FERMENTAZIONI IN COLTURA SOLIDA (Solid State Fermentation - SSF)

SSF (Solid State Fermentation):

Processo fermentativo allestito impiegando materie prime solide, in condizioni di assenza o limitazione di acqua libera.

TECNICHE ANTICAMENTE MESSE A PUNTO PER LA PRODUZIONE IN ORIENTE DI CIBI TRADIZIONALI E DI BEVANDE ALCOLICHE:

Asia formaggio Egitto pane Cina salsa di soia

la loro applicazione si è estesa anche alla produzione microbiologica di molecole ad attività biologica (antibiotici, enzimi)

In relazione alle sue caratteristiche peculiari, si è quindi evoluto un nuovo tipo di applicazione biotecnologica delle SSF, soprattutto nell’ottica di utilizzo di residui agro-industriali e della prevenzione

dell’inquinamento ambientale.

EVOLUZIONE STORICA DELLE SSF

Le origini delle SSF risalgono all’antico Egitto.

1914 (Takamine): viene pubblicato per la prima volta un articolo che descrive la produzione di una enzima digestivo (Takadiastase) impiegando la coltura SSF con ceppi di Aspergillus oryzae cresciuti su crusca di grano

Dopo la seconda guerra mondiale: vengono costruiti i primi impianti per SSF che prevedono un sistema di aerazione forzata.

1960:si verifica una morìa di tacchini per ingestione di farina di arachidi contaminata da aflatossina prodotta da Aspergillus flavus. Ricerche condotte in tale ambito evidenziano che questa tossina viene sintetizzata in elevate quantità solo se la fermentazione viene allestita in SSF, non in coltura sommersa.

Le prime fermentazioni SSF su larga scala sono state sviluppate per la produzione di enzimi e di acido citrico.

PRODOTTO CEPPO SUBSTRATO

-amilasi A. oryzae, Rhizopus sp., Bacillus sp.

Crusca di grano, manioca

-galattosidasi Kluyveromyces lactis Crusca di grano o di mais

Proteasi Penicillium caseicolum Crusca di grano e latte scremato in polvere

Rennina Mucor pusillus, M. miehei Crusca di grano

Etanolo S. cerevisiae Mais, carrube, polpa di frutti

Acido lattico Lactobacillus sp.

Rhizopus oryzae

Sorgo + glucosio

Tetraciclina Streptomyces viridifaciens Patate dolci

Sake A. oryzae, A. kawachii Riso, malto

Salsa di soia Aspergillus sojae Farina di soia

ESEMPI DI FERMENTAZIONI IN COLTURA SOLIDA CON SUBSTRATI NATURALI

CARATTERISTICHE DELLE SSF

1. L’ambiente di coltura è statico, generalmente non sottoposto ad agitazione

2. L’impiego di acqua è limitato.

generazione di quantità minori di effluenti liquidi

3. Il volume della coltura è inferiore rispetto ad una coltura sommersa, in quanto il substrato non è disperso in acqua ma è solido

4. I substrati impiegati per le SSF sono generalmente naturali (cereali, vegetali, residui agricoli …).

5. I MO impiegati nelle SSF sono generalmente ifomiceti, in grado di sintetizzare amilasi e cellulasi, che idrolizzano l’amido e la cellulosa e penetrano nel substrato solido.

SSF vs SmF (COLTURA SOMMERSA)vantaggi e svantaggi delle SSF

VANTAGGI:

• Le SSF, in particolar modo i processi condotti a ridotta concentrazione di umidità, sono relativamente resistenti alle contaminazioni batteriche;

• E’ possibile condurre fermentazioni con una concentrazione di substrato molto più elevata rispetto alla coltura sommersa (il contenuto di umidità del substrato è inferiore);

• Le SSF richiedono generalmente costi di esercizio inferiori rispetto ai processi allestiti in coltura sommersa (minore controllo dei parametri di fermentazione);

• Se è necessario estrarre il prodotto, la quantità di solvente da impiegare e i costi di estrazione sono inferiori (downstream semplice);

• Il trattamento dei residui di fermentazione è semplice: dopo essiccamento, possono essere impiegati nell’alimentazione zootecnica o come fertilizzante;

• Le SSF richiedono sistemi di aerazione più facilmente gestibili rispetto alle fermentazioni allestite in coltura sommersa;

• Le SSF non presentano problemi relativi alla formazione di schiuma;

• L’inoculo nelle SSF avviene tramite conidiospore. Esse possono essere conservate per lunghi periodi.

