Genetica molecolare

Genetica molecolare: indaga i meccanismi chimici che permettono l’espressione delle informazioni genetiche in un individuo e la trasmissione dei caratteri ereditari da un individuo ai propri discendenti.

L’unità base dell’eredità è il gene, definito come il tratto di DNA responsabile della determinazione di un dato carattere.

Nucleotidi

Un nucleotide è formato da una molecola di H3PO4, legata a uno zucchero pentoso (ribosio, RNA; 2-desossiribosio, DNA) legato a sua volta ad una base eterociclica azotata.

Zucchero e base azotata sono legati tramite l’atomo di azoto e il carbonio anomerico dello zucchero (C1).

Le basi si dividono in due gruppi:

- Pirimidine: citosina ( C) , timina (T), uracile (U)- Purine: adenina (A) , guanina (G).

Struttura del DNA

Il DNA è un polimero lineare di nucleotidi, formato da due filamenti avvolti a elica intorno a un asse centrale. Ogni filamento è formato da uno scheletro di molecole di zucchero e gruppi fosfati alternati.

I due filamenti sono uniti da legami a idrogeno tra le basi azotate che si fronteggiano nella doppia elica. Queste non si appaiano casualmente: la distanza tra i due filamenti è costante (3,4 A) , per cui l’appaiamento ha luogo necessariamente tra una purina e una pirimidina.

Le basi appaiate sono dette complementari, in particolare:

- L’adenina si appaia con la timina- La guanina si appaia con la citosina

Con legami a idrogeno.

Ogni filamento ha un’estremità 5’ e un’estremità 3’ che si fronteggiano, i due filamenti sono quindi antiparalleli.

Replicazione del DNA

Ha luogo prima che la cellula si divida, i due filamenti si separano grazie alla rottura dei legami idrogeno tra le basi e ciascuno di essi funziona come stampo per la sintesi di un nuovo filamento a esso complementare, utilizzando i desossiribonucleotidi liberi presenti nella cellula.

Replicazione semiconservativa: ognuna delle due molecole figlie di DNA è costituita da un filamento del DNA parentale (conservato) e un filamento sintetizzato ex novo.

L’intero processo richiede energia e molti enzimi.

La DNA-elicasi “srotola” la doppia elica nel punto di origine di replicazione, detto forcella.

Un gruppo di enzimi noto come DNA-polimerasi catalizza e avvia la vera e propria sintesi del nuovo filamento. Il processo avviene nel nucleo negli eucarioti, nel citoplasma nei procarioti.

Oltre ad aggiungere nuovi nucleotidi, la DNA-polimerasi riesce ad individuare eventuali errori. Nel caso di aggiunta di un nucleotide sbagliato, l’enzima inverte la sua direzione di marcia rimuovendo i nucleotidi uno a uno fino ad arrivare all’errore.

Altri enzimi, chiamati nucleasi di restauro del DNA, hanno il compito di eliminare eventuali errori rimasti dopo la replicazione, andando semplicemente a sostituire i nucleotidi sbagliati con quelli corretti.

Ognuno dei due filamenti può fare da stampo per la sintesi dell’altro. Si dice quindi che una doppia elica di DNA reca lo stesso messaggio su entrambi i filamenti.

L’ipotesi un gene-un enzima

Come può il DNA definire lo sviluppo e la fisiologia di una cellula? Sono stati effettuati studi su microrganismi biochimicamente mutati, con mutazione si intende un cambiamento nell’informazione genetica di un organismo.

Studiando mutanti della muffa del pane, due studiosi dimostrarono l’esistenza per ciascuna mutazione di un corrispondente enzima funzionante in modo anomalo.

1941, ipotesi un gene- un enzima, cioè un gene è responsabile della sintesi di un determinato enzima.

Ipotesi modificata in un gene.-una proteina, dal momento che non tutte le proteine, la cui sintesi è controllata dal DNA, sono enzimi.

Ulteriori esperimenti confermarono che le proteine sono formate da catene polipeptidiche, la formulazione originale viene quindi corretta in un gene – una catena polipeptidica.

