Dottorato di ricerca in Biologia Computazionale (XVI ciclo) Dott.ssa Costantini Susan 20 dicembre...

Dottorato di ricerca in Biologia Computazionale (XVI ciclo)

Dott.ssa Costantini Susan

20 dicembre 2004

Basi molecolari dell’attività biologica delle proteine:

l’approccio computazionale e bioinformaticoalla comprensione della relazione

Struttura-Funzione

Basi molecolari dell’attività biologica delle proteine:

l’approccio computazionale e bioinformaticoalla comprensione della relazione

Struttura-Funzione

Sequenza – Struttura - Funzione

Strutture-proteineGenoma

MYSFPNSFRFGWSQAGFQSEMGTPGSEDPNTDWYKWVHDPENMAAGLVSGDLPENGPGYWGNYKTFHDNAQKMGLKIARLNVEWSRIFPNPLPRPQNFDESKQDVTEVEINENELKRLDEYANKDALNHYREIFKDLKSRGLYFILNMYHWPLPLWLHDPIRVRRGDFTGPSGWLSTRTVYEFARFSAYIAWKFDDLVDEYSTMNEPNVVGGLGYVGVKSGFPPGYLSFELSRRHMYNIIQAHARAYDGIKSVSKKPVGIIYANSSFQPLTDKDMEAVEMAENDNRWWFFDAIIRGEITRGNEKIVRDDLKGRLDWIGVNYYTRTVVKRTEKGYVSLGGYGHGCERNSVSLAGLPTSDFGWEFFPEGLYDVLTKYWNRYHLYMYVTENGIADDADYQRPYYLVSHVYQVHRAINSGADVRGYLHWSLADNYEWASGFSMRFGLLKVDYNTKRLYWRPSALVYREIATNGAITDEIEHLNSVPPVKPLRH

Sequenze-proteine

Funzioni

• Meccanismo d’azione

• Specificità per ligandi

• Interazioni proteina-proteina

20 dicembre 2004

Struttura tridimensionale delle proteine

Metodi Sperimentali

• Diffrazione ai Raggi X (RX)

• Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)

Metodi Computazionali

• Riconoscimento di fold

• Folding ab-initio

• Modellamento Comparativo Modellamento Comparativo

20 dicembre 2004

Modellamento Comparativo

Alta identità di sequenza

buon allineamento delle sequenze

buoni modelli ottenuti per omologia

Permette di costruire il modello 3D di una proteina (‘target’) a partire da proteine omologhe (‘template’), la cui struttura è stata caratterizzata sperimentalmente.

La percentuale di identità di sequenza tra la proteina target e quelle template deve essere superiore al 20-40%20-40%..

20 dicembre 2004

Il modellamento per omologia richiede l’utilizzo di numerosi strumenti bioinformatici e computazionali:

- per l’estrazione di informazioni da banche dati di sequenze (UNIPROT) e di strutture tridimensionali (PDB)

- per il confronto e l’allineamento delle sequenze (BLAST e CLUSTAL)

- per la costruzione dei modelli strutturali per la proteina in esame (MODELER,QUANTA, INSIGHT)

- per la valutazione della loro qualità (PROCHECK e PROSA).

Modellamento Comparativo

20 dicembre 2004

RICERCA DEL TEMPLATE

ALLINEAMENTO MULTIPLO TARGET-TEMPLATE

Modellamento comparativo

PROTEINA TARGET

BLAST

CLUSTALW

MODELLER

VALUTAZIONE DEL MODELLO

PROCHECK

---VPIRQLHYRLRDEQQKSLVLSDP-YELKALHLNGQNINQQVIF AQYSKRREVQCSVTDSEKRSLVLVPNSMELHAVMLQGGSDRCKVQL SMSFVQ--GEPSNDKIPVALGLKGKNLYLSCVMKDGTPTLQLESVD NMSTYLDRTP-SAEAQTVALGIKGTNYYLSCHKDGEEPTLHLEVVD PKQYPKKKM----EKRFVFNKIEV-KSKVEFESAEFPNWYISTSQA -KASLANITSDSDMVRFLFYKQDSGLNISTLTSVPFSNWYISTAEE EHKPVFLGNNSG-QDIIDKFTMESVS NNRPVQMCQESAR-RHRAFNIDNLKV

TARGET: AQYSKRREVQCSVTDSEKRSLVLVPNSMELHAVM……

TEMPLATE: VPIRQLHYRLRDEQQKSLVLSDPYELKALHLNGQN…

MODELLO DELLA PROTEINA TARGET A PARTIRE DALLA

STRUTTURA TEMPLATE

20 dicembre 2004

Scopo della tesi

20 dicembre 2004

Applicazioni di metodi computazionali, già noti, per

studiare le proprietà strutturali e funzionali delle

proteine.

Sviluppo di nuovi strumenti di analisi e predizione, al

fine di migliorare quelli già esistenti.

Applicazioni dei metodi computazionali

1. Modellamento di complessi tra interleuchine-1 ed i loro recettori.

2. Studio della struttura e dell’interazione tra le proteine coinvolte nella malattia celiaca.

3. Simulazioni, mediante l’utilizzo del modellamento comparativo, dei cambiamenti conformazionali che si verificano quando le proteine interagiscono tra loro.

