Giovanni Di Bonaventura, Ph.D. · (Columbia CNA agar, contenente colistina ed acido nalidixico vs...

Infezioni delle vie respiratorie

Giovanni Di Bonaventura, Ph.D.

CI Medicina di Laboratorio

CL Medicina e Chirurgia

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara

AA 2011-2012

Difese

• Sistema delle vie respiratorie

• Flora normale (commensale)

• Protezione “meccanica”

2

• Protezione “meccanica”

Sistema delle vie respiratorie

• Principale via di ingresso

per le infezioni

• Vie superiori

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– Bocca, naso, cavità

nasale, seni, gola,

epiglottide e laringe

• Vie inferiori (basse)

– Trachea, bronchi e

bronchioli nei polmoni

Flora normale

• Commensali

• Limitata al tratto superiore

• Principalmente Gram+

4

• Principalmente Gram+

• Antagonismo microbico (competizione)

• Immunocompromessi a rischio

Protezione

• Peli del naso

• Cilia (mucosa tracheale)

• Bronchi

5

• Bronchi

• Muco

• Risposte involontarie (tosse, starnuti)

• Cellule del sistema immune

Infe

zio

ni re

spir

ato

rie

• Alte vie

respiratorie

• Alte e basse vie

respiratorie

6

Infe

zio

ni re

spir

ato

rie

respiratorie

• Basse vie

respiratorie

Infezioni delle

Alte vie respiratorie

• Raffreddore comune

• Sinusiti

• Infezioni dell’orecchio

7

• Infezioni dell’orecchio

• Faringiti

• Difterite

Raffreddore comune

(rinite)

• Eziologia:

– generalmente virale (oltre 200 virus)

– possibili infezioni secondarie batteriche

8

– possibili infezioni secondarie batteriche

• Prevalente nella popolazione umana

• Trasmissione: per contatto indiretto o per via aerogena

• Diagnosi: non necessaria

• Non esistono vaccini

• Non richiede chemioterapia (solo terapia sintomatica)

Sinusite

• Infiammazione dei seni paranasali

• Eziologia:– generalmente batterica (Streptococcus pneumoniae, quindi

Haemophilus influenzae, Moraxella catharralis, Streptococcus spp.; spesso infezioni miste)

– anche virale

9

– anche virale

– raramente fungina (soprattutto nei pz immunocompromessi)

• Trasmissione:– endogena (opportunismo) o traumatica (funghi)

• Diagnosi:– su base clinica (e/o diagnostica per immagini)

– coltura generalmente non necessaria

• Terapia: – antibiotici ad ampio spettro

– rimozione agente fungino

Infezione dell’orecchio

• Infezione batterica

• Otite media acuta

• Comunemente secondaria a rinite

• Presenza di effusione (liquido di natura infiammatoria)

• Biofilm batterici possono essere associati alle otiti medie

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• Biofilm batterici possono essere associati alle otiti medie croniche

• Diagnosi: – clinica, mediante esame otoscopico e timpanometria

• Terapia: – antibiotica ad ampio spettro (in assenza di diagnosi eziologica):

amoxicillina, ampicillina, SXT, ceftriaxone

I batteri possono migrare attraverso la tuba di Eustachio dalle vie respiratorie

superiori. L’accumulo di muco e fluidi può causare infiammazione ed effusione

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Faringite

• Infiammazione del faringe, ipofaringe, ugole e tonsille

• Trasmissione per droplet e/o contatto diretto

• Infezione virale (sintomi nasali o faringei)

– Adenovirus, Rhinovirus virus parainfluenzali, EBV

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– Adenovirus, Rhinovirus virus parainfluenzali, EBV

• Infezione batterica (solo sintomi faringei)

– Streptococcus pyogenes (gruppo A), causa più comune di faringite

• Portatori sani: 20% nei bambini, % minore negli adulti

– Streptococchi gruppo C, di origine animale: Streptoccocus equi subsp.

zooepidemicus e subsp. equi, Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae

e subsp. equisimilis, Streptococcus constellatus susp pharyngis

– Streptococchi gruppo G (Streptococcus anginosus)

Streptococcus pyogenes

• Gruppo A di Lancefield

• Streptolisine (emolisine)