SVANTAGGI:

• Lo sviluppo di calore può essere limitante per il processo fermentativo;

•La coltura non è omogenea, e il processo fermentativo è difficilmente controllabile;

• La valutazione dello sviluppo microbico mediante tecniche dirette è difficoltoso, è necessario impiegare tecniche indirette;

• Le condizioni di SSF non sono adatte per lo sviluppo di tutti i MO: muffe e funghi possono svilupparsi in ambienti a ridotto contenuto di umidità, i batteri raramente;

• Il controllo del pH nel corso della fermentazione è di difficile gestione;

•Il pretrattamento dei substrati può essere costoso

•La conoscenza degli aspetti ingegneristici e di sviluppo/modellazione di processo è ancora limitata.

SSF vs COLTURA SOMMERSA

SUBSTRATI IMPIEGABILI

Piante coltivate: maniocasoiabarbabietola o canna da zuccheropatate sorgo

Residui di piante coltivate: crusca e paglia di frumento e risoresidui di barbabietola e canna

Residui dell’industria del caffè: polpa e bucce

Residui di frutti: tritume di mele e uva (pomace)scarti di ananas e banana

Residui di produzione di oli: coccosoiaarachidipalma

ALLESTIMENTO DI UNA FERMENTAZIONE SSF

La preparazione del substrato solido e l’inoculo della coltura sono due step fondamentali: le condizioni iniziali di fermentazione influenzano fortemente l’andamento dell’intero processo.

PREPARAZIONE DEGLI INGREDIENTI:

Il substrato solido viene sempre sottoposto a pre-trattamenti prima dell’inoculo:

1. Macinazione per aumentare la superficie a contatto con il microrganismo

2. Trattamento con vapore, che produce un incremento del contenuto di umidità sulla superficie (quantità di acqua impiegata: 10-15% in peso del substrato iniziale).

Se il substrato è in polvere, si può miscelare direttamente con acqua

3. Trattamento termico ad elevate temperature per circa 1 ora a pressione atmosferica (cottura)

Si ottiene la sterilizzazione del substrato solido e la gelatinizzazione dell’amido, che in questo forma risulta

più attaccabile dalle amilasi microbiche.

INOCULO DELLA COLTURA:

A fine cottura, il substrato solido viene portato alla T di inoculo.

L’inoculo può essere costituito da una coltura pura o da colture miste (muffe, lieviti e batteri).Nei processi che prevedono l’impiego di ingredienti contenenti amido, si inoculano generalmente anche ceppi di Mucor sp. e Rhizopus sp., che hanno un’attività amilasica molto intensa (superiore rispetto ai ceppi di Aspergillus).

Inoculo: 1-5 x 105 spore/g substrato impiegato

L’inoculo (in forma gassosa o liquida) avviene disperdendo le spore sulla superficie del substrato solido, che viene agitato ad intervalli regolari per rendere omogenea la coltura.

Chicco di riso con sviluppo dell’ifomicete

Tempeh: Preparato da semi di soia su cui vengono fatti sviluppare ceppi di Rhizopus oligosporus

VALUTAZIONE DELLO SVILUPPO MICROBICO

Lo sviluppo microbico è un parametro importante di controllo dell’andamento del processo fermentativo.

Nel caso delle SSF, il micelio penetra nel substrato ed è quindi difficilmente separabile. Non è quindi possibile impiegare metodi diretti di valutazione.

