Elucigene® CF-EU2v1 Guida al software di analisi

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Analisi GeneMapper Introduzione La sezione seguente descrive le procedure per l’analisi dei campioni di risultati Elucigene CF-EU2v1 mediante i pacchetti software Applied Biosystems GeneMapper (versione 3.7 o superiore). Processo di analisi Il processo per l’analisi dei campioni è riepilogato nel diagramma di flusso riportato di seguito.

Analizzare i campioni amplificati su Genetic Analyzer

Aprire il software GeneMapper

Aggiungere al progetto i file FSA dei campioni

Impostare la metodica di analisi e il size standard in CF-EU2v1

Selezionare i pannelli di miscelazione appropriati

Eseguire l’analisi dei campioni

Salvare il progetto

Selezionare il campione e aprire la finestra del grafico

Esaminare i dati dei tracciati e dei genotipi

Stampare i tracciati dei campioni Elucigene CF-EU2v1

Valutare i genotipi campione

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GeneMapper Aprire il file con il programma GeneMapper e importare i file FSA necessari facendo clic

sul pulsante ‘add samples to project’ (aggiungi campioni a progetto) ( ).

Cercare la cartella di analisi desiderata nell’elenco delle cartelle sul lato sinistro della finestra. Selezionare la cartella e fare clic sul pulsante ‘Add to List >>‘ (Aggiungi a elenco >>). La cartella dell’analisi sarà ora visualizzata nella finestra dei campioni da aggiungere. Facendo doppio clic sull’icona della cartella dell’analisi in questa finestra viene visualizzato ciascun file FSA da importare (Figura 1).

Figura 1 - I campioni sono stati aggiunti all’elenco e sono pronti per essere aggiunti

al progetto.

Quindi, vengono aggiunti i campioni facendo clic sul pulsante ‘Add’ (Aggiungi) ( ). Importazione delle impostazioni di analisi di CF-EU2v1 GeneMapper in GeneMapper Manager È necessario importare le impostazioni CF-EU2v1 per GeneMapper. Questo processo viene controllato tramite l’interfaccia ‘GeneMapper Manager’.

Le impostazioni di CF-EU2v1 GeneMapper sono disponibili sul sito web di Gen-Probe: www.gen-probe.com. Scaricarle in una cartella appropriata sul proprio sistema. 1. Avviare il programma GeneMapper Manager facendo doppio clic sull’icona

(Figure 2 e 3).

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Figura 2 - Apertura di GeneMapper Manager

Figura 3 - Interfaccia di GeneMapper Manager.

2. Selezionare la scheda ‘Analysis Methods’ (Metodiche di analisi) e fare clic sul pulsante di importazione.

3. Cercare i necessari file con le impostazioni dell’analisi CFEU2 e importarli: 3130 o 3500 (Figura 4).

Figura 4 - Importazione delle metodiche di analisi.

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4. Ripetere il processo selezionando la scheda corretta e importando i rispettivi file per: ● Table Settings (Impostazioni tabelle) ● Plot Settings (Impostazioni grafico) ● Size Standards (Size standard)

Nota: Cluster Plot Settings (Impostazioni grafico cluster), Matrices (Matrici), SNP Sets (Set SNP) e Report Settings (Impostazioni rapporti) non richiedono l’importazione di file.

Importazione delle impostazioni dei pannelli CF-EU2v1 in Panel Manager (Gestione pannelli) È necessario importare le impostazioni dei pannelli CF-EU2v1 per GeneMapper. Questo processo viene controllato tramite l’interfaccia ‘Panel Manager’ (Gestione pannelli). 1. Aprire il programma di gestione pannelli in GeneMapper facendo clic sull’icona .

2. Fare clic su ‘Panel Manager’ (Gestione pannelli) nella finestra di navigazione sinistra. La voce apparirà ora evidenziata in celeste.

3. Selezionare ‘File/Import Panels’ (File/Importa pannelli). Cercare il file dei pannelli CFEU2 ‘GeneMapper Panels’ .txt e importarlo (Figura 5).

4. Fare clic su ‘CFEU2 panel’ (Pannello CFEU2) nella finestra di navigazione sinistra. Il pannello CF-EU2v1 apparirà ora evidenziato in celeste.

5. Selezionare ‘File/Import Bin Set’ (File/Importa set bin). Cercare il file bin CFEU2 ‘GeneMapper Bins’ .txt e importarlo (Figura 6).

6. Fare clic su ‘Apply’ (Applica) e poi su ‘OK’.

Figura 5 - Importazione del file del pannello CFEU2.

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Figura 6 - Importazione del file del set bin CFEU2.