20 dicembre 2004

Interleuchina-1 (IL-1) è un mediatore della risposta immunitaria

IL-1 IL-1 , IL-1, IL-1ra

Esistono due recettori: IL-1RI e IL-1RII

L’attività biologica di IL-1

conseguenza del “binding” con il proprio recettore

formazione del complesso IL-1/IL-1R.

1. Modellamento di complessi tra interleuchine-1 ed i loro recettori

20 dicembre 2004

Simulazione dei complessi IL-1/IL-1RI in trota e topo.

Predizione della struttura tridimensionale

- di IL-1 di spigola e di trota

- dei recettori di tipo I (IL-1RI) di trota e topo.

Simulazione del complesso IL-1 (trota)/IL-1RI (topo)

al fine di dare una interpretazione a livello molecolare dei dati sperimentali circa l’attività biologica di rIL-1 di trota.

1. Modellamento di complessi tra interleuchine-1 ed i loro recettori

20 dicembre 2004

IL-1 di spigola e trota

Ricerca dei template con BLAST: IL-1 umana [PDB: 1IOB]

IL-1 topo [PDB: 2MIB]

IL-1IL-1 uomouomo topotopo trotatrota spigolaspigola

uomouomo 100100 78 (86)78 (86) 34 (49)34 (49) 37 (51)37 (51)

topotopo 100100 36 (49)36 (49) 32 (50)32 (50)

trotatrota 100100 54 (71)54 (71)

spigolaspigola 100100

In tabella sono riportate le % di identità di sequenza e tra parentesi le similarità.

20 dicembre 2004

N-end

C-end-bulge loop

IL-1 di trota

N-end

C-end-bulge loop

IL-1 di spigola

Entrambi sono caratterizzati da una piccola -elica (5% della sequenza) e da 12 -strand antiparalleli (40% della sequenza), definendo la struttura come “mainly-beta” con topologia di tipo -trefoil, in accordo con la classificazione di CATH e SCOP.

20 dicembre 2004

PDB: 1K5L PDB: 1OOX

IL-1RI di topo e trota

Ricerca del template con BLAST: IL-1RI umano [catena B in 1ITB dove è presente il complesso umano]

IL-1RI uomo topo trota

uomo 100 64 (81) 22 (40)

topo 100 20 (39)

trota 100

In tabella sono riportate le % di identità di sequenza e tra parentesi le similarità.

20 dicembre 2004

C-end

N-end

Dominio III

Dominio II

Dominio I

a

b IL-1

IL-1RI

IL-1/IL-1RI trota

……anche per topo: è stato simulato il complesso utilizzando IL-1 caratterizzato ai RX [PDB: 2MIB] ed IL-1RI modellato per omologia [PDB: 1OU3]. 20 dicembre 2004

IL-1RI di trota

PDB: 1OU1

Da dati bibliografici ……

IL-1 di trota è stata prodotta come proteina ricombinante in Escherichia coli.

Test di attività biologica:

rIL-1 è risultata capace di aumentare la proliferazione cellulare nelle cellule murine D10.G4.1.

Lo stesso livello di proliferazione è stato indotto da rIL-1 umana utilizzandone una quantità 1000 volte più bassa di quella necessaria per rIL-1 di trota.

Questo fatto può essere una conseguenza delle differenze strutturali tra IL-1 nei mammiferi e nei pesci.

Ciò rende rIL-1 di trota meno affine al recettore (IL-1RI) di topo.

Obiettivo: comprensione a livello molecolare del fenomeno biologico.

20 dicembre 2004

Complesso IL-1 trota/IL-1RI topo

* Le Energie sono espresse in Kcal/mol

ComplessiComplessi Van der Van der WaalsWaals ElettrostaticoElettrostatico Energia Energia

totaletotale

IL-1IL-1 ((trotatrota) ) / IL-1R/ IL-1RII ( (trotatrota)) - 164.85- 164.85 - 951.09- 951.09 - 1115.94- 1115.94

IL-1IL-1 ((topotopo) /IL-1R) /IL-1RII ( (topotopo)) - 129.69- 129.69 - 1039.57- 1039.57 - 1169.26- 1169.26

IL-1IL-1 ((trotatrota) / IL-1R) / IL-1RII ((topotopo)) - 155.45- 155.45 - 583.54- 583.54 - 738.99- 738.99IL-1IL-1 ((trotatrota) / IL-1R) / IL-1RII ( (topotopo)) - 155.45- 155.45 - 583.54- 583.54 - 738.99- 738.99

20 dicembre 2004

IL-1

IL-1RI

Esposizione al solvente degli AA dell’IL-1 di trota nei due complessi

AAAA PosizionePosizione % esposizione con % esposizione con IL-1R diIL-1R di trotatrota

% esposizione con % esposizione con IL-1R diIL-1R di topotopo DifferenzeDifferenze

ALAALA 153153 36,536,5 93,393,3 -56,8-56,8

SERSER 66 7,27,2 47,747,7 -40,5-40,5

GLUGLU 1111 6,96,9 37,837,8 -30,9-30,9

THRTHR 117117 41,6 69,8 -28,2

METMET 138138 14,814,8 42,442,4 -27,6-27,6

SERSER 55 6,26,2 33,733,7 -27,5-27,5

GLUGLU 9191 6868 91,891,8 -23,8-23,8

GLYGLY 3939 64,364,3 87,687,6 -23,3-23,3

.......... ........ ...... .... ........

