Diagnostica di laboratorio della tubercolosi:

le antiche certezze e le nuove frontiere

Dr. Chiara Agrati, PhD

Laboratorio di Immunologia cellulareINMI L. Spallanzani

La diagnosi immunologica

dell’infezione tubercolare

Mycobacterium tubercolosis e l’uomo:

Un equilibrio complesso e delicato

Una malattia persistente

Rappuoli R. Nat Med 2004

Infezione tubercolare latente (2 miliardi)Infezione tubercolare latente (2 miliardi)

Infezione subclinica con bacilli tubercolari senza

segni clinici, batteriologici o radiologici di malattia

manifesta. Tipicamente si tratta di individui con

intradermoreazione tubercolinica positiva ed un Rx

torace normale, che possono essere contatti di un

precedente caso di tubercolosi.

Infezione latente e malattia attiva

Infezione tubercolare attiva (8 milioni/anno)Infezione tubercolare attiva (8 milioni/anno)Stato di malattia manifesta dal punto di vista clinico, batteriologico e/o radiologico.

High Innate

immunityMTB clearence NO Infection

Innate

immunity

Adaptive

immunity

Latent

Infection

Innate

immunity

Defective

Adaptive

immunity

Disease <10%

Controlled

>90%

Reactivation

<10%

Risposta immunologica e esito

dell’infezione

Gran parte del “successo” di Mtbcome agente patogeno è dovuto allasua capacità di interferire conpraticamente ogni meccanismobattericida del macrofagoutilizzando tale tipo cellulare comeun cavallo di “Troia” per sfuggireal riconoscimento immune

• Infezione attiva: a) Microbiologica (Microscopia, Coltura e Metodi molecolari)

b) Radiologica

• Infezione latentea) Test immunologici che valutano la risposta immune

(Mantoux, IGRA)

• Immunità umorale - Riscontro in circolo di anticorpi

• Immunità cellulo-mediata - Riscontro in circolo di

cellule T specifiche per il patogeno

Diagnosi

ANTIGENE

LINFOCITI

RESPONSIVI

MECCANISMO

EFFETTORE

BATTERI EXTRA-CELLULARI MICROBI INTRA-CELLULARI

ALL’INTERNO DI UN MACROFAGO

LINFOCITA B LINFOCITA TLINFOCITA T

ANTICORPI

SECRETI

ELIMINAZIONE

DEI BATTERI

MICROBI INTRA-CELLULARI

IN UNA CELLULA INFETTATA

ATTIVAZIONE DEL MACROFAGO

UCCISIONE DEI MICROBILISI DELLA CELLULA

INFETTATA

IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATAIMMUNITA’ UMORALE

Immunità umorale e cellulo-mediata

• CD4: - Induzione dei meccanismi battericidi del macrofago

- Rimozione del blocco della maturazione del fagosoma e della fusione del fagolisosoma

- aumento delle molecole costimolatorie

- Produzione di citochine infiammatorie

• CD8:- Lisi delle cellule infette mediata da citochine

- Lisi delle cellule infette mediata da granulolisine

Il ruolo dei linfociti T

Il principale obiettivo dei test immunologici è di identificare le

infezioni tubercolari latenti

Ma non discriminano tra infezione latente e attiva

1) Mantoux, introdotta nel 1891

2) IGRA: Interferon-gamma release assay (dal 2001)2a) Quantiferon TB Gold2b) Quantiferon TB In tube2b) QTSPOT-TB

I test immunologici

• E’il più vecchio test diagnostico ancora in uso-1891: filtrato di brodo di coltura (reazione febbrile)-1934 PPD (reazione cutanea di ipersensibilità ritardata)-Oggi: inoculazione intradermica di 5UI di PPD e lettura dopo 48-72h.

–il soggetto che ha immunità specifica produce una papula (lettura dopo 48-72 h)

– si misura l’infiltrato, non l’eritema

La Mantoux

• Utile per predire la TBC attiva

• Il trattamento dei soggetti Mantoux positivi

riduce drasticamente il rischio di passaggio alla

tubercolosi attiva

• Basso costo

• Non richiede l’intervento del laboratorio

Vantaggi della Mantoux

• legati a cross-reazione con altri micobatteri

• legati a vaccinazione con BCG

• effetto booster

• legati alla somministrazione

• legati alla lettura

falsi positivifalsi positivi

Problemi di ordine praticoProblemi di ordine pratico

• 2 visite (inoculo e lettura

• 30% dei test rimane senza lettura

Limiti della Mantoux (1)

– malattie degli organi

linfoidi (HD, linfomi…)

– età (neonati, anziani)

– infezione di MTB recente

– stress (chirurgia, GVHD…)