Per questo motivo vengono impiegati metodi indiretti, che prevedono la determinazione di:

- DNA- proteine- chitina (costituente della parete)- N-acetil glucosammina (costituente della chitina)

Anche l’analisi dei gas in uscita dalle SSF è una procedura in grado di fornire una valutazione indiretta dello sviluppo microbico:

SOUR (Specific Oxygen Uptake Rate)

descrive la quantità di O2 impiegata dal microrganismo per consumare 1 g di substrato

FERMENTATORI

I bioreattori messi a punto per condurre le SSF assolvono a due compiti:

contenimento controllo dell’ambiente

Prevenzione della contaminazioneda organismi ambientali e viceversa

Controllo della temperatura

Durante lo sviluppo microbico viene prodotto calore in quantità considerevole

Mantenimento delle condizioni ottimali di processo

Le parti solide non disperdono calore in maniera efficiente

La temperatura nelle SSF spesso aumenta a livelli incompatibili con lo

sviluppo microbico

Scala di laboratorio Rapporto elevato superficie volume

Scale-up Trasferimento spontaneo di calore inadeguato

Presenza di meccanismi di aerazione forzata

Inconveniente: perdita di umidità per evaporazioneLa limitazione del contenuto di acqua libera può provocare il blocco dello

sviluppo microbico

E’ necessario un sistema di controllo del livello di umidità

Possibili soluzioni: spray di acqua impiego di aria umidificata

VASSOI

Rappresentano il tipo di reattore generalmente e tradizionalmente più impiegato.

Nei sistemi più datati, i vassoi, di legno, plastica o metallo, spesso forati sul fondo, venivano mantenuti in camere a T controllata.

aria

CO2, acqua

Max. 4 cm

Prodotti tradizionali: tempeh

Prodotti “moderni”: antibiotici ed enzimi

La coltura non viene agitata, oppure agitata manualmente ad intervalli regolari

Vantaggi: semplicità di uso

Svantaggi: scale-up difficoltoso (un numero elevato di vassoi rende non economico e troppo laborioso l’intero processo fermentativo).

Tempeh

FERMENTATORI A VASSOI

L’evoluzione dei sistemi a vassoi ha consentito di mettere a punto i fermentatori a vassoi. La fermentazione viene condotta in appositi reattori in condizioni stazionarie, senza agitazione meccanica, a T e umidità controllate.

L’altezza massima dello strato solido può raggiungere i 15 cm, ma uno spessore inferiore migliora il controllo della T.

Sono stati messi a punto sistemi in continuo:

caricamento del substratosterilizzazioneraffreddamentoinoculo microrganismoessiccamento macinazioneconfezionamento

Prophyta

Filamentous fungi suitable for solid-state fermentation:

Coniothyrium minitans, Paecilomyces lilacinus, Verticillium lecanii, Talaromyces flavus, Metarhizium anisopliae, Beauveria spp., Trichoderma spp., Gliocladium spp., Ophiostoma sp., Monascus sp., Sepedonium sp., Penicillium spp., Sclerotinia spp., Fusarium spp., Claviceps purpurea, Pseudocercosporella sp., Pleurotus sp., Basidiomycetes

PACKED BED REACTOR

I bioreattori packed bed dispongono di un sistema di aerazione forzata (flusso ascendente).

Esistono reattori a sviluppo verticale o orizzontale.

La differenza di T (fino a 10°C) tra il fondo e la superficie del substrato (ad esempio riso) dipende dallo spessore della coltura (da 10-20 cm a 1,5 m) e dall’aerazione.

Spesso la camera non è termostatata. L’aria satura di umidità viene fornita dal basso e attraversa il letto, con flusso intermittente (regolazione on/off) in funzione della T segnalata da un sensore.

Packed-bed reactor (continua)

Un altro tipo di reattore packed-bed orizzontale prevede, al suo interno, una vite senza fine che mescola la coltura ad intervalli.