ASPASP 141141 27,227,2 10,910,9 16,316,3

GLUGLU 6161 39,739,7 23,323,3 16,416,4

PROPRO 5555 82,982,9 65,465,4 17,517,5

ASNASN 166166 69,869,8 50,850,8 1919

ILEILE 5858 23,723,7 3,53,5 20,220,2

THRTHR 8686 31,531,5 11,311,3 20,220,2

THRTHR 6060 38,638,6 15,715,7 22,922,9

METMET 2525 25,425,4 0,90,9 24,524,5

ASNASN 2626 62,462,4 29,629,6 32,832,8

20 dicembre 2004

- Risultati -

Le interazioni elettrostatiche sono risultate molto ridotte nell’eterocomplesso e questa è probabilmente una conseguenza delle differenze amminoacidiche, che provocano una perdita di catene laterali cariche e, quindi, di ponti salini.

L’energia di interazione nell’eterocomplesso tra IL-1 (trota) e IL-1RI (topo) è risultata più alta di quella nell’omocomplesso, indicando che il legame tra IL-1 di trota ed IL-1RI di topo è molto debole.

Misurando l’esposizione al solvente degli amminoacidi di IL-1 di trota nell’omocomplesso e nell’eterocomplesso, abbiamo anche verificato come alcuni residui hanno valori completamente differenti

una diversa capacità dell’IL-1 di trota di legarsi ai due recettori, in accordo con quanto riportato in letteratura.

20 dicembre 2004

Scapigliati G, Costantini S, Colonna G, Facchiano A, Buonocore F, Bossù P, Cunningham C, Holland JW and Secombes CJ. (2004) Modelling of fish interleukin-1 and its receptor. Dev. Comp. Immunol. 28, 429-441.

La celiachia si manifesta, in individui geneticamente predisposti, in seguito ad ingestione di gliadina, il maggiore costituente del glutine del grano.

2. Studio della struttura e dell’interazione tra le proteine coinvolte nella malattia celiaca

Queste molecole legano in

modo non covalente i peptidi di

gliadina ( ) e li espongono al

riconoscimento dei linfociti T

(CD4+).

Essa è associata ai geni dell’HLA codificanti per gli eterodimeri DQ2 e DQ8, che sono esposti sulla superficie delle cellule APC (Cellule Presentanti l’Antigene).

20 dicembre 2004

Un peptide antigenico (peptide di gliadina) si lega in modo più efficace alle molecole DQ2 o DQ8 quando possiede dei residui amminocidici con carica negativa in determinate posizioni di ancoraggio.

Sollid LM Ann Rev Immunol 2000: 53-81

I peptidi di gliadina non hanno molti amminoacidi carichi negativamente. Ma se sono sottoposti a reazioni di deammidazione o nell’ambiente acido dello stomaco o ad opera della transglutaminasi tissutale, alcuni residui di glutammina sono convertiti in acido glutammico.

Recettore Cellule T

DQ2

Peptide

20 dicembre 2004

2. Studio della struttura e dell’interazione tra le proteine coinvolte nella malattia celiaca

Modellamento per omologia della struttura 3D del dimero DQ2, presente in individui celiaci.

Simulazione del complesso con vari peptidi di glutine per investigare le basi molecolari di questa interazione.

Simulazione degli effetti della deammidazione di residui di glutammina nelle posizioni di ancoraggio e di altre modifiche al fine di dare una spiegazione a livello molecolare di risultati sperimentali relativi all’affinità di questi peptidi per il dimero DQ2.

20 dicembre 2004

Domini C-terminali

Dominio N-terminale – catena

Sito di legame

Dominio N-terminale – catena

Dimero DQ2

20 dicembre 2004

Le sequenze delle due catene del DQ2 sono state modellate per omologia utilizzando come riferimento quelle del dimero DQ8 (percentuale di identità di sequenza del 91%).

PDB: 1NBN

P1 P9 | |Peptide PDB LVEALYLVCGERGGAlfa-I QLQPFPQPQLPYAlfa-II PQPQLPYPQPQAlfa-III PYPQPQLPYGlia-a20 FRPQQPYPQGlia-g2 PYPQQPQQPGamma-I PQQPQQSFPQQQRPGamma-II IIQPQQPAQGamma-III FPQQPQQPYPQQPGamma-IV FSQPQQQFPQPQGlt-156 PFSQQQQSPFGlt-17 PFSQQQQPV

Peptidi di glutine usati nelle simulazioni

I residui di glutammina che vengono deammidati sono riportati in rosso.

Le sequenze dei peptidi di glutine usati nelle simulazioni sono allineate a quella del peptide di insulina presente nel modello del DQ8 usato come riferimento (template) [PDB: 1JK8].

20 dicembre 2004

Energie di interazione tra il dimero DQ2 ed i peptidi di glutine

Le barre rappresentano la differenza di energia di interazione tra il peptide naturale e quelli modificati.