Modifica del file con i parametri di analisi Potrebbe essere necessario modificare la voce ‘Analysis Ranges’ (Intervallo di analisi) nelle impostazioni di analisi CF-EU2v1 in previsione delle specifiche condizioni di analisi. L’intervallo minimo di analisi dipenderà dal capillare e dal polimero utilizzati durante l’acquisizione dei dati. Per visualizzare le attuali impostazioni di analisi: 1. Aprire ‘GeneMapper Manager’. 2. Selezionare la scheda ‘Analysis Methods’ (Metodiche di analisi). Il file CF-EU2v1

importato sarà elencato come ‘CFEU2 Analysis Method’ (Metodica di analisi CFEU2). 3. Fare clic su ‘CFEU2 Analysis Method’ (Metodica di analisi CFEU2). La riga appare

ora evidenziata. 4. Fare clic sul pulsante ‘Open’ (Apri) e selezionare la scheda ‘Peak Detector’

(Rivelatore picco) (Figura 7) Per impostazione predefinita l’intervallo di analisi è impostato in modo da iniziare a 1600 e finire a 8000.

Figura 7 - Intervallo di analisi (evidenziato).

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Per individuare il corretto intervallo di analisi per il proprio laboratorio:

1. Nella finestra principale di GeneMapper, fare doppio clic sulla cartella di analisi importata per visualizzare un elenco dei file FSA in essa contenuti.

2. Selezionare un file FSA.

3. Facendo clic sulla scheda ‘Raw data’ (Dati grezzi) viene visualizzato un elettroferogramma dei dati grezzi.

4. Utilizzando come guida il picco 100 bp GS600v2 LIZ (arancione), orientarsi verso un punto di dati di circa 100 punti di dati più piccolo (Figura 8).

Figura 8 - Individuazione dell’intervallo minimo utilizzando i dati grezzi dei campioni.

5. Assicurarsi che l’intervallo Massimo di analisi consenta circa 100 punti di dati dopo il picco 600 bp GS600v2 LIZ.

6. Inserire i nuovi valori nel file di analisi CF-EU2v1 (per accedervi procedere come indicato sopra).

Potrebbe inoltre essere necessario modificare la voce ‘Peak Amplitude Thresholds’ (Livello ampiezza picco) a seconda della concentrazione dei campioni. I campioni con una concentrazione elevata saranno caratterizzati da un elevato livello di sfondo che potrebbe interferire con l’analisi. Per evitare che ciò si verifichi, si può aumentare il livello di ampiezza del picco. Ad esempio il colorante verde può essere impostato su 100 anziché su 50. Anche in questo caso si utilizza la scheda ‘Peak Detector’ (Rilevatore picco) in ‘CFEU2 Analysis method’ (Metodica di analisi) (Figura 7).

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Analisi e genotipizzazione dei file CF-EU2v1 importati 1. Nella finestra principale di GeneMapper selezionare ‘CFEU2 Table Settings’

(Impostazioni tabella CFEU2) (Figura 9).

Figura 9 - Usare il menu a discesa per selezionare le impostazioni tabella CFEU2.

2. Nella finestra principale di GeneMapper selezionare la prima cella sotto ‘Analysis Method’ (Metodica di analisi), quindi selezionare la metodica di analisi appropriata dal menu a discesa: CFEU2_3130 o CFEU2_3500. Ripetere il processo per Size Standard, selezionando ‘CFEU2 size standard’ dal menu a discesa.

3. Selezionare il pannello ‘CFEU2’ per ciascun campione (Figura 10). Per la miscela A selezionare il sottopannello contenente la miscela A e per la miscela B selezionare il sottopannello contenente la miscela B.

4. Fare clic su per avviare l’analisi dei campioni.

Figura 10 - Selezione delle impostazioni pannello CFEU2.

Esame dei dati dei tracciati e dei genotipi CF-EU2v1 1. Selezionare ‘Edit/Sort’ (Modifica/Ordina). Ordinare i campioni in base a ‘Sample

Name’ (Nome campione) e fare clic su ‘OK’.

2. Fare clic su per ‘Display Plots’ (Visualizzare i grafici).

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3. Usare il menu a discesa per selezionare le corrette impostazioni del grafico CF-EU2v1:

Per visualizzare la miscela A con i dati poly T selezionare: ‘CFEU2 Plot PT-on’ (CFEU2 grafico PT-attivo)

Per visualizzare la miscela A senza i dati poly T selezionare: ‘CFEU2 Plot PT-off’ (CFEU2 grafico PT-disattivo)

Figura 11 - Usare il menu a discesa per selezionare le impostazioni del grafico CFEU2.

4. La finestra del grafico visualizza i dati dei tracciati dei campioni (Figura 12).

5. Si consiglia di attivare l’opzione ‘Single click editing’ (Modifica con singolo clic) nella finestra del grafico. A tal fine selezionare ‘Alleles/set click editing’ (Alleli/imposta modifica con clic) e assicurarsi che questa opzione sia selezionata.