Il ruolo dell’RNA

Come può un gene, contenuto nel nucleo e formato da una sequenza costituita da solo quattro nucleotidi, dare origine a una catena polipeptidica, sintetizzata nel citoplasma e costituita da una sequenza di venti tipi di amminoacidi?

Il passaggio dai geni alle proteine è reso possibile dall’RNA, un acido nucleico diverso dal DNA ma anch’esso formato da una sequenza lineare di nucleotidi.

Il messaggio contenuto in un gene viene copiato (trascritto) sotto forma di RNA nel nucleo.

L’RNA si trasferisce poi nel citoplasma, dove il messaggio che esso trasporta viene usato per sintetizzare una proteina nel processo di traduzione.

Il flusso dell’informazione biologica va dunque sempre dal DNA all’RNA, alle proteine.

Questa sequenza è definita come dogma centrale della biologia molecolare, che ammette un’eccezione:

l’enzima trascrittasi inversa, presente in alcuni virus a RNA, permette la sintesi di un filamento di DNA a partire da una molecola di RNA.

Struttura e funzione dell’RNA

- È un filamento singolo- Lo zucchero pentoso è il ribosio anziché il 2-desossiribosio

- Contiene quattro basi azotate, (A,U e G,C)- Negli eucarioti l’RNA è sintetizzato nel nucleo, ma svolge le sue funzioni nel citoplasma

Ne esistono tre tipi:

- RNA messaggero ( m RNA ) : trasporta l’informazione genetica dal DNA al citoplasma, dove vengono sintetizzate le proteine

- RNA ribosomiale ( r RNA ) - RNA di trasporto ( t RNA ) : trasporta gi amminoacidi liberi nel citoplasma ai ribosomi e serve per

tradurre l’informazione contenuta nella sequenza di nucleotidi dell’m RNA in una sequenza di amminoacidi.

Trascrizione

L’informazione contenuta in un gene viene copiata in una molecola di m RNA. La sintesi dell’m RNA è catalizzata dall’ RNA-polimerasi.

Nel punto di attacco dell’enzima, i due filamenti del tratto di DNA corrispondente a un gene/un gruppo di geni si aprono e uno di essi funziona da stampo per la sintesi di una molecola di m RNA, con un processo simile a quello della replicazione.

L’RNA-polimerasi si muove lungo il filamento stampo di DNA aggiungendo via via ribonucleotidi all’estremità 3’. Si dice infatti che la trascrizione avvenga in direzione 5’ 3’ .

Per iniziare la sintesi l’RNA-polimerasi si lega a una sequenza specifica sul DNA, detta promotore; un’altra sequenza specifica, detta segnale di terminazione, indica il punto di arresto della trascrizione.

È un processo che avviene nel nucleo e l’m RNA deve essere modificato prima di migrare nel citoplasma.

Quasi tutti i geni degli eucarioti pluricellulari sono discontinui, formati da un’alternanza di sequenze codificanti (esoni) e non codificanti (introni). Il DNA di un gene discontinuo viene trascritto completamente, copiando sia esoni che introni, ma prima che l’m RNA lasci il nucleo gli introni vengono eliminati e gli esono saldati in sequenza per formare l’m RNA maturo (splicing).

Il codice genetico.

È un sistema di corrispondenza che permette la traduzione del messaggio contenuto nell’m RNA in una proteina. È basato su triplette di nucleotidi, dette codoni, che rendono possibili 64 combinazioni, piu che sufficienti per codificare i 20 amminoacidi.

Presenta le seguenti caratteristiche:

- Contiene un segnale di inizio, rappresentato dal codone AUG (codifica metionina)- Contiene segnali di fine lettura, o codoni stop (non senso) (UUA, UAG,UGA)- Non è ambiguo, un dato codone specifica sempre un unico amminoacido- È ridondante, quasi tutti gli amminoacidi sono specificati da più di un codone. L’isoleucina è

codificata dai codoni AUU, AUC, AUA (codoni sinonimi, rappresentano una difesa nei confronti delle mutazioni)

- è universale, valido per tutti gli organismi con pochissime eccezioni (DNA mitocondriale, UAA, UAG in un piccolo gruppo di protisti codificano per l’amminoacido glutammina, anziché essere codoni di stop)

Sintesi proteica (traduzione)

È l’ultima tappa del processo di espressione di un gene. Avviene nel citoplasma e ha sede sui ribosomi.

