Dott. Vincenzo Fabrizio

Strategie di analisi e di controllo dello sviluppo di Brettanomyces/Dekkera nell’industria enologica

Dott. Vincenzo Fabrizio

Riccagioia, 9 Novembre 2013

Analisi dei fabbisogni

Riccagioia, 09/11/2013

Elevato interesse nei confronti di Brettanomyces/Dekkera in funzione del ruolo negativo che svolgono nei confronti principalmente dei vini rossi da

affinamento.

Difficoltà nella gestione della contaminazione:

1. Sopravvivenza e moltiplicazione in condizioni proibitive per molti microrganismi;

2. Produzione di fenoli volatili con proprietà sensoriali sgradite e deprezzanti;

3. Le principali contromisure impiegate in cantina non sono sufficienti ad eradicare il problema;

4. Alcuni ceppi di Brettanomyces formano biofilm rendendo vane le procedure di sanificazione.

Aspetti tassonomici

Custer, 1940: genere Brettanomyces

Van der Walt, 1960: generi Dekkera/Brettanomyces

Dekkera, genere teleomorfico

Brettanomyces, genere anamorfico


Specie di interesse enologico

GENERE FORMA TELEOMORFA

FORMA ANAMORFA

Dekkera/Brettanomyces

Dekkera anomala Brettanomyces anomalusDekkera bruxellensis Brettanomyces bruxellensis

Saccharomyces cerevisiaeDekkera/Brettanomyces


Esigenze nutrizionali e ambientali

Genere Dekkera/Brettanomyces

Fonti di carbonio:

-Glucosio;

-Etanolo;

-Acidi cinnamici;

-Composti carbonilici del legno.

Azoto assimilabile

Ossigeno


Range Temperatura: 13-30°C

Resistenze:

-Alcol;

-SO2

Aspetti fisio-metabolici: alcol-tolleranza

Fenomeno: stress da etanolo

modificazione delle membrane lipidiche

sintesi di proteine definite “da stress”: heat shock proteins

modulazione degli scambi ionici

Risposta allo stress

Aumento di acidi grassi insaturi a lunga catena

Incremento della concentrazione di trealosio


Alcol-tolleranza

10%

12%

13%

Curva di crescita di D. bruxellensis ISA 1791 su YNB, glucosio 2% e in presenza di etanolo a concentrazione crescente:

= 4%= 6%= 8%


Aspetti fisio-metabolici: produzione di acido acetico


Soprattutto in presenza di ossigeno

si ha forte produzione di acido acetico

Aspetti fisio-metabolici: resistenza alla SO2

SO2 libera SO2 combinata

• SO2 molecolare • frazione parzialmente dissociata HSO3

-

• completamente dissociata o solfito SO32-

SO2

SO2 HSO3-

pH = 7.0

MOSTO:

pH < 3.5Reattività dei solfiti:

• sulle proteine: spezzando i ponti disolfuro, alterandone la struttura terziaria, modificazioni conformazionali degli enzimi, reagendo con cofattori e coenzimi;• sugli acidi nucleici: legandosi all’uracile e alla timina.


Aspetti fisio-metabolici: utilizzazione del cellobioso

Le barriques nuove sono pressoché sterili grazie al trattamento di tostatura,tuttavia contengono cellobiosio, dimero del glucosio (β 1-4),

formatosi in conseguenza del trattamento termico, substrato fermentabile da Brettanomyces/Dekkera


Aspetti tecnologici

Rischi correlati allo sviluppo di Brettanomyces in ambito enologico

QUALITATIVO: produzione di fenoli volatili

SICUREZZA: produzione di ammine biogene


Produzione di fenoli volatili

cinnamato decarbossilasi

vinil-fenolo reduttasi


Soglie di percezione dei fenoli volatili

composto in acqua (μg/L)

in vino bianco (μg/L)

in vino rosso (μg/L)

descrittore

4-vinil-fenolo 85 180 200

farmaceutico, fenolo

4-vinil-guaiacolo 30 150 570

speziato, chiodo di garofano

4-etil-fenolo 130 400 520

sudore di cavallo, stalla, animalesco

4-etil-guaiacolo 25 50 140

cerotto, plastica bruciata


Incidenza di alterazione in vini rossi da affinamento


Produzione di ammine biogene

Sc = Saccharomyces cerevisiae, Ka= Kloeckera apiculata, Cs= Candida stellata,

Mp=Metschnikowia pulcherrima, Bb=Brettanomyces bruxellensis

Limiti consentiti per l’importazione di ammine biogene totali

Svizzera: 10 mg/l

Francia: 8 mg/l (raccomandato)

Belgio: 6 mg/l

Germania: 2 mg/l


Prevenzione e rimedi

Controllo della contaminazione in cantina da parte di fonti esterne:

- Ricezione uve tramogge, pigiadiraspatrici, pompe che possono divenire in breve tempo focolai di contaminazione.


- Ricezione vini dall’esterno

Prevenzione e rimedi (2)

Valutazione dell’efficienza delle procedure di sanitizzazione, degli strumenti utilizzati per la vinificazione e lo stoccaggio,

nonché dei locali della cantina;PROVE DI MIC (Minima Concentrazione Inibente) al

fine di stabilire la concentrazione minima del detergente da usare, alla quale il microrganismo non è

più in grado di svilupparsi.


Analisi microbiologica prima e dopo trattamento per valutarne

l’efficacia

Monitoraggio della contaminazione nelle fasi chiave del processo:

Prevenzione e rimedi (3)

• Monitoraggio microbiologico del mosto

• Monitoraggio microbiologico durante affinamento

• Monitoraggio microbiologico all’imbottigliamento


Controllo della presenza di Brettanomyces

I metodi usuali: controllo microbiologico

terreni specifici e selettivi per Brettanomyces: DBDM

indicatori degli acidi organici (acetico in particolare)

rilevatori specifici dell’attività del microrganismo (precursori dei fenoli volatili)


Controllo della presenza di Brettanomyces (2)

metodi innovativi: controllo biomolecolare

Pattern genetici specifici per le specie pericolose di Brettanomyces/Dekkera

PCR: primers specifici per il 26S rDNA di Brettanomyces

Analisi di restrizione dell’amplificato


Brettanomyces

Controllo della presenza di Brettanomyces (3)

Sviluppi futuri

Real-Time PCR


Analisi quantitativa associata ad analisi qualitativa; permetterà in futuro di ottenere analisi microbiologiche in tempo reale, quindi molto più simili alle

normali analisi chimiche di processo.

Attività effettuate a Riccagioia

Campionamenti: pompe, vasche, vini, barrique

Analisi fenotipiche e genotipiche al fine di confermare l’effetiva contaminazione da parte

di Brettanomyces

Valutazione delle procedure di sanificazione effettuate in azienda e redazione di nuove procedure igieniche per

eradicare il problema


Conclusioni

• La prevenzione risulta essere sicuramente il miglior strumento nella lotta contro il Brettanomyces in cantina;

• La prevenzione si concretizza attuando le “Good Manufacturing Practices” ed effettuando controlli mirati nei

punti chiave del processo;

• L’analisi microbiologica diventa un strumento necessario nella gestione e nel monitoraggio di Brettanomyces, durante tutto

l’arco del processo produttivo;

• Riuscire a comprendere nell’immediato la problematica consente la messa a punto di rimedi che permettono di

eradicare il problema o comunque ridurne l’entità entro valori accettabili.


GRAZIE PER L’ATTENZIONE

Dott. Vincenzo Fabrizio

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