Figura 12 - Finestra dei grafici dei campioni che visualizza i dati dei tracciati etichettati.

Elucigene CF-EU2v1 - Miscela A

Elucigene CF-EU2v1 - Miscela B

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Valutazione dei picchi diagnostici Un individuo possiede due copie del gene CFTR. Qualora queste copie presentino la stessa sequenza per un dato allelo, l’individuo viene descritto come omozigote per questo sito. Qualora le copie presentino una sequenza diversa per un dato allelo, l’individuo viene descritto come eterozigote (Figura 13).

La miscela A (mutante) determina se un individuo presenta una mutazione mostrata dalla presenza di un picco celeste. La miscela mutante contiene anche primer per l’allelo F508del normale, quindi questa miscela può determinare se una persona è normale per F508del (solo picco verde), omozigote per F508del (solo picco celeste) o eterozigote per F508del (picco celeste e verde).

Se si osserva qualsiasi altra mutazione il campione può essere amplificato con la miscela B (WT) per determinare lo stato omozigote o eterozigote. La presenza di un picco verde per il particolare allelo della miscela WT indica che l’individuo è eterozigote e l’assenza del picco verde indica che l’individuo è omozigote per la particolare mutazione.

Figura 13 - Esempi di individui a) normali, b) eterozigoti e c) omozigoti per l’allelo 711+1G>T.

A B C

Un individuo che possiede due mutazioni diverse viene descritto come eterozigote composto (Figura 14).

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Figura 14 - Esempi di campioni eterozigoti composti. A) G85E/D1152H

B) F508del/E60X.

A

B

In entrambe le miscele sono inclusi due marker STR ipervariabili (rossi). Questo consente il confronto tra il campione amplificato con la miscela mutante e il campione amplificato con la miscela WT per ridurre il rischio di confusione tra i campioni (Figura 15). L’assenza di questi marker STR indica un campione non riuscito. La presenza dei marker STR a livelli RFU molto bassi indica un campione debole che deve essere analizzato con cautela.

Figura 15 - Grafici della miscela A e della miscela B che mostrano i due marker STR per un individuo.

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I marker STR ipervariabili possono essere nascosti disattivando i dati marcati in rosso nella finestra del grafico. La disattivazione dei dati marcati in celeste e verde facilita la visualizzazione dei marker STR.

Designazione dei marker GeneMapper Quando si visualizzano i dati dei tracciati analizzati in GeneMapper, i picchi diagnostici della miscela A vengono etichettati con il nome e il numero del marker. I picchi diagnostici della miscela B vengono etichettati solo con il numero del marker.

I dati di picco per un marker rilevato etichettato possono essere controllati ulteriormente facendo passare il cursore del mouse sull’etichetta del marker che interessa: nella parte inferiore della finestra dei grafici dei campioni vengono visualizzati il nome del marker, la dimensione del picco e l’altezza del picco.

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La correlazione tra i numeri dei marker e i marker è illustrata di seguito.

Marker rilevati

N. marker Marker Intervallo entità di prodotto in bp (dati 3130/POP7)

01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195

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* Dimensioni alleli 5T Nota: l’intervallo dell’entità di ciascun marker può variare in base allo strumento e al

polimero utilizzati.

Marker CF-EU2v1 dI507del Data la posizione della delezione I507 nel gene CFTR è possibile rilevare la presenza di questo marker tramite una variazione di 3 bp nella dimensione del picco F508del e del picco mutante specifico I507del. Laddove sia presente un singolo allelo mutante, si osserverà il picco mutante I507del come picco celeste a circa 159 bp. Si osserverà la presenza di un picco wild-type per F508del, ma a un’altezza di picco pari all’incirca la metà di quella normalmente associata a un genotipo wild-type omozigote; questo viene osservato come un picco verde a circa 167 bp. Si osserverà anche un altro picco verde a circa 164 bp (Figura 16).

Figura 16 - Campione eterozigote I507del.

Un campione I507del/F508del produrrà un picco WT F508del verde spostato all’incirca a 164 bp (3 bp in meno rispetto alla norma), un picco mutante F508del celeste a 166 bp e un picco mutante I507del celeste all’incirca a 159 bp. Un campione I507del/F507del produrrà un picco celeste all’incirca a 159 bp e un singolo picco verde all’incirca a 164 bp (3 bp in meno rispetto al picco F508del normale osservato quando I507del non è presente). Va notato che la presenza di una mutazione F508del impedisce l’azione del primer WT I507. Quindi, un individuo omozigote per F508del non presenterà un picco WT I507 nella miscela WT e un individuo eterozigote per F508del presenterà un picco WT I507 di altezza ridotta nella miscela WT.

