Università degli studi di Napoli Federico II

Corso di laurea in Scienza e Ingegneria dei Materiali

Tesi di laurea triennale

VALUTAZIONE DI UN DISPOSITIVO

NANOFLUIDICO PER LA SEPARAZIONE SU

BASE ENTROPICA DI MACROMOLECOLE

CONFINATE

Relatore:

Ch.mo Prof. Paolo A. Netti

Correlatore:

Dott.ssa Ing. Ilaria De Santo

Candidato:

Emanuele Zappia

Matr. 539/212

ANNO ACCADEMICO 2011/2012

La nanofluidica si occupa del comportamento, della manipolazione e del controllo dei fluidi confinati in strutture nanometriche

Ingegnerizzando l’architettura di materiali nanostrutturati e studiando le dinamiche delle molecole all’interno di tali strutture, si può virtualmente ottenere qualsiasi interazione desiderata

L’utilizzo di dispositivi nanofluidici, aventi dimensioni paragonabili a quelle delle biomolecole, è vantaggioso per molte applicazioni biomedicali

NANOFLUIDICA

SEPARAZIONE MOLECOLARE IN

DISPOSITIVI NANOSTRUTTURATI

• Nella moderna biologia e nell'ingegneria biomedica la capacità di separare ed identificare biomolecole da campioni biologici complessi, in maniera accurata ed efficiente, è rilevante per lo sviluppo di molte applicazioni

• In questo campo la capacità di influenzare il trasporto delle molecole è di primaria importanza

Dispositivo di

separazione

Forza di

trasporto

Meccanismo di

separazione

Campione

molecolare

Proprietà

fisiche

Array di trappole

entropiche

Campo elettrico Intrappolamento

entropico

DNA Dimensione,

carica

Array di

nanocolonne

Campo elettrico

pulsante

Stretching

elettroforetico

DNA Dimensione,

carica

Strutture

anisotrope ANA

(Anisotropic

nanofilter array)

Campo elettrico Separazione di

Ogston –

intrappolamento

entropico

DNA,

proteine

Dimensione,

carica

Ostacoli

asimmetrici

Campo elettrico Movimenti

Browniani

rettilficati

DNA Dimensione,

carica

SISTEMI NANOSTRUTTURATI DALLA LETTERATURA

Allo stato attuale i dispositivi nanostrutturati di separazione molecolare:• Necessitano della presenza di un campo elettrico o di un flusso imposto• Funzionano esclusivamente con molecole cariche

MECCANISMI DI SEPARAZIONE

• Le proprietà di biomolecole attraverso un struttura filtrante sono determinate da complesse interazioni tra le dinamiche molecolari e la fisica dei sistemi nanofluidici

• Questi sistemi mimano i meccanismi di trasporto delle matrici gel coniugando ad essi la possibilità di progettare in maniera controllata la struttura filtrante

SEPARAZIONE MOLECOLARE IN

DISPOSITIVI NANOSTRUTTURATI

FENOMENI ALLA BASE DELLA SEPARAZIONE

• Diffusività in ambiente nanoconfinato

• Risposta a un campo elettrico imposto in ambiente nanoconfinato

• I meccanismi di trasporto molecolare all’interno di strutture nanometriche sono molto rilevanti, possiamo influenzare tali meccanismi modulando le dimensioni caratteristiche del sistema

• Abbiamo bisogno di un modello che tenga conto della flessibilità delle molecole

TRASPORTO IN MATERIALI

NANOSTRUTTURATI

Per rg/rp<<1 è valida la teoria idrodinamica delle sfere rigide

• I fenomeni diffusivi sono regolati dai coefficienti Keq KD

• Questo modello non riesce a descrivere i fenomeni di trasporto molecolare in nanostrutture

Per rg/rp≈1 non più vale la teoria idrodinamica delle sfere rigide

• Bisogna considerare fenomeni di arrangiamento conformazionale dovuti alla flessibilità della molecola (Leggi di scala di De Gennes)• Diventano rilevanti le interazioni a corto raggio (interazioni di van der Waals, forze idrofobiche, elettrostatiche)

Parametri che influenzano il trasporto delle molecole

• Dimensioni delle molecole(rg, MW)• Dimensione del canale (h)• Rigidità e flessibilità della molecola• Frizione (z)• Interazione molecola/parete: repulsione e attrazione• Proprietà della superficie (proprietà chimiche, ruvidità)

DeqKKD

D

bulk

confined

SCOPO DEL LAVORO

• Sfruttare il confinamento di biomolecole in un sistema nanostrutturato al fine di realizzare un dispositivo di separazione che non utilizzi campi esterni imposti né di pressione idrodinamica, né elettrici

• Ipotizzare e verificare la validità del principio di separazione molecolare su base entropica, regolato dalla temperatura, su cui basare tale dispositivo

MISURAZIONI PER VALUTARE L’EFFETTO DELLA TEMPERATURA

• Effetto sulla dinamica diffusiva

• Effetto sulla cinetica delle particelle

Misurazioni di spettroscopia di correlazione di fluorescenza FCS del PEG 20kDa e 40kDa

confinato in nanocanali di 10nm a 23°C, 37°C e 45°C

SCOPO DEL LAVORO

MODELLO TERMODINAMICO PER POLIMERI CONFINATI PROPOSTO DA DE GENNES

• Contributo entropico legato a cambi di conformazione della molecola• Contributo entalpico legato a fenomeni di adsorbimento alla parete