• legati alla tubercolina

– improprio stoccaggio, diluizione…

• legati alla somministrazione– quantità insufficiente di

antigene somministrato

– ritardo dopo la

preparazione della siringa

• legati alla lettura

– inesperienza del lettore – errori consci o inconsci

• legati al soggetto testato

– infezioni

– disturbi metabolici

– fattori nutrizionali

– farmaci (corticosteroidi,

agenti immunosoppressivi…)

falsi negativifalsi negativi

Vantaggi della Mantoux (2)

Cut-off di positività per gruppi di rischio

≥ 5 mm ≥ 10 mm ≥ 15 mm

- HIV positivi

- contatti recenti di TB

- rx compatibile con TB

- trapiantati e immunosoppressi

- immigrati di recente da aree ad alta prevalenza

- tossicodipendenti

- residenti e operatori di ambienti a rischio

- silicosi, diabete mellito, IRC, leucemie, carcinomi…

- soggetti senza fattori di rischio

Lettura della Mantoux: cut-off

IGRA: Interferon gamma release assay

3 principali modifiche rispetto alla Mantoux:

a) test in vitroin vitro

b)Antigeni utilizzati: per la stimolazione vengono utilizzati gli antigeni ESATESAT--66 e e CFPCFP--1010, , specifici per specifici per MTB ed assenti nel BCGMTB ed assenti nel BCG

c)c)Hanno un Hanno un controllo positivo controllo positivo di immunocompetenzadi immunocompetenza

I test IGRA

IGRA: tests in vitro

Measurement of IFN-γ

La scelta degli antigeni

• La Manotux si base sull’inoculazione di PPD (purified

proteic derivative) che è presente in molti altri micobatteri

ambientali e anche nella vaccinazione con BCG.

Gli IGRA utilizzano antigeni codfificati in una regione

genica (RD-1) che manca nel BCG e in quasi tutti i

micobatteri ambientali. I principali di questi anti geni sono:

– ESAT-6 (early secretory antigenic target 6)

– CFP-10 (culture filtrate protein 10)

IGRA: antigeni specifici

> specificità

E’ importante per evidenziare

FALSI NEGATIVI

IGRA: controllo positivo

Test in vitro

Vantaggi degli IGRA

Nessun effetto booster

Specificità elevata (antigeni ESAT-6 e CFP-10 codificati in una regione genica (RD1)

Non influenzati dalla vaccinazione con BCG

Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non èrichiesta la collaborazione del paziente

Interpretazione oggettiva (fornisce un dato di Laboratorio, positivo o negativo,rispetto ad un “cut-off” universale per tutti i soggetti, indipendentemente dal fattore di rischio cui sono esposti)

Disponibilità di un controllo mitogeno (QFT-TB GOLD) che permette di verificare la risposta immunitaria del paziente.

Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari

Limiti degli IGRA

• I campioni di sangue devono essere processati entro

8-16 ore

• Esistono meno dati sull’utilizzo di questi test in alcune

popolazioni di soggetti come immunocompromessi,

bambini e nei follow up seriali

Sensibilità

NON esiste un gold standard

1)Proporzione di test positivi in soggetti con TB attiva2)Stima della sensibilità usando il gradiente di esposizione

Specificità

NON esiste un gold standard

Il Quantiferon è chiaramente più sensibile negli individui vaccinati

Quale test è più opportuno utilizzare ?

E’ preferibile usare Mantoux

E’ preferibile usare IGRA

1) Nei bambini al di sotto dei 5 anni di età .Alcuni esperti suggeriscono che per aumentare la sensibilità sarebbe meglio farli entrambi.

1) Persone ad alto rischio di non presentarsi alla 2 visitaper la lettura (tossicodipendenti, senza tetto, etc);

2) Persone vaccinate con BCG ;3) Nei follow-up per evitare l’effetto booster

=

Paragonabili

1) Contatti recenti con persone con TB attiva o sospetta TB attiva. Sul

TST ci sono più dati ma c’è rischio effetto Booster; per gli IGRA meno

dati sui tempi di conversione

2) Screening occupazione per persone a rischio (HCWs). Problema

delle conversioni/reversioni

Quale test è più opportuno utilizzare ?

Mantoux + IGRA

+

1) Test iniziale negativo:

1a) gruppi ad alto rischio di infezione e progfresisone (HIV, bambini < 5

anni);

2a) sospetto fondato di infezione e si desidera conferma

2) Test iniziale positivo:

2a) servono ulteriori evidenze per convincere pazienti;

2b) grupi a bassissimo rischio

3) Nei casi in cui test IGRA è indeterminato/borderline/etc .

GRAZIE PER L’ATTENZIONE

Laboratorio di Immunologia Cellulare

Federico MartiniCristiana GioiaAlessandra RinaldiDomenico ViolaFederica Turchi