Marker Intervallo entità di prodotto in bp POP7/3130

5T (9) 117,25 – 118,75 5T (10) 119,25 – 120,75 5T (11) 121,25 – 122,75 5T (12) 123,25 – 124,75 5T (13) 125,25 – 126,75

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Marker poly T Elucigene CF-EU2v1 contiene primer ARMS fluorescenti marcati con NED (giallo) per la rilevazione delle varianti IVS8-5T, IVS8-7T e IVS8-9T. Le informazioni su poly T per un campione possono essere determinate attivando la visualizzazione dei dati marcati in giallo nelle impostazioni CF-EU2v1 in GeneMapper. L’operatore può quindi scegliere di visualizzare questi dati come ritiene necessario nell’ambito della procedura di analisi del laboratorio. Nota: La miscela B non contiene primer poly T, quindi i prodotti saranno visualizzati solo nei campioni di miscela A. Analisi poly T I seguenti esempi di GeneMapper mostrano morfologie di picco caratteristiche delle regioni varianti di IVS8 analizzate. Esempio 1: Campione IVS8-5T / IVS8-9T L’esempio in basso mostra il risultato della miscela A osservato utilizzando le impostazioni del grafico ‘CFEU2 Plot PT-on’ (CFEU2 grafico PT-attivo).

La rimozione delle informazioni di colore verde e celeste nelle impostazioni del grafico per lo stesso campione mostra chiaramente il marker poly T, mostrato in basso.

Esempio 2: Campione IVS8-7T / IVS8-7T

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Esempio 3: Campione IVS8-7T / IVS8-7T (variabilità ripetizione TG).

I due picchi sono dovuti all’eterozigosità della regione di ripetizione TG che rientra nel nostro amplicone. Questo effetto può essere osservato anche con i campioni omozigoti 5T e 9T. È quindi possibile determinare il numero di ripetizioni TG all’interno di ogni variante poly T (politimidina) dell’IVS8. Esempio 4: Campione IVS8-9T / IVS8-9T

Avviso importante In certe condizioni di analisi è possibile che artefatti del colore osservabili possano interferire con l’analisi di routine. È importante che l’operatore sia consapevole della possibilità di interferenza per garantire la corretta analisi dei dati. Gli artefatti del colore di marcatura possono essere osservati come picchi celesti o verdi piccoli. Questi artefatti del colore sono generalmente di dimensione inferiore a 100 bp e solitamente non interferiscono con l’analisi dei dati. In condizioni normali questi picchi artefatti sono insignificanti in relazione ai picchi di ampliconi reali e non causano alcun problema con l’analisi. Tuttavia, quando la quantità di amplicone caricata è piccola, probabilmente a causa di un DNA genomico limitante, i picchi causati da artefatti del colore si presentano relativamente più grandi con il rischio di essere analizzati come picchi di ampliconi reali.

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Analisi GeneMarker Introduzione La sezione seguente descrive le procedure per l’analisi dei campioni di risultati Elucigene CF-EU2v1 mediante il pacchetto software SoftGenetics GeneMarker versione 1.95. Processo di analisi Il processo per l’analisi dei campioni è riepilogato nel diagramma di flusso riportato di seguito.

Analizzare i campioni amplificati su Genetic Analyzer

Aprire il software GeneMarker

Aggiungere al progetto i file FSA dei campioni

Selezionare il pannello CF-EU2v1 appropriato e le impostazioni di analisi

Eseguire l’analisi dei campioni

Selezionare “Mutant + Wild-type” (Mutante + wild-type) o

“Mutant Only” (Solo mutante)

Selezionare l’applicazione: ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Analisi comparativa)

Selezionare Print (Stampa)

Selezionare Preview (Anteprima)

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Aggiunta dei file dei campioni a GeneMarker Aprire il file del programma GeneMarker e quando viene richiesto selezionare ‘Open Data’ (Apri dati). Appare la finestra Open Data Files (Apri file di dati).

Fare clic sul pulsante ‘Add’ (Aggiungi). Appare la finestra Open (Apri).

Cercare la directory contenente i file di dati grezzi. ● Selezionare tutti i file con CTRL+A o usare i tasti CTRL e/o MAIUSC per

selezionare singoli campioni. ● Fare clic sul pulsante Open (Apri) nella finestra di dialogo Open (Apri).

I file selezionati appaiono nel campo Data File List (Elenco file di dati) (Figura 1).

Fare clic sul pulsante OK nella finestra Open Data Files (Apri file di dati) e i campioni saranno caricati in GeneMarker.

Il software apre quindi automaticamente la finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi) (Figura 2).

Figura 1 - Campioni aggiunti all’elenco dei file di dati.

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Figura 2 - Finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi).

Elaborazione dei dati Dopo il caricamento in GeneMarker, i file di dati grezzi sono pronti per essere elaborati. La fase di elaborazione include l’applicazione di size standard, l’applicazione di filtri ai picchi rumorosi e, volendo, il confronto con un pannello di alleli noto.