REGOLARE LE CONDIZIONI TERMODINAMICHE DI CONFINAMENTO SPONTANEO ATTRAVERSO CAMBI DI

TEMPERATURA

h = 10÷30 nm

w = 5÷30 mm

500 mm

FCS

Sampling volume

DISPOSITIVO NANFLUIDICOAbbiamo utilizzato un chip provvisto di nanocanali, di 10 nm di spessore, collegati a serbatoi micrometrici carichi di una soluzione di PEG funzionalizzato con rodamina

TECNICA DI MISURAPer le misurazioni ci siamo avvalsi della tecnica di spettroscopia di correlazione di fluorescenza FCS abbinata alla microscopia confocale

MATERIALI E METODI

• La diffusione browniana fa fluttuare il numero di molecole nel volume confocale illuminato nel tempo

• Di conseguenza si registrano le fluttuazioni del segnale di intensità di fluorescenza

t=0 t=1 t=2

N=3 N=2 N=4

O 2

I t I tG

I t

Dalle fluttuazioni di intensità viene calcolata la funzione di autocorrelazione

MATERIALI E METODI La tecnica FCS

Modello anomalo

Modello di Wirth

G() 1

N

1

1 diff

G() 1

N( funbound )

1

1

diff

(1 funbound )e

Des

MATERIALI E METODI Procedura di fitting

STUDIO DELLA DINAMICA DIFFUSIVAAttraverso procedure di fitting ricaviamo il tempo di diffusione D a diverse temperature

STUDIO DELLA CINETICAAttraverso procedure di fitting ricaviamo il numero di particelle medio <N> a diverse temperature

Diff

Stokes-Einstein

Diff

xy

iD

2

4

wxy = 0.17 µms= wz/wxy = 5

21

11)(

sN

G

DD

D

kTr

r

kTD h

h 66

T [°C]D [PEG 20]

[cm2/s]D [PEG 40]

[cm2/s]rh [PEG 20]

[nm]

rh [PEG 40]

[nm]

23 4,53± 0,01 E-07 3,46± 0,01 E-07 5,1 ± 0,1 6,7 ± 0,1

37 5,42 ± 0,01 E-07 4,38 ± 0,01 E-07 6,0 ± 0,1 7,5 ± 0,1

45 6,94 ± 0,03 E-07 4,97 ± 0,03 E-07 5,6 ± 0,5 7,9 ± 0,5

Misure del PEG 20 E 40kDa a differenti temperature

RISULTATI Misure in soluzione

All’aumentare della temperatura diminuisce il tempo di diffusione delle molecole τdiff

T

diff

NG

1

11Utilizzando la procedura di fitting

anomalo abbiamo osservato che non

varia con la temperatura e, per il PEG 40kDa, vale ≈ 0,5 ± 0,1

RISULTATI Effetto della temperatura sul tempo di diffusione nei

nanocanali - PEG 40kDa

All’aumentare della temperatura diminuisce il numero di particelle medio rilevato <N> nel nanocanale

T

• E’ stata osservata una cinetica di svuotamento dei nanocanali all’aumentare della temperatura

• Per il PEG 40kDa si ha uno svuotamento significativo nel passaggio da 23°C a 37°C

RISULTATI Effetto della temperatura sul numero di particelle

medio nei nanocanali – PEG 40kDa

Anche per il PEG 20kDa all’aumentare della temperatura diminuisce il numero di particelle medio rilevato <N> nel nanocanale

E’ stata osservata una cinetica di svuotamento dei nanocanali all’aumentare della temperatura anche per il PEG 20kDa ma si ha uno svuotamento significativo nel passaggio da 45°C a 45°C-14h

RISULTATI Effetto della temperatura sul numero di particelle

medio nei nanocanali – PEG 20kDa

T

• Abbiamo osservato che le partizioni normalizzate, per il PEG 40kDa e PEG 20kDa, variano in maniera diversa nel tempo al variare della temperatura

• Attraverso un meccanismo di separazione per via entropica, regolato termicamente, viene favorita l’uscita di PEG a più alto peso molecolare all’aumentare della temperatura

• Il punto di massima efficienza si raggiunge a 37°C

• E’ stata stimata un’efficienza di svuotamento dei canali del 38%

RISULTATI Principio di separazione

PUNTO DIMASSIMA EFFICIENZA

• Le condizioni energetiche di confinamento

spontaneo possono essere valutate analizzando l’andamento dei contributi entropico ed entalpico in funzionedel coefficiente r/D

• All’aumentare della temperatura varia il punto d’instabilità termodinamica ΔG = 0

In range di confinamento più spinto, molecole a più alto peso molecolare impiegano meno tempo per uscire dal canale a causa del maggiore peso del contributo entropico nel bilancio tra richiamo entropico e diffusività Browniana

RISULTATI Discussione

CONCLUSIONI

• E’ stata verificata sperimentalmente la validità del principio allabase di un dispositivo nanostrutturato di separazione molecolare su base entropica, regolato dalla temperatura

• Il dispositivo, non prevedendo l'imposizione di campi elettrici eflussi applicati, può essere utilizzato per separare molecole elettricamente neutre

• Il dispositivo realizza una separazione massima a 37°C del 38%

• Al fine di ingegnerizzare il dispositivo di separazione molecolare innovativo qui valutato, verranno effettuate ulteriori analisi su molecole di interesse applicativo

GRAZIE PER

L’ATTENZIONE