-600 -500 -400 -300 -200 -100 0

---E-E--------E------E-----PFSQQQQPV Glt-17

---E--E---------E------E------PFSQQQQSPF Glt-156

----E-E-----------E---------E-------FSQPQQQFPQPQ Gamma-IV

--E--E------------E---------E----------FPQQPQQPYPQQP Gamma-III

----G--------K--------E----IIQPQQPAQ Gamma-II

-E------GE-E---E------KE-E---E-------E-K---E-------K-E---E-------E-E---E---------------------E-E-------------G-------------K-------------E-----------G-------------K-------------E----PQQPQQSFPQQQRP Gamma-I

---E--E--------E-----E-----PYPQQPQQP Glia-g2

---G--------K--------E-----FRPQQPYPQ Glia-a20

-----G--------K--------E------G--------K--------E-----PYPQPQLPY Alfa-III

---EE-----E---EG-----E---EK-----E---E------E----G----------K----------E---------G----------K----------E-------PQPQLPYPQPQ Alfa-II (62-72)

--------G-----------K-----------E---QLQPFPQPQLPY Alfa-I

Alfa-I

Alfa-II

Alfa-III

Glia-a20

Glia-g2

Gamma-I

Gamma-II

Gamma-III

Glt-156

Gamma-IV

Glt-17

20 dicembre 2004

-600 -500 -400 -300 -200 -100 0











--------G-----------K-----------E---QLQPFPQPQLPY Alfa-IAlfa-I

P6

-600 -500 -400 -300 -200 -100 0












Gamma-I

P-2 P7 P9Q Q Q

-600 -500 -400 -300 -200 -100 0












Alfa-IIP4Q

Dettaglio della superficie del sito di legame del dimero DQ2 con il peptide alfa II.

Lys 71 Posizione P7Posizione P4

Region N-terminale del peptide Regione C-terminale del peptide

20 dicembre 2004

- Risultati (1) -

La deammidazione dei peptidi nelle posizioni p4, p6 e p7 rende i complessi più stabili.

I nostri risultati confermano in gran parte i dati sperimentali riportati in letteratura.

La presenza di una carica positiva (Lys) in p6 e p7 nei peptidi riduce la loro affinità per il dimero.

I nostri risultati ci danno delle informazioni riguardo altri peptidi (gamma-III, gamma-IV e glt-156) per i quali non ci sono analoghi dati sperimentali:

1. le loro probabili posizioni di ancoraggio.

2. la sostituzione glutammina-glutammico può migliorare l’interazione DQ2/peptide per questi peptidi

20 dicembre 2004

- Risultati (2) -

S. Costantini, G. Colonna, M. Rossi, A.M. Facchiano: “Binding of gluten peptides to the coeliac disease-associated HLA-DQ2 molecule by computational methods”, In Proceedings of the 8th Gluten Workshop, edited by D. La Fiandra, S. Masci and R. D’Ovidio, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 2004, pp.391-394.

Susan Costantini, Mauro Rossi, Giovanni Colonna, and Angelo M. Facchiano: "Modelling of HLA-DQ2 and of its interaction with gluten peptides to explain molecular recognition in celiac disease”, submitted

20 dicembre 2004

3. Simulazioni mediante l’utilizzo del modellamento comparativo dei cambiamenti conformazionali che si verificano quando le proteine interagiscono tra loro

Ad esempio le IL-1

IL-1 umana da sola

[PDB: 1IOB]

IL-1 umana complessata con il suo recettore

[PDB: 1ITB]

20 dicembre 2004

Differenze tra i modelli ottenuti per omologia usando template diversi.

20 dicembre 2004

Se usiamo come template l’IL-1 da sola

Se usiamo come template l’IL-1 complessata

Se usiamo come template entrambi i modelli sperimentali di

IL-1

● Confronto tra le due strutture umane di IL-1 riportate nella banca dati PDB.

● Modello teorico umano ottenuto per omologia utilizzando entrambe le strutture sperimentali (indicato come h-ThM).

● Simulazione dei complessi del modello sperimentale [PDB: 1IOB] e di quello teorico h-ThM con il recettore, sulla base del complesso sperimentale umano [PDB: 1ITB].

3. Simulazioni mediante l’utilizzo del modellamento comparativo dei cambiamenti conformazionali che si verificano quando le proteine interagiscono tra loro

● Confronto tra i due complessi teorici e quello sperimentale.

20 dicembre 2004

1 20 40 60 | | | | | | |human APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVAL1IOB

1ITBA

61 80 100 120 | | | | | | |human GLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNW1IOB

1ITBA

121 140 | | | | human YISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS 1IOB 1ITBA

Complessi ASA

all’interfaccia (Å2)

Numero di legami

ad idrogeno

1IOB/1ITBB 2157.62 31

1ITB 2337.15 36

h-ThM/1ITBB 2240.38 33

Energie di interazione tra IL-1 e IL-1RI

Complessi ASA

all’interfaccia (Å2)

Numero di legami

ad idrogeno

1IOB/1ITBB 2157.62 31

1ITB 2337.15 36

h-ThM/1ITBB 2240.38 33

* ASA è l’area di superficie accessibile al solvente all’interfaccia per l’interleuchina

20 dicembre 2004

- Risultati (1) -

Le differenze conformazionali tra i due modelli sperimentali di IL-1 hanno effetto sull’interazione con il recettore.

Il complesso con h-ThM risente del fatto che è stato ottenuto da entrambe le strutture sperimentali.

La migliore interazione è quella relativa al complesso sperimentale.

L’ interazione nel complesso con h-ThM è migliore di quella nel complesso con 1IOB.