GeneMarker combina tutte queste fasi in unico, semplice strumento denominato Run Wizard (Procedura guidata di analisi) (Figura 3). Per accedere alla procedura guidata di analisi basta fare clic sull’icona del progetto di analisi nella barra degli strumenti principale.

Figura 3 - Procedura guidata di analisi – Finestra di selezione del modello.

Elenco campioni Immagine gel sintetica

Tracciato dei dati grezzi

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Procedura guidata di analisi – Finestra di selezione del modello

Creare un modello CF-EU2v1 e selezionare le impostazioni per Size Standard, Standard Colour (Colore standard) e Analysis Type (Tipo di analisi) (Figura 3).

Selezionare il pannello appropriato in base alla piattaforma utilizzati, ad esempio CF-EU2v1_POP7. Questi sono disponibili sul sito web di Gen-Probe: www.gen-probe.com. Scaricarle in una cartella appropriata sul proprio sistema.

Fare clic su ‘Next’ (Avanti) per continuare.

Procedura guidata di analisi – Data Process (Elaborazione dati)

La finestra Data Process (Elaborazione dati) della procedura guidata di analisi consente di selezionare i parametri dei filtri da applicare ai picchi.

Assicurarsi che le impostazioni siano selezionate come mostrato nella Figura 4.

Fare clic su ‘Next’ (Avanti) per continuare.

Figura 4 - Procedura guidata di analisi – Finestra Data Process (Elaborazione dati).

NOTA: Per 3500 dati aumentare Min Intensity (Intensità min.) a 300.

Procedura guidata di analisi – Altre impostazioni

Quando si esegue l’analisi CF-EU2v1, non sono richieste altre impostazioni.

Fare clic su ‘OK’ per continuare.

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Figura 5 - Procedura guidata di analisi – Additional Settings (Altre impostazioni).

Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) Dopo aver fatto clic su OK nella finestra Run Wizard Additional Settings (Procedura guidata di analisi – Altre impostazioni) viene visualizzata la finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) (Figura 6). I dati grezzi vengono elaborati e calibrati, vengono applicati i parametri dei filtri, quindi viene applicato il pannello CF-EU2v1 selezionato.

Al termine dell’analisi, fare clic su ‘OK’ nella finestra Data Processing (Elaborazione dei dati).

Figura 6 - Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati).

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Finestra di analisi principale La finestra di analisi principale (Figura 7) di GeneMarker presenta un formato facile da usare. Questo formato include:

● The sample files list (elenco dei file dei campioni) - visualizzato a sinistra della finestra;

● The Synthetic Gel Image (immagine gel sintetica) - visualizzata nella parte superiore della finestra;

● Data Electropherograms (elettroferogrammi dei dati) - sotto l’immagine gel;

● A Report Table (tabella dei rapporti) - visualizzata sul lato destro della finestra.

In questa finestra è importante controllare che tutti i picchi appropriati di ciascun profilo siano stati denominati correttamente.

Fare doppio clic su ciascun campione in sequenza nell’elenco dei file dei campioni sul lato sinistro dello schermo. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi picco in questione e scegliere tra le opzioni nella finestra di dialogo, ad esempio modificare o eliminare alleli, confermare o meno come pertinente.

Nei casi in cui un picco non sia stato denominato affatto poiché è al di sotto della soglia, è possibile assegnare un allelo manualmente. Selezionare il ‘Marker’ appropriato nella casella a discesa, tenendo premuto il tasto Maiusc fare clic con il pulsante destro del mouse sul picco in questione, quindi fare clic su ‘Insert Allele’ (Inserisci allelo) e poi su ‘OK’. Quando si analizzano i dati della miscela A e della miscela B insieme, è importante garantire che siano stati denominati tutti i picchi STR.

Una volta completato questo processo per tutti i campioni, è possibile eseguire la fase successive dell’analisi.

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Figura 7 - Finestra di analisi principale.

Analisi del solo mutante (miscela A) Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa ‘Applications’ (Applicazioni) nella parte superiore dello schermo.

Selezionare ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa) e poi ‘Mutant Only’ (Solo mutante). Nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) selezionare ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) se si desidera effettuare questa l’analisi (Figura 8).

Fare clic su ‘Preview’ (Anteprima) nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) per visualizzare il rapporto Elucigene CF-EU2v1 solo mutante (miscela A) (Figura 11). Questa finestra consente di esaminare e stampare il rapporto di ciascun campione.

Fare clic su ‘OK’ nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) per stampare il rapporto Elucigene CF-EU2v1 solo mutante (miscela A) (Figura 11) senza visualizzare un’anteprima.

Elenco dei file dei campioni

Immagine gel sintetica Elettroferogramma Tabella dei

rapporti

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Figura 8 - Finestra ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/Analisi comparativa) per Mutant only (Solo mutante).