• Fattori di diffusione tessutale

• Acidi lipoteicoici– adesine– adesine

• Proteina M– Antifagocitaria

• Tossina eritrogenica

• Tossine possono agire come “superantigeni”– Iperstimolazione dei linfociti T

• Iperespressione di citochine (es. TNF-alfa)

Difterite

• Infezione batterica causata da ceppi tossigeni di Corynebacterium diphtheriae (dei quali sono noti 4 biotipi –gravis, mitis, intermedius, e belfanti) ed alcuni ceppi tossigeni di Corynebacterium ulcerans e Corynebacterium pseudotuberculosis

• Trasmissione per contatto diretto/indiretto con fomites

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• Trasmissione per contatto diretto/indiretto con fomites contaminati, droplets

• Esotossina difterica A-B

• Formazione di membrana su tonsille o faringe (in alcuni casi anche sulla trachea – croup respiratorio)

• Vaccino (tossoide difterico, parte di DTaP)

• Terapia: antitossina + penicillina o eritromicina

Segni caratteristici di difterite: faringe e tonsille infiammati caratterizzati

dalla presenza di una (pseudo)membrana (cotenna) formata dai fibrina,

leucociti e detriti cellulari.

15

Meccanismo di azione della

tossina A-B di Corynebacterium

diphtheriae.

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Tampone faringeo-tonsillare(faringotonsillite, difterite, angina Vincent, pertosse, infezioni virali)

PRELIEVO DEL CAMPIONE• MODALITA’ DI PRELIEVO

– Utilizzando un abbassalingua, comprimere

delicatamente la lingua sul pavimento della

bocca.

– Inserire il tampone tra le tonsille, al disotto

della ugola, evitando di toccare la mucosa

delle guance, la lingua, l'ugola e le labbra che delle guance, la lingua, l'ugola e le labbra che

sono fortemente colonizzate dalla flora

commensale.

– Strofinare o ruotare vigorosamente il tampone

sul retrofaringe.

– Utilizzare tamponi in dacron, evitando il

cotone (tossico per alcune specie microbiche)

o l’alginato di calcio (inibitori PCR)

– Non eseguire mai il tampone faringeo se vi è

un sospetto di epiglottidite acuta perché può

indurre una grave ostruzione delle vie aeree

superiori. La diagnosi di tale malattia è

esclusivamente clinica.

Tampone faringeo-tonsillare (faringotonsillite, difterite, angina Vincent, pertosse, infezioni virali)

• PERIODO DI ESECUZIONE

– All’insorgenza dei sintomi.

– E' preferibile effettuare il prelievo a digiuno; va evitato l'uso di disinfettanti

locali, antimicotici e antibiotici nei 3-5 giorni precedenti il prelievo.

TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE• TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA

– I campioni devono essere trasportati e processati il rapidamente possibile.

– Per la ricerca di N. gonorrhoeae/meningitidis la condizione ottimale si – Per la ricerca di N. gonorrhoeae/meningitidis la condizione ottimale si

raggiunge con la semina diretta dei campioni sui terreni al momento del

prelievo ed incubazione senza ritardi. Il tempo di trasporto deve essere il più

breve possibile.

• ACCORGIMENTI SPECIALI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO

– I tamponi devono essere inviati in terreno di trasporto (Amies o Stuart).

– Se la semina è ritardata, si preferisce la conservazione refrigerata a quella a

temperatura ambiente.

– La conservazione protratta (>48 h) a

temperatura controllata è, tuttavia,

sconsigliata perché alcune specie patogene

soffrono la refrigerazione (pneumococco,

Haemophilus).

Tampone faringeo-tonsillare

PROCEDURA SUL CAMPIONE• ESAME MICROSCOPICO

– La microscopia è patognomonica soltanto per la angina di Vincent (ricerca di

Borrelia vincentii e Fusobacterium spp.)

– Non ha senso eseguirla routinariamente nella diagnosi di laboratorio delle

infezioni delle alte vie respiratorie per la massiccia presenza di batteri

commensali non patogeni.

• COLTURA E RICERCHE• COLTURA E RICERCHE

– Inoculare ciascuna piastra di agar con il tampone

Tampone faringeo: POS (Procedure Operative Standard)

TERRENI DI COLTURA, CONDIZIONI E MICRORGANISMI

(Health Protection Agency UK, 2005-2008)

Tampone faringeoRicerca di Streptococcus pyogenes

L’isolamento colturale è il GOLD STANDARD. Tuttavia, è possibile porre diagnosi rapida mediante ricerca antigenica (agglutinazione al lattice) nel campione.

