ESERCIZI di

BIOLOGIA

MOLECOLARE

A.A 2004-2005

ESERCIZIO n°1

Il plasmide pNEB è una molecola di DNA circolare di 2713 bp.La soluzione ottenuta dopo il processo di purificazione presenta il seguente spettro di assorbimento nell’UV visibile:

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

200 210 230 260 280 290 300

A

(nm)

0,25

1) Qual è la concentrazione MOLARE della soluzione?(d=cammino ottico=0,3 cm) [C=30,7 X 10 –9 M=30,7 nM]

2) Qual è la concentrazione in ng\l? [C=55 ng\l]1) Considerando che per la misura allo

spettrofotometro, 5l della soluzione originaria sono stati diluiti in 95 l di acqua, qual è la concentrazione molare della soluzione originaria?

[C=614 X 10 –9 M=614 nM; C=1,1 g\l]

1) Quale sarebbe stata l’Assorbanza osservata se la misura fosse stata eseguita sulla soluzione originaria? [ A = 4,99]

2) Considerando che il volume della soluzione originaria rimasta è 30 l, quanti g totali di DNA abbiamo? [DNATOT= 33 g]

ESERCIZIO n°2

Avendo 815 ·10-6 g. di u oligonucleotide a singolo filamento (primer) lungo 24 nt, in quanti l di acqua è necessario scioglierli per ottenere una soluzione 100 M? [V=1029 l=1,3 ml]

Diluiamo 1 l della soluzione in 99 l di acqua.Quale risulterà l’assorbanza a nm di tale soluzione? [ A=0,24]

ESERCIZIO n°3

Il Servizio di Sequenziamento richiede per eseguire la reazione

-500 ng. di campione da sequenziare

-6,4 pmol dell’oligonucleotide utilizzato come primer.

1)Quanti l di una soluzione 125 nM di un plasmidio lungo 3215 bp da sequenziare devo inviare? [ 1,88 l ]

2)Quanti l di oligonucleotide 10 M? [ 0,64 l ]

ESERCIZIO n°4

Quanto misura la lunghezza in nm di una molecola di DNA lineare in forma B costituita da 9824 bp? [ L=3340,16 nm=3,34 m ]Quanti giri di elica contiene? [n°giri=982]

Se la stessa molecola viene posta in alcool, quindi in condizioni di scarsa umidità, quale modificazione strutturale interviene? [forma A]Di quanto varieranno lunghezza in nm e numero di giri dell’elica?[L=2515 nm=2,515 m ; n° giri=893]

ESERCIZIO n°5

Qual è il peso molecolare (PM) di una molecola di DNA ds (double strand)di 3421 bp? [PM= 2257869 Da]

Quale invece il peso molecolare di un singolo filamento di DNA di 1750 nucleotidi? [PM=577500 Da]ESERCIZIO n°6

Se una soluzione contenente tre frammenti di DNA lunghi rispettivamente 1600 bp, 650 bp e 1105 bp, viene sottoposta ad elettroforesi su gel di agarosio, quale sarà, a partire dal polo positivo, l’ordine delle bande osservate al termine della corsa?

Il peso molecolare di una molecola di DNA a doppio filamento è:

PM= 660 x nro bpPM= 660 x nro bpDA DOVE DERIVA IL

VALORE “660”?-è il peso molecolare di una coppia di basi, quindi la metà, 330, corrisponde al peso molecolare di un nucleotide.

-Poiché il DNA è costituito da quattro nucleotidi diversi, tale valore rappresenta un VALORE MEDIO

C5H10O4 PM=130 PO3 PM=78

PM=111 PM=126 PM=135 PM=150

PMmedioBASI=130

PMmedioNUCLEOTIDE 330

ESERCIZIO n°7

Un plasmide di 3000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi:

KbEcoRI

BamHIEco

RI

BamHI

1) Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [2]

2) Quanti siti di restrizione ha BamHI? [2]

3) Quali sono le distanze reciproche tra i siti?

Disegnare la mappa di restrizione.

ESERCIZIO n°8

Un plasmide di 6000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi:

KbPvuIIEco

RIBamHI

SapI

Digestioni singole

1) Quanti siti di restrizione ha PvuII?A quale distanza reciproca?

[ 3 siti posti a 2000 bp uno dall’altro]2) Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1]3) Quanti siti di restrizione ha BamHI? [1]4) Quanti siti di restrizione ha SapI? [1]

Digestioni doppie

KbPvuII

EcoRI Eco

RI

BamHIBamHI

PvuII SapI

EcoRIPvuII

SapI SapI

BamHI

1) Quali sono le distanze reciproche tra i siti di restrizione?