Visualizzazione in anteprima del rapporto Elucigene CF-EU2v1 Rapporto del solo mutante (miscela A)

Fare clic su ‘Preview’ (Anteprima) nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) per visualizzare il rapporto Elucigene CF-EU2v1 miscela A (Figura 11). Questa finestra consente di esaminare e stampare il rapporto di ciascun campione.

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Figura 11 - Finestra del rapporto CF-EU2v1 solo mutante (miscela A).

Il rapporto Elucigene CF-EU2v1 include gli elementi descritti di seguito.

● Report Header (titolo del rapporto): contiene informazioni sull’analisi, sul progetto, sul campione e sui parametri.

● Signature Box (Casella della firma): data e spazio per le iniziali dei revisori del rapporto.

● Electropherogram (Elettroferogramma): simile alla finestra ARMS/analisi comparativa, visualizza tutti i colori del tracciato del campione.

● Report Table (Tabella dei rapporti): la tabella principale visualizza tutte le mutazioni analizzate con questo kit. La presenza o l’assenza di una mutazione viene indicata con 1 o con 0. Si noti che lo stato di zigosità totale può essere riportato solo per il locus F508 quando si analizza solo la miscela A. La seconda tabella mostra lo stato poly T del campione se questa funzione è stata selezionata.

Analisi della miscela mutante + wild-type (A e B) Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa ‘Tools’ (Strumenti) nella parte superiore dello schermo e poi ‘File Name Group Tool’ (Strumento gruppo nomi file). Si apre la schermata ‘File Name Group Editor’ (Modifica gruppo nomi file). Nella casella ‘Compare by Section’ (Confronta in base a sezione), digitare il numero della colonna in cui appare il nome del campione. Nella casella ‘Match to Identifier by Section’ (Abbina a identificativo in base a sezione), digitare il numero

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della colonna in cui appare il tipo di miscela (ovvero A o B). Nella casella ‘Control Identifier’ (Identificativo controllo), digitare ‘A’. Fare clic sul pulsante ‘Match’ (Abbina) e sul lato destro della finestra di dialogo appariranno i campioni corrispondenti (Figura 9).

Figura 9 - Schermata File Name Group Editor (Modifica gruppo nomi file).

Salvare il gruppo corrispondente in una cartella appropriata facendo clic sull’icona nella parte superiore della sezione ‘Matched Groups’ (Gruppi corrispondenti).

Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa ‘Applications’ (Applicazioni) nella parte superiore dello schermo.

Selezionare ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa) e poi ‘Mutant + Wildtype’ (Mutante + wild-type). Nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa) selezionare prima il ‘Group File’ (File gruppo) rilevante, quindi selezionare ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) se si desidera effettuare questa analisi e/o ‘STR Check’ (Controllo STR) (Figura 10a). Quindi fare clic su ‘OK’ per visualizzare la finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa) (Figura 10b).

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Figura 10a - Finestra ARMS/Comparative Analysis Settings Box (Impostazioni di ARMS/analisi comparativa).

Figura 10b - Finestra ARMS/Comparative Analysis (ARMS/Analisi comparativa).

Visualizzazione in anteprima del rapporto Elucigene CF-EU2v1

Rapporto mutante + wild-type (miscela A + B)

Fare clic sull’icona di stampa nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa). Selezionare ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) se si desidera effettuare questa analisi e/o ‘STR Check’ (Controllo STR) (Figura 12a). Selezionare ‘Preview’ (Anteprima) per visualizzare il rapporto Elucigene CF-EU2v1 A + B (Figura 12b). Questa finestra consente di esaminare e stampare il rapporto di ciascun campione.

File in gruppi

Elettroferogrammi Istogramma

delle differenze

Tabella dei

rapporti

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Figure 12a - Finestra ARMS/Comparative Print Settings (Impostazioni di stampa ARMS/comparativa).

Figura 12b - Finestra del rapporto CF-EU2v1 mutante + wild-type (miscela A e B).

Il rapporto Elucigene CF-EU2v1 include gli elementi descritti di seguito. ● Report Header (titolo del rapporto): contiene informazioni sull’analisi, sul

progetto, sul campione e sui parametri.

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● Signature Box (casella della firma): data e spazio per le iniziali dei revisori del rapporto. È disponibile un’ulteriore colonna Check (Controllo) per le iniziali del revisore.

● Electropherogram (elettroferogramma): simile alla finestra ARMS/Comparative Analysis Settings Box (ARMS/analisi comparativa), visualizza tutti i colori del tracciato del campione.

● Report Tables (tabelle dei report): la tabella principale visualizza tutte le mutazioni analizzate con questo kit. lo stato omozigote o eterozigote è indicato dal numero di alleli wild-type o mutanti riportati da ciascun locus. La seconda tabella mostra lo stato poly T del campione se questa funzione è stata selezionata.