• SEMINA– Il tampone viene inoculato per strisciamento su piastre al sangue non- o selettive

(Columbia CNA agar, contenente colistina ed acido nalidixico vs Gram-).– Le piastre vengono incubate in atmosfera al 5-10% di CO2 od in anaerobiosi ad una

temperatura di 37 °C per 16-24 h.

• ASPETTO COLONIE– Piccole dimensioni (diametro: 0.5 mm), cupoliformi, con margine continuo, secche (o – Piccole dimensioni (diametro: 0.5 mm), cupoliformi, con margine continuo, secche (o

raramente mucose); può essere difficile prelevare le colonie dalla piastra.– La beta-emolisi (lisi completa dei globuli rossi con formazione di un alone di

chiarificazione del sangue attorno alla colonia) è più evidente in condizioni anaerobiche perché le emolisine sono più stabili in assenza di ossigeno.

• ASPETTO MICROSCOPICO– Colorazione Gram: cocchi Gram+, disposti in corte o lunghe catenelle, talvolta a

grappolo.

• TESTS BIOCHIMICI– Catalasi-negativo (vs stafilococchi, catalasi+)– La sensibilità alla bacitracina a bassa concentrazione è stata utilizzata come metodo

di screening, ma i risultati non sono attendibili. E’ stata segnalata resistenza alla benzilpenicillina.

– Positività alla prova della pyrrolidonyl arylamidasi (PYR), sebbene anche alcuni ceppi dei gruppi C e G isolati dall’uomo siano positivi.

– Sensibilità alla bile

Tipizzazione di Lancefield

23

PYR rapid test

Strept. pyogenes: catalasi neg Staph. aureus: catalasi pos

Tampone faringeoRicerca di Streptococchi beta-emolitici gruppi C-G-B

• La presenza di Streptococchi β-emolitici di gruppo C o G (Streptococcus

anginosus) deve essere riesaminata se in carica medio-bassa, per escludere

l'eventualità di una contaminazione transitoria.

• E’ opportuno segnalare la presenza di Streptococchi β-emolitici di gruppo B (S.

agalactiae) nei neonati per consentire la valutazione della contaminazione del

bambino in seguito al parto e il rischio di sviluppo di meningite o sepsi in età

perinatale (fino al 1° mese).

Tampone faringeoRicerche particolari su richiesta specifica

A. Tampone faringeo, tampone rino-faringeo per la diagnosi di DIFTERITE

• Il tampone viene inoculato su terreno di Tinsdale/Hoyle (agar tellurito) e

incubato a 37°C in atmosfera di CO2 al 5 % per 24-48 ore.

• Colonie sospette per C. diphtheriae: ∅: 1-3 mm, colore grigio-nerastro.

• Tests biochimici: catalasi positive.

• Dalle colonie con morfologia sospetta si può eseguire una colorazione di • Dalle colonie con morfologia sospetta si può eseguire una colorazione di

Gram per verificare le presenza di bastoncelli Gram+, da tipizzare poi

biochimicamente.

• L’isolato positivo deve essere testato per la produzione della esotossina

difterica, mediante reazione di immunoprecipitazione in agar.

• Esame negativo: assenza di C. diphtheriae

• Esame positivo: presenza di C. diphtheriae produttore di esotossina

difterica.

Crescita su agar tellurito (Hoyle agar). I corinebatteri metabolizzano il tellurito di potassio presente nel terreno riducendolo a metallo (tellurio), la cui precipitazione conferisce una colorazione grigio-nerastra alle colonie. Corynebacterium dyphtheriae può crescere su questo terreno in tre diverse varianti coloniali: gravis (colonie grandi, piatte, grigio-nerastre); mitis (colonie più piccole, lucide e cupoliformi); intermedius (colonie molto piccole, lucide o meno).

Crescita su agar tellurito-cisteina (Tinsdale agar). Questo terreno contiene, oltre al tellurito, anche cisteina. Alcune specie di Corynebacterium sono capaci di produrre H2S, formatosi per reazione tra cisteina e tellurito, producendo un alone marrone diffuso attorno alle colonie nerastre contenenti tellurio.