20 dicembre 2004

Simulazione dell’interazione IL-1/IL-1RI in trota e topo:

● Modellamento per omologia delle sequenze di IL-1 di topo e trota usando come template i due modelli sperimentali umani, 1IOB e 1ITBA.

trota

t-ThF e t-ThC

topo

m-ThF e m-ThC

● Simulazione per ciascun organismo dei complessi tra il recettore ed i due modelli di IL-1 ottenuti.

trota

t-ThCOMPL-F e t-ThCOMPL-C

topo

m-ThCOMPL-F e m-ThCOMPL-C

20 dicembre 2004

Energie di interazione IL-1/IL-1RI nei complessi in topo e trota

I complessi ottenuti usando l’IL-1 umana nella forma complessata

(t-ThCOMPL-C e m-ThCOMPL-C) hanno valori di energia di

interazione più favorevoli.

m-ThCOMPL-F

t-ThCOMPL-F

t-ThCOMPL-C

m-ThCOMPL-C

20 dicembre 2004

ASA all’interfaccia

(Å2)

Numero di legami

ad idrogeno

Complessi in topo

m-ThCOMPL-F 2121.84 26

m-ThCOMPL-C 2259.20 32

Complessi in trota

t-ThCOMPL-F 2394.40 40

t-ThCOMPL-C 2764.61 41

Complessi in topo e trota

Le conformazioni di IL-1 di topo e trota, ottenute utilizzando come riferimento la struttura sperimentale della proteina umana nella sua forma complessata, sono quelle più adatta ad interagire con il recettore.

20 dicembre 2004

Il modellamento comparativo può essere applicato

con migliori risultati per predire i modelli di proteine,

che devono essere utilizzati per approfondire studi di

interazione proteina-proteina,

quando come riferimento viene utilizzata la struttura

tridimensionale di una proteina omologa nello stato

complessato.

- Risultati (2) -

20 dicembre 2004

Susan Costantini, Giovanni Colonna and Angelo M. Facchiano: “Comparative modelling simulates conformational changes occurring in protein-protein interaction”, submitted.

Scopo della tesi

20 dicembre 2004

Sviluppo di nuovi strumenti di analisi e predizione, al

fine di migliorare quelli già esistenti.

Applicazioni di metodi computazionali, già noti, per

studiare le proprietà strutturali e funzionali delle

proteine.

Sviluppo di nuovi strumenti di analisi e predizione

a. Propensità degli amminoacidi per i vari tipi di struttura secondaria in proteine che appartengono a differenti classi strutturali.

b. Frequenze di coppie di amminoacidi nelle proteine.

20 dicembre 2004

a. Propensità degli amminoacidi

La struttura secondaria è stata assegnata mediante il programma DSSP considerando “H”, “G” ed “I” come eliche, “B” ed “E” come struttura beta e le altre come “coil”.

Set di 2168 proteine derivato dalla lista PDBselect (non ridondante e con percentuale di identità di sequenza minore del 25%).

Le propensità degli amminoacidi nei differenti tipi di struttura secondaria (Pij) rapporto tra la frequenza con cui un dato residuo si trova in eliche, -strand e “coil” rispetto alla frequenza con cui tale residuo si trova nel set di proteine considerato.

dove nij è il numero dei residui di tipo i in struttura di tipo j, ni è il numero totale di residui di tipo i, Nj è il numero totale di residui in struttura di tipo j ed NT è il numero totale di residui.

T

j

i

ij

ij

NN

nn

P

20 dicembre 2004

Predizione della struttura secondaria

AELMDPRSTWMNALEATGFQE …………AELMDPRSTWMNALEATGFQE …………AELMDPRSTWMNALEATGFQE …………AELMDPRSTWMNALEATGFQE …………

valore più alto tra <P>, <P>, <Pc>

A partire dalla regione N-terminale di ogni sequenza proteica, noi abbiamo considerato una running window di n amminoacidi

Queste propensità sono state calcolate usando finestre di lunghezza differente per i tre tipi di struttura secondaria (w, w, wc), che sono state, poi, moltiplicate per differenti coefficienti (coeff, coeff, coeffc).

Per n=7

con <P>, <P> e <Pc> indichiamo il valore medio delle propensità in elica, -strand e coil.

20 dicembre 2004

Resubstitution test

Gli elementi di struttura secondaria per ciascuna proteina nel set studiato vengono predetti usando le propensità derivate dallo stesso set.

Jackknife test

Gli elementi di struttura secondaria per ciascuna “proteina test” vengono predetti dalle propensità calcolate da un set di proteine che include tutte tranne la stessa “proteina test”.

La qualità delle nostre predizioni è stata valutata ……..

20 dicembre 2004

MetodiMetodi QQ QQ QQcoilcoil QQ33

Resubstitution testResubstitution test 60.060.0 52.752.7 55.955.9 56.756.7

Jackknife testJackknife test 60.160.1 52.552.5 55.955.9 56.756.7

Chou e FasmanChou e Fasman 55.355.3 48.248.2 50.950.9 51.951.9

Accuratezza predittiva

dove Q, Q e Qcoil sono rispettivamente le percentuali di residui predetti correttamente in eliche, -strand e “coil”; Q3 è la percentuale totale di residui predetti correttamente.