Packed bed verticali

Di forma cilindrica, possono contenere anche lastre verticali che corrono lungo tutta l’altezza, in cui circola acqua fredda

Limitano il surriscaldamento

Nel corso del processo fermentativo, lo sviluppo microbico avviene sulla superficie del substrato, e lentamente si propaga verso gli spazi vuoti che si creano all’interno della coltura

Diminuisce lo spazio disponibile per la circolazione dell’aria attraverso la coltura (fino all’1% rispetto al valore iniziale)

L’incremento della P tra ingresso e uscita dell’ariapuò essere impiegata come misura online dello sviluppo microbico.

FERMENTATORI A TAMBURO ROTANTE

Esistono due tipi di reattori a tamburo:

1. Tamburo rotanteIl reattore è costituito da un grosso cilindro, posto in orizzontale, che ruota ad intervalli regolari. Il tamburo può essere dotato di frangiflutti per migliorare il mescolamento prodotto dalla rotazione.

L’aerazione è forzata e fornita nella fase di rotazione del tamburo, al fine di massimizzare il contatto tra substrato e aria fresca.

rapida rimozione di calorerapido rifornimento ossigeno

2. Tamburo ad agitazione orizzontaleIl corpo del reattore non si muove, L’azione di mescolamento è fornita da un sistema di agitazione a pale presente all’interno

2-3 rpm

Impiegato anche per la produzione di glucoamilasi da Rhizopus japonicus: il substrato è costituito da residui della lavorazione di patate.

La miscelazione ottimale si ottiene quando il reattore è riempito per il 30% dell’intero volume.

FLUIDIZED-BED REACTOR

In questo tipo di bioreattore, il substrato viene mantenuto in movimento tramite un potente flusso di aria dal basso.INCONVENIENTE: spesso la coltura tende ad aderire alle pareti del

fermentatore.

Questo tipo di coltura offre alcuni vantaggi: la superficie effettiva del substrato in cui avviene lo sviluppo del micelio è maggiore rispetto ai reattori packed bed, in cui lo sviluppo avviene prevalentemente in superficie; il letto del substrato viene mantenuto in condizioni omogenee; il rifornimento di acqua, nutriliti, acidi e/o basi è facilmente gestibile; la rimozione della CO2 e del calore è facilitata.

Un agitatore, posizionato nella parte bassa, serve a rompere gli agglomerati più pesanti, che tendono a depositarsi sul fondo del reattore.

KIKKOMAN CORPORATION (1975) air-solid fluidized bed reactor

8000 L

Produzione di enzimi da Aspergillus sojae su crusca

COMPARAZIONE TRA LE DIVERSE PROCEDURE DI FERMENTAZIONE:

Produzione di enzimi da Aspergillus oryzae

ENZIMA SOMMERSA

(U/ml)

SOLIDO STAZIONARIO

(U/g solidi)

FLUIDIZED BED

(U/g solidi)

Proteasi neutre 5.5 x 102 3.4 x 103 2.3 x 104

Proteasi acide 11 2.6 x 102 3.7 x 102

-amilasi 6.4 x 102 1.9 x 104 5.8 x 104

Strumentazione standard per il controllo delle SSF

- Sistema di rilevamento della Temperatura

mediante sensori elettrochimici

dell’aria

-Sistema di analisi dei gas in uscita (Off-gas analysis)

Misurazione della CO2 e dell’O2

Fondamentale per verificare lo stato fisiologico della coltura

- Sistemi di rilevamento dell’umidità

della coltura: non sempre applicabili

Il raffreddamento può avvenire secondo tre meccanismi:

1. Conduzione: raffreddando le pareti del reattore2. Convezione: forzando l’ingresso di aria fredda secca3. Evaporazione: forzando l’ingresso di aria umida

www.biocon.comSubmerged fermentationSSFPlafractor (mix)

Plafractor:

Impianto costituito da una serie di vassoi impilatiStruttura simile ad un bioreattore per coltura sommersa

Produzione di statine, molecole ad attività anticolesterolemica,da ceppi di Aspergillus