● Trace (Istogramma di confronto dei tracciati): GeneMarker calcola le differenze alleliche tra i tracciati della miscela A e della miscela B e le visualizza in un istogramma situato sotto gli elettroferogrammi dei campioni.

Etichette dei picchi

Le etichette dei picchi sono contrassegnate a colori in base alla qualità della corrispondenza tra il picco rilevato e i bin dei pannelli osservati. Nell’elettroferogramma, i marcatori sono barre grigie orizzontali e il centro dei picchi è contrassegnato con una barra grigia verticale.

I picchi che cadono al di fuori dei marker o bin del pannello sono contrassegnati in rosso come Off Ladder (OL) (Fuori scala).

Nota: Le differenze in termini di tipo di polimero della macchina e size standard potrebbero necessitare di un’ottimizzazione dei marker bin al fine di adattare il software alle condizioni di analisi utilizzate. Ulteriori informazioni sulla modifica dei panel bin sono disponibili nel manuale GeneMarker in dotazione al software.

Valutazione dei picchi diagnostici Un individuo possiede due copie del gene CFTR. Qualora queste copie presentino la stessa sequenza per un dato allelo, l’individuo viene descritto come omozigote per questo sito. Qualora le copie presentino una sequenza diversa per un dato allelo, l’individuo viene descritto come eterozigote (Figura 13).

La miscela A (mutante) determina se un individuo presenta una mutazione mostrata dalla presenza di un picco celeste. La miscela mutante contiene anche primer per l’allelo F508del normale, quindi questa miscela può determinare se una persona è normale per F508del (solo picco verde), omozigote per F508del (solo picco celeste) o eterozigote per F508del (picco celeste e verde).

Se si osserva qualsiasi altra mutazione il campione può essere amplificato con la miscela B (WT) per determinare lo stato omozigote o eterozigote. La presenza di un picco verde per il particolare allelo della miscela WT indica che l’individuo è eterozigote e l’assenza del picco verde indica che l’individuo è omozigote per la particolare mutazione.

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Figura 13 - Esempi di individui a) normali, b) eterozigoti e c) omozigoti per l’allelo 711+1G>T.

A B C

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Un individuo che possiede due mutazioni diverse viene descritto come eterozigote composto (Figura 14).

Figura 14 - Esempi di campioni eterozigoti composti. A) W1282X/S1251N

B) F508del/R560T.

A

B

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In entrambe le miscele sono inclusi due marker STR ipervariabili (rossi). Questo consente il confronto tra il campione amplificato con la miscela mutante e il campione amplificato con la miscela WT per ridurre il rischio di confusione tra i campioni (Figura 15). L’assenza di questi marker STR indica un campione non riuscito. La presenza dei marker STR a livelli rfu molto bassi indica un campione debole che deve essere analizzato con cautela.

Figura 15 - Grafici della miscela A e della miscela B che mostrano i due marker STR per un individuo.

I marker STR ipervariabili possono essere nascosti deselezionando ‘STR Check’ (Controllo STR) nella finestra ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa), se si analizza solo la miscela A, o nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa), se si analizzano la miscela A e la miscela B. La visualizzazione dei soli dati di colore rosso nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa) facilita la visualizzazione dei marker STR.

Designazione dei marker GeneMarker Quando si visualizzano i dati dei tracciati analizzati in GeneMarker, i picchi diagnostici della miscela A vengono etichettati con il nome del marker. I picchi diagnostici della miscela B vengono etichettati solo con il numero del marker seguito dal suffisso ‘WT’ se visualizzati solo con il colore verde selezionato.

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La correlazione tra i numeri dei marker e i marker è illustrata di seguito.

Marker rilevati

N. marker Marker Intervallo entità di prodotto in bp (dati 3130/POP7)

01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195

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* Dimensioni alleli 5T

Nota: l’intervallo dell’entità di ciascun marker può variare in base allo strumento e al

polimero utilizzati.

Marker CF-EU2v1 dI507del Data la posizione della delezione I507 nel gene CFTR è possibile rilevare la presenza di questo marker tramite una variazione di 3 bp nella dimensione del picco F508del e del picco mutante specifico I507del. Laddove sia presente un singolo allelo mutante, si osserverà il picco mutante I507del come picco celeste a circa 159 bp. Si osserverà la presenza di un picco wild-type per F508del, ma a un’altezza di picco pari all’incirca la metà di quella normalmente associata a un genotipo wild-type omozigote; questo viene osservato come un picco verde a circa 167 bp. Si osserverà anche un altro picco verde a circa 164 bp (Figura 16).