MetodiMetodi

60.060.0 52.752.7 55.955.9 56.756.7

60.160.1 52.552.5 55.955.9 56.756.7

55.355.3 48.248.2 50.950.9 51.951.9

dove k rappresenta le regioni in elica, beta e “coil” nella proteina, nk è il numero di residui predetti correttamente nello stato k e Nk è il numero totale di residui nello stato conformazionale k nella proteina.

dove NT è il numero totale di residui nella proteina ed Nx è il numero totale di residui predetti in modo non corretto nella proteina.

k

kkk N

nQ 100%

T

xTN N

NNQ

100%3

20 dicembre 2004

Assegnazione classe strutturale

Secondo Nakashima et al.(1986)

Proteine alfa: contenuto di eliche >15% e -strand <10%

Proteine beta: contenuto di eliche <15% e -strand >10%

Proteine alfa-beta: contenuto di eliche >15% e -strand >10%

Secondo Chou (1995)

Proteine alfa: contenuto di eliche >40% e -strand <5%

Proteine beta: contenuto di eliche <5% e -strand >40%

Proteine alfa-beta: contenuto di eliche >15% e -strand >15%

20 dicembre 2004

Per ogni classe:

● Propensità degli amminoacidi nei tre tipi di struttura secondaria (eliche, -strand e coil).

● Predizione degli elementi di struttura secondaria:

resubstitution test

jackknife test

● Valutazione dell’accuratezza predittiva.

● Confronto con le predizioni di Chou e Fasman.

20 dicembre 2004


Classificazione secondo Nakashima et al. (1986)

ClassiClassi QQ QQ QQcoilcoil QQ33

AlfaAlfa

Resubstitution Resubstitution testtest

69.69.77

47.347.3 49.249.2 62.262.2

Jackknife testJackknife test 69.69.55

47.047.0 49.249.2 62.062.0

Chou e FasmanChou e Fasman 54.54.77

45.345.3 47.747.7 52.152.1


Alfa Alfa (627)(627)


69.69.77

47.347.3 49.249.2 62.262.2


47.047.0 49.249.2 62.062.0


45.345.3 47.747.7 52.152.1BetaBeta


44.44.22

58.058.0 58.658.6 57.157.1


58.058.0 58.658.6 57.057.0


46.846.8 55.355.3 51.151.1

Beta Beta (552)(552)


44.44.22

58.058.0 58.658.6 57.157.1


58.058.0 58.658.6 57.057.0


46.846.8 55.355.3 51.151.1Alfa-betaAlfa-beta


60.60.22

55.155.1 55.255.2 57.057.0


55.155.1 55.255.2 57.057.0


49.449.4 49.849.8 52.252.2

Alfa-beta Alfa-beta (912)(912)


60.60.22

55.155.1 55.255.2 57.057.0


55.155.1 55.255.2 57.057.0


49.449.4 49.849.8 52.252.220 dicembre 2004


Classificazione secondo Chou (1995)


AlfaAlfa


70.70.55

47.047.0 43.143.1 62.262.2


43.943.9 42.742.7 62.162.1


41.841.8 46.346.3 52.152.1


Alfa Alfa (470)(470)


70.70.55

47.047.0 43.143.1 62.262.2


43.943.9 42.742.7 62.162.1


41.841.8 46.346.3 52.152.1BetaBeta


35.35.99

66.366.3 57.857.8 61.361.3


66.066.0 57.457.4 61.061.0


46.246.2 57.357.3 50.950.9

Beta Beta (167)(167)


35.35.99

66.366.3 57.857.8 61.361.3


66.066.0 57.457.4 61.061.0


46.246.2 57.357.3 50.950.9Alfa-betaAlfa-beta


59.59.22

55.355.3 56.556.5 57.257.2


55.355.3 56.556.5 57.157.1


49.249.2 50.150.1 52.352.3

Alfa-beta Alfa-beta (696)(696)


59.59.22

55.355.3 56.556.5 57.257.2


55.355.3 56.556.5 57.157.1


49.249.2 50.150.1 52.352.320 dicembre 2004

- Risultati (1) -

● Le propensità degli amminoacidi sono differenti nelle tre classi strutturali (alfa, beta ed alfa-beta).

● Se per una data proteina può essere assegnata la classe strutturale, gli elementi di struttura secondaria per quella proteina possono essere predetti con migliori risultati, usando le propensità degli amminoacidi calcolate per la sua stessa classe e valori ottimizzati di coefficienti e finestre.

20 dicembre 2004

Nell’ambito di questo studio è stato necessario sviluppare dei software che automaticamente e velocemente fossero in grado di analizzare un numero così alto di proteine.

20 dicembre 2004

- Risultati (2) -

Susan Costantini, Giovanni Colonna and Angelo M. Facchiano: “The amino acid conformation potentials in proteins belonging to different secondary structural classes”, in preparation.

● Frequenza dei doppietti valutata come rapporto tra il numero di volte in cui il residuo x si trova vicino a quello a, x(a), ed il numero totale di coppie possibili (ntot)

b. Frequenze di coppie di amminoacidi nelle proteine

Utilizzando il set di 2168 proteine, suddiviso nelle tre classi strutturali

Per le proteine, classificate secondo Nakashima et al. (1986),

alfa AA, AL, EL, LA, LE ed LK,beta SG, GK, DG, VT e GS alfa-beta AA, AL, LA, LL

100)(

)( tot

ax

n

axF

20 dicembre 2004

È possibile sfruttare questa informazione per predire la Classe Strutturale di proteine?

I doppietti AA, AL, LA, LE ed LL sono più frequenti nelle proteine alfa che in quelle beta ed alfa-beta.

I doppietti GS, SG, SS, VT, TV sono più presenti nelle proteine beta.