Corynebacterium diphtheriae, mitis, produttore di H2S su Tinsdale agar

Corynebacterium xerosis, non produttore di H2S su Tinsdale agar

Corynebacterium diphtheriae, agente eziologico di difterite, è un bacillo

Gram-positivo che può assumere caratteristiche disposizioni: a “lettere

cinesi”, a palizzata, a “V”.

Evidente è la presenza di inclusioni (globoidi e periferiche), formate da polifosfati e chiamate granuli metacromatici (volutina).


B. Esame microscopico per l'angina di Vincent

• Il tampone faringeo viene strisciato su vetrino portaoggetti, colorato

con colorazione di Gram (o Ziehl-Nielsen) ed esaminato a massimo

ingrandimento (x 1.000).

• Esame negativo: presenza di morfotipi propri della flora commensale • Esame negativo: presenza di morfotipi propri della flora commensale

(cocchi Gram+ e Gram-, bastoncelli Gram+ e/o Gram-, miceti).

• Esame positivo: presenza di fusobatteri (Fusobacterium spp) o spirilli

Gram- (Borrelia spp), normalmente assenti nella flora orofaringea.

Fusobacterium spp.Borrelia burdorferi


D. Tampone (rino)faringeo, tampone nasale per diagnosi di infezione VIRALE

• Entrambi questi materiali sono idonei per la diagnosi di infezione virale perché

i virus, contrariamente ai batteri, sono presenti in fase di replicazione attiva

sia a livello delle basse che delle alte vie respiratorie.

• Il tampone viene strisciato su appositi vetrini.

• I vetrini vengono quindi fissati con acetone e testati con anticorpi polispecifici

(screening) o monospecifici (conferma) fluoresceinati.(screening) o monospecifici (conferma) fluoresceinati.

• Il preparato viene letto al microscopio a fluorescenza.

• Ricerca routinaria per: virus influenzali A/B, virus parainfluenzali 1/2/3, Virus

Respiratorio Sinciziale, Adenovirus, Coronavirus.

Esame negativo: assenza di fluorescenza specifica

Esame positivo: presenza di fluorescenza specifica.

NOTA: la diagnosi di faringite da Epstein-Barr virus viene comunemente posta

mediante indagine sierologica e/o ricerca virale diretta su tampone faringeo

con tecniche molecolari (PCR).

Tampone nasale

MODALITA’ DI PRELIEVO DEL CAMPIONE:

• Invitare il paziente ad assumere una posizione eretta con la testa

leggermente china all’indietro

• Inserire il tampone nella narice e spingerlo accuratamente lungo il

pavimento della coana nasale per circa 2.5 cmpavimento della coana nasale per circa 2.5 cm

• Ruotare il tampone più volte per raccogliere il campione biologico

• Rimuovere il tampone ed inserirlo nel terreno di trasporto

• Effettuare il prelievo in entrambe le narici

TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE

• Mantenere i campioni a temperatura ambiente (terreno di

trasporto) o refrigerare per la ricerca del genoma virale

• Inviare al laboratorio appena possibile (non oltre le 24h)

Tampone rino-faringeo


• Dopo aver immobilizzato la testa del paziente, inserire con cautela

il tampone sottile in una narice fino a raggiungere la parete

posteriore del rinofaringe

• Mantenere il tampone “in situ” per qualche secondo prima di • Mantenere il tampone “in situ” per qualche secondo prima di

estrarlo.

• Ripetere l’operazione con un altro tampone per l’altra narice


• Mantenere i campioni a temperatura ambiente (terreno di

trasporto) o refrigerare per ricerca virale

• Inviare al laboratorio il prima possibile (non oltre le 24h)

Epiglottidite

• Infezione batterica (Haemophilus influenzae tipo B nell’85% dei casi) nei bambini al di sotto dei 5 anni

• Frequentemente, è presente una concomitante infezione virale

• Esordio improvviso: febbre, ansietà, estensione del collo nel tentativo di aprire le vie aeree

• Epiglottide arrossata ed ingrossata

33

• Epiglottide arrossata ed ingrossata

• Ostruzione completa delle vie respiratorie nei soggetti più piccoli

• Poiché il traumatismo del prelievo mediante tampone faringeo può aggravare l’ostruzione, questa procedura è vivamente sconsigliata in tutti i casi di sospetta epiglottidite.