Al processo partecipano tutti e tre i tipi di RNA: m RNA porta il messaggio, r RNA che è parte integrante del ribosoma, t RNA fa da interprete traducendo il linguaggio degli acidi nucleici in proteine.

Questa molecola riconosce i codoni dell’m RNA grazie a una tripletta di nucleotidi, l’anticodone, complementare a uno specifico codone sull’m RNA, e lega inoltre i vari amminoacidi.

I t RNA sono molecole formate da circa 80 nucleotidi, con struttura a trifoglio.

Ogni cellula ne contiene almeno un tipo per ogni amminoacido, il legame fra t RNA e lo specifico amminoacido è catalizzato da uno specifico enzima, amminoacil-t RNA-ligasi.

I ribosomi possiedono tre importanti siti di legame: uno per l’m RNA, e due per il t RNA: il sito P (peptidico) e il sito A (amminoacilico).

La sintesi proteica avviene in tre fasi:

- inizio: l’estremità 5’ dell’m RNA si lega alla subunità minore del ribosoma. A questo complesso si legano poi la subunità maggior e del ribosoma e il primo t RNA legato al suo specifico amminoacido (amminoacil-t RNA) che si appaia con il suo anticodone al codone di inizio e va a occupare il sito P.

- allungamento: inizia con l’aggiunta nel sito A di un amminoacil – t RNA con un anticodone complementare a quello del secondo codone dell’m RNA. A questo punto si forma il legame peptidico tra i primi due amminoacidi e contemporaneamente il t RNA che occupava il sito P esce dal ribosoma.Il ribosoma si sposta quindi in un codone lungo l’m RNA in modo che il secondo t RNA con i due amminoacidi attaccati vada ad occupare il sito P. nel sito A tornato libero si porta un terzo amminoacil-t RNA e si forma un nuovo legame peptidico. L’operazione si ripete più volte legando gli amminoacidi uno dopo l’altro secondo la specifica sequenza contenuta nell’m RNA che dirige la sintesi, fino a che la catena polipeptidica è completa.Il sito P accetta di volta in volta il t RNA che lega la catena polipeptidica in crescita, mentre il sito A è sempre occupato dal t RNA legato al nuovo amminoacido che andrà ad aggiungersi alla catena.

- Quando il ribosoma arriva a uno dei tre codoni di stop, a cui non corrisponde nessun t RNA, si ha la terminazione dove la traduzione si interrompe, la proteina si stacca dal t RNA che abbandona il sito P e le due subunità del ribosoma si dissociano.

Mutazioni geniche

Sono cambiamenti del patrimonio ereditario; le mutazioni geniche interessano un singolo gene. Sono dovute a errori che possono verificarsi durante la replicazione e che, se non corretti, determinano un’alterazione della sequenza dei nucleotidi nel DNA.

Le mutazioni che interessano un singolo nucleotide sono dette puntiformi. Queste possono comportare la sostituzione o la perdita, o l’aggiunta di un nucleotide.

La perdita e l’aggiunta di un nucleotide hanno come effetto lo spostamento della griglia di lettura (frame-shift), in modo da alterare tutto il filamento polipeptidico a valle della mutazione; producono in sostanza una proteina completamente priva di attività biologica.

La sostituzione può portare semplicemente alla produzione di un codone sinonimo, e in questo caso sarà una mutazione silente, oppure:

- Mutazione missenso: da origine a un codone che codifica un amminoacido diverso da quello originario

- Mutazione non senso: da origine a uno dei tre codoni di stop che segnano l’arresto della sintesi della proteina. Anche le mutazioni non senso, come le mutazioni frame-shift, hanno effetti gravissimi.

L’emoglobina è formata da quattro subunità: due alpha e due beta. L’anemia falciforme è un esempio di mutazione missenso del gene della catena beta che comporta la sostituzione di un solo amminoacido (valina anziché acido glutammico) ed è una malattia che porta all’aggregazione delle molecole di emoglobina, che deformano i globuli rossi rendendoli fragili.

