Biologia e genetica molecolare in ambito forense

Dott. Giorgio PorteraUfficiale in congedo CC RIS di Parma Biologo forense

Laboratorio di Biologia Forense

sperma,capelli capelli.) Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,capelli .) Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio) rt) Quantificazione (gel o rt) (multiplex multiplex) Amplificazione (multiplex) (310Tipizzazione (310-3130XL)

PROFILI GENETICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA DINAMICA DELITTUOSA

Ispezione dei reperti

Armi bianche per la ricerca di sangue

Armi da fuoco: tracce utilizzatore o vittima backs (back s pattern)

Ricerca di tracce ematiche da reperti ripuliti

Indumenti usati per travisare il viso,investigati per la ricerca di saliva e residui epiteliali

Ricostruzioni parentali da resti cadaverici o ossei

TEST GENERICI E DI SPECIEispezione Identificazione del tipo di fluido biologico in fase di ispezione TEST GENERICI combur test amilasi psa sangue (test colorimetrico)

saliva (test colorimetrico)

(immunocromatografico immunocromatografico) sperma (immunocromatografico)

immunocromatografici) TEST DI SPECIE (immunocromatografici) obti test: specifico per sangue di primate semelogenina: semelogenina: specifico per sperma umano

Test COMBUR TEST - Combur3 TestE (ROCHE)Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine e eritrociti sostanza: tetrametilbenzidina il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza attivit dell di attivit perossidasica dellemoglobina H3C CH3 H2N FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali, ruggine, ossidanti vari, ecc. CH3 CH3 NH2

COMBUR TEST - Combur3 TestE (ROCHE) Combur3

AMILASI TESTtest per diagnosi clinica della pancreatite acuta sostanza: 2-cloro2-cloro-4-nitrofenolo legato a

maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce l con l-amilasi della saliva,in presenza di saliva si colora di giallo FALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporei

AMILASI TEST

PSA TEST test per diagnosi clinica del tumore alla prostata, delliperplasia dell

(bph bph) prostatica benigna (bph) e delle infezioni alla prostata; saggio dell immunologico semiquantitativo per la determinazione dellantigene specifico prostatico nel sangue, siero e plasma sostanza: anticorpi anti antigene psa coniugati a oro colloidale sostanza: utilizzato per identificare tracce di sperma falsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionali anticoncezionali falsi

TEST SPECIFICIOBTI TEST - HEXAGON OBTI (HUMAN) : anticorpi anti hb umani coniugati a particelle cromogene (blu) utilizzato per la diagnosi specie - specifico per il sangue dei primati superiori.

(TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano ( semelogenina, semelogenina proteina secreta in vescicole seminali)

FINESTRA DI CARICAMENTO

FINESTRA DI LETTURA

BANDA DEL CONFRONTO QUANTITATIVO BANDA DEL TEST BANDA DEL CONTROLLO

ANTIGENE

ANTICORPI ANTI-ANTICORPI ANTICORPO MOBILE IMMOBILIZZATI

COMPLESSO ANTIGENEANTICORPO

IL COMPLESSO MIGRA

LA BANDA DEL TEST SI ACCENDE: ESITO POSITIVO

LAMPADA CRIMESCOPElampada con luce a lunghezza (415d onda variabile (415-650 nm) Principio: differente emissione assorbimento tra fluidi biologici e substrati

SLIP con tracce di sperma

FODERA di una giacca con tracce di sudore

Aree luminescenti Crimescope C16

Aree positive al dell test dellAmilasi

Esempio di un reperto con numerose aree luminescenti

22R

22 O

22Q

22N

22P

22I

22L

22M

Luminollenergia reazione di chemioluminescenza: l energia proviene dallossidazione dellemoglobina dall ossidazione dell emoglobina

Le reazioni di chemioluminescenza del luminolo che avvengono in una soluzione basica generano un intermedio energeticamente ricco con conseguente dell 3emissione di luce da parte dellacido 3-aminoftalico . Per ottenere chemioluminescenza dal luminolo in una soluzione acquosa serve un reagente ossidante come il perossido di idrogeno

La CATALISI avviene con la presenza di ioni metallici del tipo: Fe (III) o Cu (II), o da enzimi come la perossidasi Ferro emoglobina

Ricostruzione dinamica delittuosa tramite luminol

Tracce latenti di piedi sporchi di sangue27

La stessa area sottoposta al test del luminol

Impronte di piedi insanguinati

Impronte di piedi rilevate con il luminol

Utilizzo del luminol per unindagine d omicidio scomparsa di un individuo e successivo rinvenimento del cadavere sezionato in un cascinale lautopsia stabilisce che la morte stata causata da numerose coltellate inflitte alladdome con l ipotesi di un omicidio passionale ed i fatti pregressi (interessi per la stessa donna) si indaga un individuo. perquisizione dellabitazione indagato perquisizione dellabitazione vittima prima ispezione autovettura NEGATIVA NEGATIVA NEGATIVA

Interno auto

Bagagliaio

Visione bagagliaio sotto tappeto NEGATIVA

Visione bagaglio sotto ruota di scorta NEGATIVA

Fondo bagagliaio

Ipotesi dinamica delittuosa

ESTRAZIONE DEL DNA FENOLO-CLOROFORMIO solventi organici immiscibili con acqua: FENOLOsi formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella organica RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA DNA affine alla resina, rimane legato nella membrana della colonna, successivamente viene eluito RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE stessa chimica del precedente metodo, ma la resina libera in soluzione. Viene poi recuperata con un magnete e il DNA eluito RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del pH della soluzione