• I tamponi faringei possono essere utili per determinare la colonizzazione delle vie aeree superiori da H. influenzae tipo b e di solito sono prelevati solo per studi a carattere epidemiologico.

Haemophilus influenzae. Bacillo Gram-negativo

Haemophilus influenzae. Crescita su agar cioccolato

Infezioni delle

Alte e Basse vie respiratorie

• Pertosse

• Virus respiratorio sinciziale

• Influenza

35

• Influenza

Pertosse

• Infezione batterica (Bordetella pertussis, B. parapertussis)

• Può colpire individui di tutte le età, ma la sua

manifestazione è più frequente nei bambini dai 2 ai 6

anni.

36

anni.

• Fase “catarrale” – sintomatologia lieve

• Fase “parossistica” (convulsiva) – accessi di tosse violenti

(2-4 settimane)

• Fase di convalescenza – danno ciliare

• Tossina

– tox A-B, tropismo tracheale

Diagnosi di pertosse

TIPOLOGIA DEL CAMPIONE:

• L’aspirato nasofaringeo è il campione raccomandato. In alternativa,

possono essere utilizzati i tamponi nasali e nasofaringei. Si consiglia il

prelievo di 2 tamponi: ricerca Bordetella spp + ricerca virus.

PRELIEVO DEL CAMPIONE:

• La raccolta delle secrezioni nasofaringee nei pazienti con pertosse può

fare insorgere un eccesso parossistico di tosse e determinare fare insorgere un eccesso parossistico di tosse e determinare

l’ostruzione delle vie aeree. Necessaria la strumentazione per la

rianimazione. Rischio biologico per personale sanitario (non è

raccomandato l’isolamento mediante piastre esposte a colpi di tosse).

• Un tampone transnasale (Dacron TM con filo di supporto flessibile) è

inserito attraverso la narice e fatto penetrare lungo la base del naso fino

a raggiungere il nasofaringe. Mantenere il tampone contro la parete

posteriore del nasofaringe per almeno 30 secondi o fino a quando il

paziente tossisce.

• L’essudato nasofaringeo viene raccolto, mediante catetere da suzione

inserito attraverso il naso, in un contenitore sterile di plastica

Diagnosi di pertosseTRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE

• I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile

• Le piastre possono essere seminate al letto del paziente

ESAME COLTURALE

• I materiali campionabili sono seminati su terreni di coltura specifici: Bordet-

Jengou o, meglio, Regan-Lowe (RL) Medium (charcoal agar arricchito con

sangue defibrinato di cavallo e addizionato con cefalexina). sangue defibrinato di cavallo e addizionato con cefalexina).

• Le piastre vengono incubate a 37 °C in 5% CO2 per 10-12 giorni. Dal 3°- 4°

giorno si può apprezzare lo sviluppo di B. pertussis: colonie piccole,

grigiastre, traslucide, a "goccia di mercurio".

• Caratteristiche biochimiche: scarsissima reattività alle più comuni prove

biochimiche (assenza di crescita su agar sangue, motilità negativa, ureasi

negativa, produzione di nitrati negativa, ossidasi positiva) per cui l’ID delle

colonie viene confermata con antisieri specifici (test di agglutinazione).

Esame negativo: assenza di colonie di B. pertussis

Esame positivo: presenza di colonie di B. pertussis

Virus respiratorio sinciziale umano (RSV)Caratteristiche della malattia

40

Influenza

• Prevalente durante la stagione invernale

• Infezione virale (Orthomyxovirus)

• Glicoproteine di superficie

– Emoagglutinina (HA):

• specifici epitopi si legano ai residui di acido sialico sulle cellule della mucosa respiratoria

41

della mucosa respiratoria

• soggetta a cambiamenti (antigenic drift, shift)

• causa l’agglutinazione dei globuli rossi

– Neuraminidasi (N):

• cliva i residui di acido sialico

presenti nel muco, favorendo la

liberazione dei virioni

• soggetta a cambiamenti

(antigenic drift, shift)

Il fenomeno “antigenic shift” (deriva

antigenica) consiste in uno scambio di

sequenze geniche, codificanti per

glicoproteine virali, tra differenti virus

influenzali (co-infezione del maiale con

virus aviario ed umano), portando alla

formazione di un virus ricombinante

42

formazione di un virus ricombinante

dotato di caratteri antigeni non più

riconosciuti dalla risposta anticorpale

dell’ospite.