In base al rapporto che la mutazione ha col tasso di sopravvivenza dell’individuo può essere: vantaggiosa, svantaggiosa o neutra.

Oltre alle mutazioni geniche possono verificarsi mutazioni cromosomiche e mutazioni genomiche, quando riguardano rispettivamente un cromosoma o l’intero patrimonio genetico (spesso incompatibili con la vita).

Agenti mutageni

Pur essendo eventi spontanei, la frequenza delle mutazioni è aumentata da fattori chimici o fisici, detti agenti mutageni. Sono mutageni fisici i raggi uv, i raggi x, raggi gamma alpha e beta.

Sono mutageni chimici pesticidi e diserbanti.

Soltanto le mutazioni che interessano i gameti possono essere trasmesse alle generazioni successive.

Regolazione dell’espressione genica.

Ogni cellula svolge le sue attività in modo economico e coordinato, traducendo in proteine solo i geni necessari a seconda delle circostanze.

Organismi procarioti

La regolazione dell’espressione genica avviene a livello della trascrizione, vengono trascritti in m RNA solo i tratti di DNA corrispondenti alle sequenze geniche che devono essere tradotte in proteine.

La trascrizione è controllata da proteine di regolazione, controllate da geni regolatori.

Questa proteina può agire da repressore (quando si lega al DNA bloccando la trascrizione del gene) oppure da promotore (quando facilita l’attacco dell’RNA-polimerasi al promotore e quindi la trascrizione del gene).

Nei procarioti, la mancanza di nucleo, determina efficienza e semplicità per cui la trascrizione è strettamente legata alla traduzione e l’m RNA inizia ad essere tradotto dai ribosomi prima ancora che la sua sintesi venga terminata.

L’elemento fondamentale nella regolazione genica dei procarioti è quello dell’organizzazione dei geni in operoni: operone è un complesso di geni che vengono regolati in modo strettamente coordinato.

Costituito da un promotore, il sito di attacco dell’RNA-polimerasi, un operatore, che è una sequenza di basi e regola l’espressione dei geni strutturali, che interagisce con una proteina repressore o attivatore a seconda che impedisca o stimoli l’espressione, codificata da un gene regolatore.

Sono noti due tipi di operoni.

- Inducibili: normalmente non espressi, la loro trascrizione richiede la presenza di un induttore che inattiva il repressore. In un operone inducibile, il repressore è normalmente legato all’operatore, impedendo all’RNA-polimerasi di legarsi al promotore per iniziare la trascrizione. Quando l’induttore si lega al repressore cambiandone la conformazione, questo complesso si stacca dall’operatore rendendo possibile il legame dell’RNA-polimerasi al promotore e di iniziare la trascrizione.

Es. operone IAC

Il batterio e. coli possiede un meccanismo di controllo che consente l’espressio di alcuni geni solo quando ne avverte il bisogno, e impedisce la produzione di enzimi e proteine non strettamente necessarie.

Lo zucchero più adatto al metabolismo di E. Coli è il glucosio, tanto che se il batterio cresce in un substrato che contiene sia Lattosio che Glucosio, questo utilizza prima unicamente il glucosio e solo successivamente il lattosio. Una volta esaurite le riserve di glucosio però sintetizza immediatamente gli enzimi necessari a metabolizzarlo. Questo zucchero funge da induttore, legandosi al repressore, inattivandolo; l’RNA-polimerasi può così legarsi al promotore e trascrivere i tre geni dell’operone in blocco, formando un’unica molecola di m RNA (LacZ, codifica per l’enzima B-galattosidasi, scinde il lattosio in glucosio e galattosio; LacY, codifica per la lattosio-permeasi, consente al lattosio di attraversare la membrana cellulare del batterio; LacA). Il batterio possiede un meccanismo di controllo che consente l’espressione di alcuni geni solo sotto sollecitazione ambientale, e ne impedisce la produzione quando non necessario.

- Reprimibili, normalmente espressi, tranne quando è presente un corepressore che attiva il repressore impedendo all’RNA-polimerasi di trascrivere i geni strutturali dell’operone.