Figura 16 - Campione eterozigote I507del

Un campione I507del/F508del produrrà un picco WT F508del verde spostato all’incirca a 164 bp (3 bp in meno rispetto alla norma), un picco mutante F508del celeste a 166 bp e un picco mutante I507del celeste all’incirca a 159 bp. Un campione I507del/F507del produrrà un picco celeste all’incirca a 159 bp e un singolo picco verde all’incirca a 164 bp (3 bp in meno rispetto al picco F508del normale osservato quando I507del non è presente).

Marker Intervallo entità di prodotto in bp POP7/3130

5T (9) 117,25 – 118,75 5T (10) 119,25 – 120,75 5T (11) 121,25 – 122,75 5T (12) 123,25 – 124,75 5T (13) 125,25 – 126,75

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Va notato che la presenza di una mutazione F508del impedisce l’azione del primer WT I507. Quindi, un individuo omozigote per F508del non presenterà un picco WT I507 nella miscela WT e un individuo eterozigote per F508del presenterà un picco WT I507 di altezza ridotta nella miscela WT. Marker poly T Elucigene CF-EU2v1 contiene primer ARMS fluorescenti marcati con NED (giallo) per la rilevazione delle varianti IVS8-5T, IVS8-7T e IVS8-9T. Le informazioni poly T per un campione possono essere determinate attivando la visualizzazione dei dati marcati in giallo nella finestra di analisi principale di GeneMarker (Figura 7). I marker poly T possono essere nascosti deselezionando ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) nella finestra ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa), se si analizza solo la miscela A, o nella finestra ‘ARMS/Comparative Analysis’ (ARMS/Analisi comparativa), se si analizzano la miscela A e la miscela B. L’operatore può quindi scegliere di visualizzare questi dati come ritiene necessario nell’ambito della procedura di analisi del laboratorio. Nota: La miscela B non contiene primer poly T, quindi i prodotti saranno visualizzati solo

nei campioni di miscela A. Analisi poly T I seguenti esempi di GeneMarker mostrano morfologie di picco caratteristiche delle regioni varianti di IVS8 analizzate.

Gli esempi riportati in basso mostrano i risultati della miscela A osservati quando nella finestra di dialogo ‘ARMS/Comparative Print Settings’ (Impostazioni di stampa ARMS/Comparativa) è stata selezionata l’opzione ‘Poly-T Analysis’ (Analisi poly T) ed è stato scelto di analizzare solo la miscela A. Esempio 1: Campione IVS8-5T / IVS8-7T

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Esempio 2: Campione IVS8-7T / IVS8-7T

Esempio 3: Campione IVS8-7T / IVS8-7T (variabilità ripetizione TG)

I due picchi sono dovuti all’eterozigosità della regione di ripetizione TG che rientra nel nostro amplicone. Questo effetto può essere osservato anche con i campioni omozigoti 5T e 9T. È quindi possibile determinare il numero di ripetizioni TG all’interno di ogni variante poly T (politimidina) dell’IVS8.

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Esempio 4: Campione IVS8-9T / IVS8-9T

Avviso importante In certe condizioni di analisi è possibile che artefatti del colore osservabili possano interferire con l’analisi di routine. È importante che l’operatore sia consapevole della possibilità di interferenza per garantire la corretta analisi dei dati. Gli artefatti del colore di marcatura possono essere osservati come picchi celesti o verdi piccoli. Questi artefatti del colore sono generalmente di dimensione inferiore a 100 bp e solitamente non interferiscono con l’analisi dei dati. In condizioni normali questi picchi artefatti sono insignificanti in relazione ai picchi di ampliconi reali e non causano alcun problema con l’analisi. Tuttavia, quando la quantità di amplicone caricata è piccola, probabilmente a causa di un DNA genomico limitante, i picchi causati da artefatti del colore si presentano relativamente più grandi con il rischio di essere analizzati come picchi di ampliconi reali. ELUCIGENE è un marchio di Gen-Probe Life Sciences Ltd. ARMS è un marchio di AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP è un marchio di Qiagen GmbH. GENEMARKER è un marchio di SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, VIC, NED, POP-7, HI-DI e PET sono marchi di Life Technologies Corporation. AVVISO PER L’ACQUIRENTE: LICENZA LIMITATA I polinucleotidi marcati con coloranti VIC, NED e PET e/o il rispettivo impiego possono essere coperti da uno o più brevetti di proprietà di Applied Biosystems, LLC. Il prezzo di acquisto di questo prodotto include diritti limitati non trasferibili secondo specifiche rivendicazioni di alcuni brevetti appartenenti ad Applied Biosystems, LLC, che prevedono l’uso della sola quantità stabilita di prodotto esclusivamente per procedure condotte dall’acquirente a scopo di rilevamento del/dei target nel settore della diagnostica umana. Non sono concessi altri diritti. Per altre informazioni sull’acquisto di licenze relative ai coloranti sopra indicati, rivolgersi al Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. Copyright 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd.

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