful new conceptions of ourtime» (Wilson 1918).

RingraziamentiMolto di questo scritto è tratto dall’illuminante saggio di Klaus

Sander (Sander 1993) a cui devo anche la traduzione dal tedesco all’in-

glese delle citazioni di Boveri e Weismann qui riportate da me tradot-te in italiano. Un ringraziamento particolare va alla dott.sa ChristianeGroeben dell’Archivio Storico della SZN per la consulenza sui cennistorici citati in questo saggio.

MARIA INA ARNONE*

10

* Stazione Zoologica Anton Dohrn, Villa Comunale Napoli, Italia.

11

Riferimenti bibliograficiBALTZER F. (1961), Theodor Boveri. Leben and Werk eines groben

Biologen, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart.BOVERI T. (1902), Über mehrpolige Mitosen als Mittel zur Analyse des

Zellkerns. Verh Phys.-med Ges Würzburg [N F] 35: 67-90.— (1904), Ergebnisse über die Konstitution der chromatischen

Substanz des Zellkerns, Gustav Fischer, Jena.— (1905), Über die Abhängigkeit der Kerngröbe und Zellenzahl der

Seeigel-Larven vonder Chromosomenzahl der Ausgangszellen(Zellenstudien V), in «Jena Z Naturwiss» 39:1-80.

— (1907), Die Entwicklung dispermer Seeigel-Eier. Ein Beitrag zurBefruchtungslehre und zur Theorie des Kerns (Zellenstudien VI),Gustav Fischer, Jena.

DAVIDSON EH. (2006), The Sea Urchin Genome: Where Will It Lead Us?in «Science» 314: 939-940.

DAVIDSON EH., CAMERON RA., RANSICK A. (1998), Specification of cell fatein the sea urchin embryo: summary and some proposed mecha-nisms, «Development» 125: 3269-3290.

DRIESCH H. (1892), Entwicklungsmechanische Studien III-V1, in «Z WissZool» 55: 1-62.

FANTINI B. (2000), The “Stazione Zoologica Anton Dohrn” and theHistory of Embryology, in «Int. J. Dev. Biol.» 44: 523-535.

GROEBEN, GHISELIN (2009), Anton Dohrn: a life for Science, in «MarineEcology» 29: 273-275.

HERBST C. (1900), Über das Auseinanderweichen von Furchungs- undGewebszellen in kalkfreiem Medium, «Arch Entwickelungsmech(Roux’s Arch)» 9: 424-436.

HERTWIG O. and HERTWIG R. (1887), Uber den befruchtungs- und tei-lungs-vorgang des tierischen eies unter dem einfluss asserer agen-tien, in «Jena. Z. Naturwiss» 20:120.

FOL MH. (1877), Sur le premier développement d’une Étoile de mer, in«Comptes Rendus» 84, 357-360.

PENNISI E. (2006) Sea Urchin Genome Confirms Kinship to Humans andOther Vertebrates, in «Science», 314: 908-909.

SANDER K. (1993), Aneuploidy disrupts embryogenesis: Theodor Boveri’s ana-lysis of sea urchin dispermy, in «Roux’s Arch. Dev. Biol.» 202: 247-249.

WEISMANN A. (1891), Amphimixis oder die Vermiscbung der Individuen.Gustav Fischer, Jena.

— (1892), Das Keimplasma - eine Theorie der Vererbung. GustavFischer, Jena.

WILSON EB. (1918), Theodor Boveri, in ROENTGEN CW (ed), Erinnerungenan Theodor Boveri, JBC Mohr (Paul Siebeck), Tübingen, pp. 67-89.

12