20 dicembre 2004

Confrontando le frequenze dei doppietti nelle tre classi:

Predizione della Classe Strutturale

Per ciascuna proteina è stata predetta la classe strutturale, utilizzando il metodo della regressione lineare.

Sono stati calcolati i coefficienti di correlazione tra l’insieme dei valori relativi alle frequenze delle coppie di residui per la proteina in esame e per le proteine classificate come alfa, beta ed alfa-beta.

Frequenze dei doppietti:

Alfa

Beta

Alfa-beta

Proteina in esame

rx/alfa

rx/beta

rx/alfa-beta

La classe strutturale è assegnata in base al valore più alto tra i tre coefficienti.

20 dicembre 2004

65%


Proteineclass Proteinepred Q% jackknife

Nakashima

alfaalfa 627 444 71 68

betabeta 552 375 68 65

alfa-betaalfa-beta 912 538 59 56

Chou

alfaalfa 470 361 77 73

betabeta 167 124 74 64

alfa-betaalfa-beta 696 445 64 61

70%

20 dicembre 2004

I risultati ottenuti dalle predizioni di classe strutturale sono incoraggianti, anche perché si basano solo sulle frequenze dei doppietti nelle proteine.

- Risultati -

Dalla sola sequenza amminoacidica di una proteina, è possibile ottenere sempre più informazioni riguardo il suo fold.

Questo studio può essere molto utile per migliorare l’accuratezza dei metodi di predizione di struttura secondaria.

20 dicembre 2004

Il lavoro svolto suggerisce come l’applicazione dei metodi computazionali sia ormai diventata di estrema utilità per fornire chiarimenti strutturali e funzionali riguardo le proteine e per formulare ipotesi sulla loro attività biologica, anche se qualunque applicazione pratica di quanto ipotizzato può essere realizzata solo mediante ulteriori studi di tipo sperimentale.

- Conclusioni -

Questo lavoro mostra la necessità di sviluppare sempre nuovi strumenti di analisi e di predizioni, capaci di migliorare quelli esistenti, anche nella prospettiva di dover gestire l’impressionante quantità di informazioni, derivate dalla ricerca genomica e proteomica.

20 dicembre 2004

Comunicazioni a Congressi♦ Susan Costantini, Angelo M. Facchiano, Giovanni Colonna: “Prediction of the three-dimensional structures of proteins by Homology Modelling”, Gruppo di Cooperazione Bioinformatica tra il 15 e il 17 marzo 2002.♦ S. Costantini, A.M. Facchiano, G. Colonna: “Metodi computazionali e bioinformatici per la predizione della struttura tridimensionale di proteine”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, Seconda Università di Napoli, 4-6 giugno 2002. ♦ S. Costantini, G. Colonna, A.M. Facchiano: “Coeliac disease: studying the interaction of HLA-DQ2 molecule with gluten peptides by computational methods”, Meeting “Gruppo di Cooperazione Bioinformatica” - Frascati – March 28-29, 2003.♦ Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “Studio della struttura e dell’interazione tra le proteine coinvolte nella malattia celiaca mediante metodi computazionali”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, 4-6 giugno 2003.♦ Ceci G., Mucherino A., D’Apuzzo M., di Serafino D., Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “Folding ab-initio di proteine: un approccio topologico”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, Seconda Università di Napoli, 4-6 giugno 2003.♦ Ceci G., Mucherino A., D’Apuzzo M., di Serafino D., Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: ““Computational issues of a topological approach to protein folding”, Sheffield, 20-22 July 2003.♦ Susan Costantini, Giovanni Colonna, Mauro Rossi and Angelo M. Facchiano: “Binding of gluten peptides to the celiac disease associated HLA-DQ2 molecule by computational methods”, 8th Gluten Workshop, Viterbo, 8-10 settembre 2003.♦ Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “Analysis of the three-dimensional structure of Il-1beta/IL-1 receptor complexes by computational methods”, SIB2003, Ferrara, 15-18 Settembre 2003.♦ Susan Costantini, Giovanni Colonna and Angelo M. Facchiano: “Comparative modelling for predicting the different conformations assumed by a protein during its different activities”, Bits 2004, Padova 26-27 March 2004.♦ Ceci G., Mucherino A., D’Apuzzo M., di Serafino D., Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “A geometrical approach for protein secondary structure simulations: computational issues”, 2-5 April 2004, Neuchatel, Switzerland.♦ S. Costantini, G. Colonna and A.M. Facchiano: “Comparative modelling for predicting the different conformations assumed by a protein during its different activities”, SIB-Proteine 2004, Viterbo 20-22 May 2004.♦ E. Randelli, M. Forlenza, S. Meloni, S. Benedetti, C.J. Secombes, J. Zou, G. Scapigliati, S. Costantini, A. Facchiano, F. Buonocore: “Potential application of sea bass recombinant interleukin-1 in fish vaccination”, SIB-Proteine 2004.♦ Costantini S., Facchiano A.M., Rossi M., Colonna G.: “Metodi computazionali per lo studio della struttura e dell’interazione tra le proteine coinvolte nella malattia celiaca”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, 9-11 giugno 2004.♦ Ceci G., Mucherino A., D’Apuzzo M., di Serafino D., Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “Un approccio ab-initio per la simulazione di strutture secondarie di proteine”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, 9-11 giugno 2004.♦ Angelo M. Facchiano, Susan Costantini, Mauro Rossi, Giovanni Colonna: “Simulation of the Interaction of Gluten Peptides with HLA-DQ2 Molecule to Investigate the Molecolar Basis of Coeliac Disease” ISMB-ECCB 2004, Glasgow, Scotland, UK, July 31-August 4, 2004.♦ Susan Costantini, Giovanni Colonna, Angelo M. Facchiano: “Prediction of the secondary structure of proteins: the amino acid propensities in proteins belonging to deifferent secondary structural classes”, Nettab 2004 – Network Tools and Applications in Biology, Camerino, Italy, September 5-7, 2004.