Disegnare la mappa di restrizione.

ESERCIZIO n°9

Un frammento di DNA lineare lungo 5000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi:

KbEcoRI

BamHIEco

RI

BamHI

1) Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1]2) Quanti siti di restrizione ha BamHI? [1]3) Quali sono le distanze reciproche tra i siti?Disegnare la mappa di restrizione del frammento.

ESERCIZIO n°10

Il plasmide A, lungo 4000 bp viene tagliato con BamHI e il risultato della restrizione viene visualizzato tramite gel-elettroforesi:

KbBamHI

1) Quanti siti di restrizione ha BamHI? [2]

2) Qual è la loro posizione reciproca? [1000 bp di distanza]

Supponiamo di recuperare e purificare il frammento di restrizione più lungo. Avendo digerito 4 g di plasmide A, se al termine della purificazione del frammento di 3000 bp, la soluzione ottenuta presenta una A260nm=0,4, quanti ng di DNA sono stati persi nei vari passaggi rispetto alla resa teorica?[ DNA perduto=1260 ng]

Il frammento di 3000 bp viene utilizzato come vettore di clonaggio per l’inserzione di un frammento di DNA di 178 bp ottenuto a sua volta da un secondo plasmide per restrizione BamHI-NdeI.

1) Quale sarà la lunghezza in bp del nuovo costrutto? [3178 bp]

2) Quale sarà il risultato di una successiva digestione del nuovo costrutto con BamHI? [il costrutto circolare viene linearizzato]3)Nella reazione di ligazione, vettore e inserto devono essere miscelati in rapporto molare 1:3; utilizzando 100 ng di vettore, quanti ng di inserto sono necessari?[quantità inserto=17,62 ng]Se la soluzione dell’inserto di 178 bp a disposizione presenta lo spettro di assorbimento nell’UV visibile rappresentato in figura, quanti l ne devono essere utilizzati?[V= 0,5 l]

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

200 210 230 260 280 290 300

A

(nm)

0,15

ESERCIZIO n°11

Dobbiamo preparare 50 ml di un buffer di trascrizione(10X) così costituito:500 mM KCl200 ml Tris-HCl50 mM MgCl2

Avendo a disposizione i seguenti stock concentratiTris-Hcl 1MKCl 2MMgCl2 1MQuanti ml di ciascuno stock devono essere utilizzati?[KCl 12,5 ml;Tris-HCl 10 ml; MgCl2 2,5 ml; si aggiungono 25ml di acqua]Considerando che il volume di ciascuno stock è 25 ml e che le tre sostanze hanno i seguenti PMKCL PM=74,56 umaMgCl2 PM=203.32 umaTris-HCl PM=157.64 umaquanti g. di ciascuna sostanza sono stati pesati per preparare i tre stock?[KCl g. 3,728;MgCl2 g. 5,083;Tris-HCl g. 3,941]Quanti g. di ciascuna sostanza sarebbero serviti per preparare il buffer direttamente dalle polveri?[KCl g.1,864;MgCl2 g. 0,5; Tris-HCl g. 1,576]

ESERCIZIO n°12Per ottenere un frammento di DNA di 850 bp, esso viene amplificatotramite PCR e gel purificato.Si allestiscono 4 reazioni di PCR, ciascuna avente un Volume di 50 l.Considerando che a PCR ultimata la concentrazione di DNA n soluzione è in ciascun tubo 10 ng\l e che l’efficienza della procedura di gel purificazione è del70 %, quale sarà la concentrazione molare dei 50 l di soluzione finale ottenuti?Quanti g. totali di DNA si ottengono?[c=50x 10-9M =50 nM;g.DNA 1,4]

ESERCIZIO n°13

La corsa elettroforetica di tre campioni contenenti frammenti di DNA ha fornito il seguente risultato:

Determinare la lunghezza in bp e il peso molecolare dei frammenti contenuti in ciascun campione.[1:544bp; 2:1480 bp ;3: 221 bp]

1 2 3

La corsa elettroforetica di molecole si dimensioni diverse va linearmente con il LOGARITMO del

peso molecolare

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 2 4 6 8 10

distanze (mm)

ln l

un

gh

ezze

n° bp

ln n°bp

Distanza(mm)

1857 7,5 0,75

1058 6,96 2,7

929 6,83 3,2

383 5,94 6,28

121 4,79 9,05

0

200400

600800

1000

12001400

16001800

2000

0 2 4 6 8 10

distanze (mm)

lun

gh

ezze

(bp

)