E’ responsabile di fenomeni pandemici.

Diagnosi di influenza umana

CAMPIONI RESPIRATORI

• Tamponi nasali ed aspirati naso-faringei, maggiormente

sensibili vs tampone faringeo.

• Aspirato tracheale e lavaggio bronchiale, nei pazienti • Aspirato tracheale e lavaggio bronchiale, nei pazienti

intubati

• Raccogliere i campioni entro i primi 4 giorni dalla

comparsa dei sintomi (resa maggiore)

CAMPIONI EMATICI

• I campioni di sangue sono raccolti nella fase acuta e

convalescente della malattia (intervallo 14-21 gg) per

dimostrare un aumento significativo (almeno 4-fold) dei

livelli anticorpali specifici43

Aspirato naso-faringeo


• Invitare il paziente ad una posizione supina

• Inondare la cavità nasale con 3-5 ml soluzione fisiologica

• Aspirare delicatamente la soluzione di lavaggio mediante • Aspirare delicatamente la soluzione di lavaggio mediante

pompetta, siringa o catetere

• Ripetere l’operazione nell’altra narice


• Mantenere i campioni refrigerati

• Inviare al laboratorio il prima possibile (non oltre le 24h)


SIGNIFICATO CLINICO DELLA DIAGNOSI

• Diagnosi rapida importante se prevista terapia precoce

con farmaci antivirali costosi (pz con rischio elevato di

gravi complicanze)gravi complicanze)

– la diagnosi di influenza nel soggetto anziano allerta il

clinico per il rischio di complicanze infettive batteriche

(S. aureus, H. influenzae, S. pneumoniae)

• Controllo delle infezioni nosocomiali (riduzione della

diffusione dell’infezione tra pazienti e da personale

sanitario a pazienti ad alto rischio)

• Valore prognostico nei giovani adulti, nei quali la malattia

ha un decorso breve e benigno45


TESTS DIRETTI (tipizzazione di influenza virus: A / B)

• Test di immunofluorescenza (IF) diretta/indiretta

– Ag virali rivelati da Ab fluorescinati (diretta) o da Ab

anti-Ig fluorescinati (indiretta)

– Influenzati dalla quantità di cell. epiteliali nel campione

46

• Tests immunoenzimatici (EIA)

– Ag virali rivelati da Ab legati ad un enzima in grado di far

virare il substrato cromogeno

– Rapidi (10-30 min), più costosi di IF


TESTS DIRETTI (tipizzazione di influenza virus: A / B)

• Isolamento virale

– In uova embrionate di pollo (altamente sensibile;

produzione di stock virali per monitoraggio

epidemiologico)

– In colture cellulari (cellule di rene di scimmia o di cane)

47

– In colture cellulari (cellule di rene di scimmia o di cane)

• evidenziazione effetti citopatici in 5-14 gg, mediante

emoadsorbimento od immunofluorescenza

– Maggiormente sensibile vs EIA, IF

• RT-PCR (real-time PCR)

– la tecnica più sensibile

– rapida (2-3 ore)

– può inoltre differenziare i sottotipi H ed N


TESTS INDIRETTI

• Esame sierologico

– Identificazione di Ab totali o classe-specifici (IgG, IgM,

IgA) mediante:

• Inibizione della emoagglutinazione

• Fissazione del Complemento

48

• Fissazione del Complemento

• EIA

• IF indiretta

– Positività in caso di aumento (≥ 4-fold) del titolo

anticorpale tra la fase acuta e quella di convalescenza

(14-21 gg tra i due prelievi)

– Utile per individuare soggetti con infezione recente

– Consente di valutare la risposta alla vaccinazione

Infezioni delle

Basse vie respiratorie

• Tubercolosi

• Polmonite

50

Tubercolosi

• Infezione batterica

– Mycobacterium tuberculosis

– Mycobacterium avian

51

• tubercolosi “disseminata” nei pazienti con AIDS

• Tipologie

– Primaria

– Secondaria

– Disseminata

M. tuberculosis

• Lenta crescita (tempo di generazione medio: 15-20 h)

• Acidi micolici e superficie cerosa

• Primaria– Tubercoli, caseosa, reazione alla tubercolina

• Secondaria (riattivazione)• Secondaria (riattivazione)– Consolidamento

• Disseminazione– TB extrapolmonare (linfonodi, rene, ossa, tratto genitale, cervello,

meningi)

52

Il tubercolo polmonare consiste in un granuloma formato da

un nucleo centrale di necrosi caseosa contenente batteri

all’interno di macrofagi giganti, e da una parete esterna

formata da fibroblasti, linfociti e neutrofili.