Operone trp

Codifica gli enzimi deputati alla sintesi dell’amminoacido triptofano in E. Coli. In assenza di trp l’operone è attivo e i geni degli enzimi necessari vengono trascritti. Quando il triptofano è presente nel terreno di coltura, si lega al repressore fungendo quindi da corepressore attivandolo in modo da bloccare la trascrizione.

Regolazione espressione genica negli eucarioti

Il materiale genetico degli eucarioti, non è organizzato in operoni, ma da geni discontinui, esoni e introni. Inoltre, se nei procarioti il controllo dell’espressione genica serve sostanzialmente per produrre proteine necessarie per utilizzare i nutrienti disponibili nell’ambiente, negli eucarioti è indispensabile per il differenziamento cellulare. Tutte le cellule dell’organismo pluricellulare derivano dallo zigote, che dividendosi ripetutamente per mitosi, forma l’individuo adulto.

Nel corso dello sviluppo embrionale, le cellule si differenziano, producendo proteine diverse che ne caratterizzano la struttura e la funzione.

Anche se tutte le cellule di un organismo contengono l’intero programma genetico, cioè sono geneticamente equivalenti , il differenziamento dipende dal fatto che ogni cellula esprime soltanto i geni che codificano per le sue proteine caratteristiche.

Gli eucarioti possono regolare l’espressione genica controllando i diversi processi che permettono la traduzione del messaggio genetico in proteine.

- Controllo conformazionale della cromatina:la cromatina si presenta in due forme; eucromatina, poco condensata ed eterocromatina, più condensata. Ad essere trascritta è l’eurocromatina, più accessibile come stampo.

- Controllo della trascrizione:la trascrizione selettiva dei geni è il principale meccanismo di regolazione dell’espressione genica: questo controllo coinvolge proteine regolatrici che si legano a siti specifici sulla molecola di DNA. L’RNA-polimerasi si lega a un promotore; la trascrizione dipende anche dalla presenza di particolari sequenze dette enhancer (intensificatori) che aumentano la velocità di sintesi dell’RNA. Analogamente, è controllata anche dai silencer (inibitori) che ne inibiscono la trascrizione. Sono coinvolte anche proteine regolatrici, o fattori di trascrizione, che si legano al DNA in corrispondenza degli enhancer e dei silencer che possono fungere da attivatori o inibitori.

- Controllo della maturazione e del trasporto dell’RNA Quasi tutti i geni degli eucarioti pluricellulari sono discontinui, formati da un’alternanza di sequenze codificanti (esoni) e non codificanti (introni). Il DNA di un gene discontinuo viene trascritto completamente, copiando sia esoni che introni, ma prima che l’m RNA lasci il nucleo gli introni vengono eliminati e gli esoni saldati in sequenza per formare l’m RNA maturo (splicing) che migrerà nel citoplasma, mentre l’m RNA non maturo resta nel nucleo e verrà poi degradato.

- Controllo della traduzione:avviene tramite il legame dell’m RNA a proteine inibitrici presenti nel citoplasma, che impediscono il legame col ribosoma.

- Controllo delle modificazioni post-traduzionali:una volta sintetizzate, le catene polipeptidiche vengono modificate per determinarne l’attivazione e la loro durata di vita nella cellula.

Epigenetica

Riguarda i meccanismi di controllo dell’attività genica che non alterano la sequenza dei nucleotidi, interessano principalmente la regolazione dell’attività dei genomi.

Un importante meccanismo epigenetico è dato dalla condensazione della cromatina, che coinvolge diverse modifiche epigenetiche. Una di queste è la metilazione che agisce direttamente a livello del DNA (metilazione di alcuni nucleotidi N + CH3, la metilazione silenzia i geni).

Un importante meccanismo epigenetico è la condensazione della cromatina, processo che coinvolge diverse modifiche epigenetiche: una di queste, la metilazione, agisce direttamente a livello del DNA; altri meccanismi agiscono sugli istoni o sugli enzimi che regolano queste proteine.

Le modifiche epigenetiche influiscono su molti aspetti della biologia cellulare e hanno un ruolo importante in alcune patologie dell’uomo. Attualmente si ritiene che questi meccanismi siano coinvolti nello sviluppo embrionale, nella differenziazione delle cellule staminali, nell’origine dei tumori e nell’attività del sistema immunitario. È noto inoltre che l’epigenetica controlli la fioritura e lo sviluppo del seme nella pianta.