ESTRAZIONE CON RESINA MAGNETICA

resina +

metodo di estrazione del DNA che ne sfrutta la carica negativa metodica veloce e modulabile a seconda del tipo (possibilit possibilit di traccia (possibilit di aumentare il numero dei lavaggi, estrazione da diversi volumi) volumi) estrazione automatizzabile

DNA -

DNA -

resina -

AUTOMAZIONE ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA L ATTRAVERSO LUTILIZZO DI (MICROROBOT (MICRO-PIPETTATORI) dall uniche fasi compiute dalloperatore: posizionamento dei campioni e reagenti

VANTAGGI possibilit di estrarre in meno di 2h possibilit fino a 96 tracce riduzione rischio di errori riduzione dell delloperatore alta precisione nel dosaggio dei alta reagenti

CODICE A BARRE

TRACCIABILIT TRACCIABILIT DEI CAMPIONI possibilit di poter attribuire un possibilit

indicativo (codice a barre classico o bidimensionale) dalla prima fase del prelievo della traccia alla dell conservazione dellestratto i codici delle diverse fasi di lavorazione (ispezione, estrazione ) vengono collegati attraverso lettori otticiCOLLEGAMENTO CON LETTORE OTTICO

QUANTIFICAZIONE fase fondamentale per la traccia forense (spesso priva di storia) storia)COSA SI ESTRATTO e QUANTO DNA USARE per amplificare;

QUANTIFICAZIONE CON REAL TIME

valutazione di una eventuale inibizione attraverso lamplificazione l dell contemporanea di 2 DNA: templato dellestratto e IPC ;

importanza dellIPC nella lettura dell della quantificazione dei campioni qualit per valutare la qualit del DNA estratto (eventuale PURIFICAZIONE)

INIBIZIONE: non possibile valutare la presenza o assenza di DNA

PURIFICAZIONE

Amplificazione: Primers per STRLocus STR

dal web

AMPLIFICAZIONEcaratteristiche di un marcatore forense

Amplificare e tipizzare lintero genoma sarebbe l improponibile per costi e tempo Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori con le seguenti caratteristiche 1. POLIMORFICI anche in popolazioni isolate (lo stesso marcatore deve presentare diverse varianti nella popolazione) 2. STABILI alle mutazioni (importanza della scelta dei primer) 3. EQUILIBRIO con la legge di Hardy-Weinberg 4. INDIPENDENTI

Repeat) Microsatelliti STR (Short Tandem Repeat)

STRUTTURA DI UN STR

...ACAGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGT.. GATA la sequenza del core-repeat Il microsatellite in questione tetranucleotidico Le varianti (alleli hanno un numero diverso di repeat alleli) alleli 8 ripetizioni ...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT... 9 ripetizioni ...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT... 10 ripetizioni ...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...

SCELTA DEGLI STR Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 specifici marcatori STR, denominati Loci Codis

TPOX D3S1358 D8S1179 D7S820 TH01 VWA

D5S818 FGA CSF1PO

AMEL D13S317 D16S539 D18S51 D21S11

AMEL

MULTIPLEX I 13 loci Codis vengono amplificati in ununica reazione di PCR, un spesso con aggiunta di altri loci per aumentarne il potere discriminante gli attuali kit di amplificazione caratterizzano (Multiplex Multiplex) contemporaneamente 15 loci STR (Multiplex) le attuali multiplex permettono di amplificare concentrazioni di pg/ estratto inferiori ai 50 pg/l DNA nucleare cellula diploide ~ 6 pg, 50/6= 8 cellule/l pg,

20 cellule x reazione!!!

TIPIZZAZIONE I frammenti vengono separati e caratterizzati tramite elettroforesi capillare utilizzando un sequenziatore automatico (310, 3100, 3130XL), leggendo i segnali dei diversi DYE che discriminano i frammenti overlappantiRAW DATA DATO GREZZO

PROFILO GENETICO ELABORATO

Per convenzione gli alleli degli STR vengono chiamati in base al numero di repeat

NOME DEL MARCATORE

POTENZIALI ALLELI; IDENTIFICATI CON IL NUMERO DI RIPETIZIONI DEL CORE REPEAT

IDENTITA IDENTITA

un profilo secondo gli standard FBI (codis) e formato da 13 marcatori un (codis e codis) poniamo che ogni marcatore presenti alleli la cui frequenza e pari a 0,1 poniamo e nella popolazione di riferimento poniamo che ogni marcatore presenti lo stesso allele su entrambi i poniamo cromosomi (omozigosi) la probabilita di ottenere la combinazione data per ogni marcatore e pari a la probabilita e 0,1*0,1=0,01 la probabilita di ottenere la combinazione data per tutto il profilo e la probabilita e 0,01*0,01* 0,01*0,01*0,01 (13 volte) ovvero 10-26, 1 su milioni di miliardi di miliardi di individui.. individui..

IL PROFILO PUO ESSERE RITENUTO UNICO

VIOLENZA SESSUALEReperti Foto vetrino

indiziato

tampone vaginale

vittima

sperma vestaglia

indiziato

tampone vaginale

vittima

vestaglia

indiziato

tampone vaginale

vittima

vestaglia

indiziato

tampone vaginale

vittima

vestaglia

Nuove applicazioni in biologia forense

Studio DNA degradato ( tracce stressate e residui epiteliali) (tracce stressate

Ricerca mRNA su tracce forensi

giorgioportera@libero.it