53

Diagnosi di tubercolosi

• FASE INIZIALE:

– Esame radiologico (raggi X)

– Test cutaneo (reazione alla tubercolina o di Mantoux)

• QUINDI:

– Colorazione Ziehl-Neelsen

– Metodiche rapide (IF) + coltura

Esame radiografico (raggi X): infezione tubercolare secondaria.

55

Test cutaneo per la tubercolosi: reazione alla tubercolina

56

Colorazione fluorescente per l’identificazione di

Mycobacterium tuberculosis.

57

Le colonie di M. tuberculosis hanno un caratteristico aspetto

granulare e ceroso, che permette al batterio di sopravvivere

all’interno di macrofagi.

58

Colorazione di Ziehl-Neelsen (acido-resistente) usata per

identificare Mycobacterium tuberculosis.

59

Caratteristiche della tubercolosi.

60

Polmonite

• Infezione:

– Batterica

– Virale

61

– Fungina

• Infiammazione del polmone con alveoli ripieni di fluido

• Acquisita in comunità

• Nosocomiale

Polmonite batterica

• Streptococcus pneumoniae

• Legionella

• Mycoplasma pneumoniae

62

• Mycoplasma pneumoniae

Streptococcus pneumoniae

• Pneumococco

• 2/3 delle polmoniti viene contratta in comunità

• Non può sopravvivere al di fuori del proprio habitat

63

habitat

• Alto rischio: anziani, stagionalità, presenza di infezione virale, diabete, consumo di alcool e/o stupefacenti

• Variabilità dell’antigene capsulare

• Consolidamento

S. pneumoniae. La colorazione di Gram rivela caratteristici

coppie cellulari. La coltura su agar sangue mostra alfa-emolisi.

64Streptococcus pneumoniae

Il consolidamento consiste nel blocco infiammatorio di

bronchioli ed alveoli, con formazione di essudato.

Polmonite batterica: consolidamento.

Legionella

• Infezione infrequente ma grave

• Sopravvive nell’habitat naturale (acqua di

rubinetto, sorgenti termali, ecc.)

66

rubinetto, sorgenti termali, ecc.)

• Malattia opportunistica

Legionella è un organismo intracellulare capace di

sopravvivere nelle amebe e nei fagociti umani.

67Legionella intracellulari

Mycoplasma pneumoniae

• Il più piccolo tra i batteri conosciuti

• Assenza di parete cellulare

• Walking pneumoniae – polmonite atipica

68

• Walking pneumoniae – polmonite atipica

Infezione virale

• Hantavirus

– Malattia emergente

– Sindrome respiratoria acuta

• Disseminazione ematica dell’antigene di Hantavirus

• Perdita di fluido dai vasi sanguigni

69

• Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-

associated Coronavirus

– Concentrata in Cina e sud-est asiatico

– Pochi casi in Australia, Canada e USA

– Sintomatologia similare a quella indotta da

influenzavirus e virus sinciziale respiratorio (RSV)

– Il genoma virale è stato interamente sequenziato

Infezione fungina

• Histoplasma capsulatum

– Causa la malattia di Darling (o febbre Ohio Valley)

– Manifestazione benigna: Benigna o grave, Acuta o cronica

– Intracellulare

70

– Pazienti affetti da AIDS sono ad alto rischio

– Endemica

• Pneumocystis jiroveci

– Già denominato Pneumocystis carinii

– Infezione opportunistica in pazienti con AIDS

– Intracellulare ed extracellulare

– Cianosi

PolmoniteDiagnosi microbiologica

TIPOLOGIA DEL CAMPIONE

– ESCREATO: per i campioni di escreato (almeno 1 ml) si richiede

che il materiale sia di provenienza dalle vie respiratorie inferiori

ottenuto con colpi di tosse profondi. Quando la tosse è secca,

possono essere utili la fisioterapia, il drenaggio posturale o

l’inalazione di un aerosol prima dell’espettorazione.