Tecnologie del DNA

L’ingegneria genetica comprende i metodi che permettono di modificare in modo mirato il patrimonio genetico di un organismo.

Per ottenere brevi tratti di DNA contenenti i geni che si vogliono studiare, si impiegano enzimi di restrizione, in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche, dette siti di restrizione, formate da 4-8 coppie di basi.

Per separare e analizzare i frammenti di DNA si usa l’elettroforesi su gel. Si pone il campione trattato con l’enzima (o la miscela) di enzimi di restrizione a un’estremità di una piastra ricoperta di gel (agarosio, poliacrilammide..), poi si applica un determinato voltaggio ai due lati della piastra gelificata.

I frammenti di DNA (carichi negativamente) migrano verso l’elettrodo positivo a una velocità inversamente proporzionale la loro lunghezza, ostacolati dalla matrice del gel.

Dopo alcune ore i frammenti di DNA si distribuiranno in diverse bande, ognuna contenente frammenti di lunghezza simile. Le bande sarebbero invisibili, sul gel, ma vengono rese evidenti trattando il campione con coloranti che si legano al DNA e lo rendono fluorescente, oppure con un isotopo radioattivo del fosforo che entra nella composizione dei nucleotidi.

Trattando un tessuto con un certo enzima di restrizione si ottengono sempre gli stessi frammenti di DNA.La presenza di frammenti di lunghezza diversa indica un’anomalia nel DNA, spesso correlabile a mutazioni genetiche; una mutazione può modificare o eliminare un sito di restrizione. I frammenti di lunghezza diversa vengono ricercati per diagnosticare alcune malattie genetiche.

Il progetto più importante è quello dell’identificazione di tutti i geni umani, della loro sequenza, della loro localizzazione sui cromosomi. I risultati attesi dall’analisi del genoma umano sono le definizioni delle correlazioni fra determinate patologie e specifiche alterazioni genetiche. Questa conoscenza renderebbe molto più facile l’individuazione e la cura di numerose malattie.

Il progetto genoma umano consiste nella mappatura dell’intero genoma umano che ha fornito un primo set di risultati nel 2001, ancora in elaborazione. La stima del numero dei geni umani è di 25.000 contro le previsioni di 100.000 circa. Ora che il genoma è stato mappato, l’obiettivo è di identificare i diversi geni, i loro meccanismi di regolazione, quali proteine controllano e le loro funzioni.

La proteomica è la disciplina che si occupa dello studio di funzioni e struttura di tutte le proteine codificate dal genoma umano.

La bioinformatica riguarda l’archiviazione, analisi e confronto fra sequenze di DNA di organismi diversi, realizzata con computer.

Clonaggio di un gene

La produzione di una sostanza attraverso l’ingegneria genetica si articola in 5 tappe:

- Isolamento del genere che codifica la proteina che si vuole produrre- Costruzione del DNA ricombinante, cioè inserimento del gene che interessa nel DNA “vettore”- Introduzione del DNA ricombinante in una cellula ospite che si moltiplichi attivamente- Clonaggio del gene, cioè produzione di numerose copie del gene grazie alla proliferazione della

cellula ospite e produzione della proteina- Recupero e purificazione della proteina.

La tecnica del DNA ricombinante è possibile grazie all’universalità del codice genetico che permette all’organismo ospite di leggere e tradurre, oltre al proprio DNA, anche quello di un qualsiasi altro organismo.

La produzione del DNA ricombinante è resa possibile dagli enzimi di restrizione.

Un frammento di DNA tagliato con un determinato enzima può unirsi ad un altro frammento di DNA tagliato con lo stesso enzima perche le due porzioni hanno estremità adesive complementari.

Le estremità possono essere saldate da un altro enzima, DNA – ligaqsi .

Usando un opportuno enzima di restrizione e la DNA ligasi è possibile dunque inserire qualsiasi tratto di DNA, preparato artificialmente o isolato da un organismo, nel DNA di un organismo diverso, ottenendo un DNA ricombinante.