Comunicazioni a Congressi♦ Susan Costantini, Angelo M. Facchiano, Giovanni Colonna: “Prediction of the three-dimensional structures of proteins by Homology Modelling”, Gruppo di Cooperazione Bioinformatica tra il 15 e il 17 marzo 2002.♦ S. Costantini, A.M. Facchiano, G. Colonna: “Metodi computazionali e bioinformatici per la predizione della struttura tridimensionale di proteine”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, Seconda Università di Napoli, 4-6 giugno 2002. ♦ S. Costantini, G. Colonna, A.M. Facchiano: “Coeliac disease: studying the interaction of HLA-DQ2 molecule with gluten peptides by computational methods”, Meeting “Gruppo di Cooperazione Bioinformatica” - Frascati – March 28-29, 2003.♦ Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “Studio della struttura e dell’interazione tra le proteine coinvolte nella malattia celiaca mediante metodi computazionali”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, 4-6 giugno 2003.♦ Ceci G., Mucherino A., D’Apuzzo M., di Serafino D., Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “Folding ab-initio di proteine: un approccio topologico”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, Seconda Università di Napoli, 4-6 giugno 2003.♦ Ceci G., Mucherino A., D’Apuzzo M., di Serafino D., Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: ““Computational issues of a topological approach to protein folding”, Sheffield, 20-22 July 2003.♦ Susan Costantini, Giovanni Colonna, Mauro Rossi and Angelo M. Facchiano: “Binding of gluten peptides to the celiac disease associated HLA-DQ2 molecule by computational methods”, 8th Gluten Workshop, Viterbo, 8-10 settembre 2003.♦ Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “Analysis of the three-dimensional structure of Il-1beta/IL-1 receptor complexes by computational methods”, SIB2003, Ferrara, 15-18 Settembre 2003.♦ Susan Costantini, Giovanni Colonna and Angelo M. Facchiano: “Comparative modelling for predicting the different conformations assumed by a protein during its different activities”, Bits 2004, Padova 26-27 March 2004.♦ Ceci G., Mucherino A., D’Apuzzo M., di Serafino D., Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “A geometrical approach for protein secondary structure simulations: computational issues”, 2-5 April 2004, Neuchatel, Switzerland.♦ S. Costantini, G. Colonna and A.M. Facchiano: “Comparative modelling for predicting the different conformations assumed by a protein during its different activities”, SIB-Proteine 2004, Viterbo 20-22 May 2004.♦ E. Randelli, M. Forlenza, S. Meloni, S. Benedetti, C.J. Secombes, J. Zou, G. Scapigliati, S. Costantini, A. Facchiano, F. Buonocore: “Potential application of sea bass recombinant interleukin-1 in fish vaccination”, SIB-Proteine 2004.♦ Costantini S., Facchiano A.M., Rossi M., Colonna G.: “Metodi computazionali per lo studio della struttura e dell’interazione tra le proteine coinvolte nella malattia celiaca”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, 9-11 giugno 2004.♦ Ceci G., Mucherino A., D’Apuzzo M., di Serafino D., Costantini S., Facchiano A.M. and Colonna G.: “Un approccio ab-initio per la simulazione di strutture secondarie di proteine”, Giornate Scientifiche della Facoltà di Medicina, 9-11 giugno 2004.♦ Angelo M. Facchiano, Susan Costantini, Mauro Rossi, Giovanni Colonna: “Simulation of the Interaction of Gluten Peptides with HLA-DQ2 Molecule to Investigate the Molecolar Basis of Coeliac Disease” ISMB-ECCB 2004, Glasgow, Scotland, UK, July 31-August 4, 2004.♦ Susan Costantini, Giovanni Colonna, Angelo M. Facchiano: “Prediction of the secondary structure of proteins: the amino acid propensities in proteins belonging to deifferent secondary structural classes”, Nettab 2004 – Network Tools and Applications in Biology, Camerino, Italy, September 5-7, 2004.

Tutor:

Prof. Giovanni Colonna Dott. Angelo Facchiano

- SUN - ISA-CNR, Avellino

Dott. Francesco Buonocore

Università della Tuscia

- Ringraziamenti -

Dott. Mauro Rossi

ISA – CNR, Avellino

20 dicembre 2004

Marilù Chiusano

Gruppo di Bioinformatica dell’ISA-CNR, Avellino

Gruppo di ricerca del prof. Malorni del CESMA-ProBio, Avellino

Marilù Chiusano

Gruppo di Bioinformatica dell’ISA-CNR, Avellino

Gruppo di ricerca del prof. Malorni del CESMA-ProBio, Avellino

Dottorato di ricerca in Biologia Computazionale (XVI ciclo) Dott.ssa Costantini Susan 20 dicembre...

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