71

l’inalazione di un aerosol prima dell’espettorazione.

– LAVAGGIO BRONCOALVEOLARE (BAL - bronchoalveolar lavage):

Dopo inserzione di un broncoscopio flessibile si ‘lava’ con

soluzione fisiologica sterile (max quantità possibile) un segmento

polmonare, ottenendo in tal modo componenti cellulari e non-

della superficie della mucosa del tratto respiratorio inferiore.

– ALTRI CAMPIONI: campioni prelevati broncoscopicamente con

spazzolamento protetto, campioni da spazzolamento bronchiale

“cieco” e lavaggio broncoalveolare non diretto.



• I campioni devono essere trasportati e processati il più presto

possibile.

• L’escreato può essere refrigerato per 2-3 ore senza una perdita

apprezzabile dei patogeni. Qualsiasi ritardo oltre questo limite di

tempo può consentire la sovracrescita di bacilli Gram- e la mortalità

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tempo può consentire la sovracrescita di bacilli Gram- e la mortalità

di Haemophilus e S. pneumoniae.

• Quando il trasporto è difficoltoso, i campioni possono essere

refrigerati e seminati entro 48 ore dal prelievo, ponendo attenzione

all’interpretazione dei risultati.


La ricerca e l’isolamento di microrganismi responsabili di

polmonite dipendono da:

– Adeguatezza del campione delle basse vie respiratorie

– Assenza di contaminazione della flora del tratto respiratorio

superiore

– Utilizzo delle tecniche microscopiche e colturali

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– Utilizzo delle tecniche microscopiche e colturali

– Trattamenti antimicrobici recenti in corso

• La differenziazione fra colonizzazione tracheobronchiale e vera

infezione polmonare può risultare difficile.


La colorazione di Gram su campioni di escreato può essere utilizzata per:

1. verificare la qualità del campione:

– per le colture sono selezionati campioni purulenti (presenza di PMNs) e

non contaminati con cellule epiteliali squamose;

– gli escreati dei pazienti immunodepressi od ove sussistano difficoltà per

la ripetizione del campione non dovrebbero essere rifiutati.

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2. predire la probabilità di riscontro dei patogeni in funzione delle loro

caratteristiche morfologiche:

– il campione dovrebbe essere osservato prima della sua coltura;

– porre attenzione all’interpretazione del Gram, poiché l’uso di

antimicrobici può rendere non vitali i microrganismi osservati sul vetrino;

– può essere inappropriato identificare i microrganismi in caso di

grossolana contaminazione da flora orofaringea;

– la sensibilità del Gram può variare e spesso dipende da un nuovo

controllo soggettivo del vetrino;

– la colorazione Gram consente l’identificazione di ife di lieviti, ma è di

qualità inferiore rispetto all’idrato di potassio ed ai coloranti fluorescenti.


Coloranti fluorescenti

• Nella ricerca dei bacilli acido-alcool resistenti sono preferiti coloranti

quali auramina-fenolo perché più rapidi e sensibili rispetto allo Ziehl

Neelsen (Z-N). Gli strisci auramina positivi possono essere confermati

con una sovra-colorazione con Z-N.

• Calcofluor bianco, ed altri coloranti fluorescenti sono particolarmente

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• Calcofluor bianco, ed altri coloranti fluorescenti sono particolarmente

idonei per visualizzare le ife fungine. Sono lievemente più sensibili

delle colorazioni con KOH, e di lettura è più rapida. Forniscono inoltre

informazioni morfologiche più dettagliate rispetto ai coloranti KOH,

sufficienti a riconoscere i Mucorales (grandi ife non settate) da quelle

simil-Aspergillus (sottili, settate, con ramificazioni a 45°).

• I coloranti per Pneumocystis jiroveci, agente causale della polmonite

pneumocistica, sono per lo più fluorescenti.

• Può essere richiesta la microscopia in fluorescenza per Legionella.

Calcofluor white staining

Rhizopus Aspergillus

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Caratteristiche di polmoniti batteriche, virali e fungine

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Giovanni Di Bonaventura, Ph.D. · (Columbia CNA agar, contenente colistina ed acido nalidixico vs...

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