Dosaggio CEDIA® per benzodiazepina Per Uso Diagnostico In Vitro

10016409 (3 x 17 mL Indiko Kit) 100085 (Kits de 3 x 17 mL) 100094 (Kits de 65 mL) 1775561 (Kits de 495 mL)

Uso previstoIl dosaggio CEDIA® per benzodiazepina è uno strumento diagnostico in vitro previsto per la determinazione qualitativa e semiquantitativa delle benzodiazepine nell’urina umana.

Questo dosaggio fornisce unicamente un risultato analitico preliminare. Per ottenere un risultato analitico di conferma, è necessario utilizzare un metodo chimico alternativo a specificità più elevata. Il metodo di conferma più idoneo è la gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS).1 Qualsiasi risultato di analisi riguardante sostanze stupefacenti, soprattutto nel caso di un risultato preliminare positivo, va trattato con la considerazione clinica e la discrezione professionale opportune.

Sommario e spiegazione del metodoLe benzodiazepine appartengono ad un’ampia categoria di farmaci depressivi in grado di agire sul SNC, conosciuti col nome di sedativi/ipnotici.2 Vengono descritti come ansiolitici, agenti per indurre il sonno, anticonvulsivanti e rilassanti per muscoli, e vengono anche usati largamente come medicinali preanestetici e come coadiuvanti nell’induzione e mantenimento dello stato anestetico.2,3,4

Sebbene ampiamente prescritte, le benzodiazepine vengono anche usate abusivamente.3-5 L’uso cronico della benzodiazepina può portare alla dipendenza fisica con sintomi da astinenza quali insonnia, agitazione, irritabilità, tensione muscolare e-in casi più severi-allucinazioni, psicosi, e convulsioni.2,3

Il dosaggio CEDIA per benzodiazepina è un immunodosaggio enzimatico omogeneo che si avvale della tecnologia del DNA ricombinante (brevetto USA n. 4708929).6 Questo dosaggio è basato sull’enzima batterico -galattosidasi, geneticamente suddiviso in due frammenti inattivi. Questi frammenti si riassociano spontaneamente per formare un enzima pienamente attivo in grado di legarsi, nel formato del dosaggio, ad un substrato, dando luogo ad una variazione cromatica misurabile spettrofotometricamente.

Nel dosaggio, il farmaco nel campione compete con il farmaco coniugato con un frammento inattivo di -galattosidasi per i siti di legame degli anticorpi. Se la droga è presente nel campione, si legherà all’anticorpo, lasciando i frammenti enzimatici inattivi liberi di formare enzimi attivi. Se il farmaco non è presente nel campione, l’anticorpo si legherà al farmaco coniugato con il frammento enzimatico inattivo, inibendo stericamente la riassociazione dei frammenti inattivi di -galattosidasi, e non si verificherà la formazione di alcun enzima attivo. La quantità di enzima

attivo formata ed il risultante cambiamento dell’estinzione sono proporzionali alla concentrazione del farmaco presente nel campione.

Per aumentare la sensibilità del dosaggio, un enzima opzionale viene aggiunto per idrolizzare i metaboliti di glucuronide nella benzodiazepina, aumentando in tal modo il riconoscimento di quei campioni che contengono metaboliti di benzodiazepina.7,8

Reagenti1 Tampone di ricostituzione EA: Contiene piperazina-N, N-bis [acido 2-etansulfonico],

13,6 µg/mL di anticorpi policlonali di pecora contro la benzodiazepina, sali tampone, stabilizzante e conservante.

1a Reagente EA: Contiene 0,171 g/L di accettore enzimatico, sali tampone, detergente e conservante.

2 Tampone di ricostituzione ED: Contiene piperazina-N, N-bis [acido 2-etansulfonico], sali tampone e conservante.

2a Reagente ED: Contiene 9,7 µg/L di donatore enzimatico coniugato con un derivato della benzodiazepina, 1,67 g/L di rosso di clorofenolo- -D-galattopiranoside, stabilizzante e conservante.

Ulteriori materiali: Etichette alternative con codici a barre (per i n. di cat. 100085 e 100094. Per le istruzioni per l’uso, consultare il foglio delle applicazioni relativo all’analizzatore in dotazione). Flaconi vuoti per analizzatore per il travaso delle soluzioni EA/ED (n. di cat. 100094).

Ulteriori materiali necessari (venduti separatamente):Calibratore negativo CEDIACalibratore multi-farmaco CEDIA, valori limite primari o valori limite clinici primari, (300 ng/mL)Calibratore multi-farmaco CEDIA, valori limite secondari o valori limite opzionali, (200 ng/mL)Calibratore multi-farmaco intermedio CEDIACalibratore multi-farmaco alto CEDIASet di controlli speciali, o set di controlli opzionali, (per valore limite 200 ng/mL)Set di controlli multi-farmaco, o set di controlli clinici, (per valore limite 300 ng/mL)Reattivo -glucuronidasi (per il dosaggio ad alta sensibilità)Codice a barre alternativo per l’applicazione ad alta sensibilita: Per l’uso con gli analizzatori Hitachi 911, 912 e 917

Avvertenze e precauzioniI reagenti contengono azoturo di sodio. Evitarne il contatto con la pelle e le mucose. In caso di contatto, sciacquare le aree interessate con abbondanti quantità di acqua. In caso di contatto con gli occhi o di ingestione, rivolgersi immediatamente a un medico. L’azoturo di sodio può reagire con il rame o il piombo delle tubature di scarico generando azidi metallici potenzialmente esplosivi. Per lo smaltimento dei reagenti, usare abbondanti quantità di acqua per evitare l’accumulo di azidi metallici. Pulire le superfici metalliche esposte con idrossido di sodio al 10%.

Preparazione e conservazione dei reagentiPer la preparazione delle soluzioni per gli analizzatori Hitachi, vedere più avanti. Per tutti gli altri analizzatori, consultare il foglio delle applicazioni specifico per l’analizzatore in dotazione. Estrarre il kit dal frigorifero appena prima della preparazione delle soluzioni.

Preparare le soluzioni nel seguente ordine per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione.

Soluzione R2 di donatore enzimatico: collegare il flacone 2a (reagente per ED) al flacone 2 (tampone di ricostituzione per ED) usando uno degli adattatori forniti. Mescolare capovolgendo delicatamente, assicurandosi che tutto il materiale liofilizzato del flacone 2a si trasferisca nel flacone 2. Evitare la formazione di schiuma. Staccare il flacone 2a e l’adattatore dal flacone 2 e gettarli. Tappare il flacone 2 e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a temperatura ambiente (15-25°C). Mescolare nuovamente. Annotare la data di ricostituzione sull’etichetta del flacone.

Soluzione R1 di accettore enzimatico: collegare il flacone 1a (reagente per EA) al flacone 1 (tampone di ricostituzione per EA) usando uno degli adattatori forniti. Mescolare capovolgendo delicatamente, assicurandosi che tutto il materiale liofilizzato del flacone 1a si trasferisca nel flacone 1. Evitare la formazione di schiuma. Staccare il flacone 1a e l’adattatore dal flacone 1 e gettarli. Tappare il flacone 1 e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a temperatura ambiente (15-25°C). Mescolare nuovamente. Annotare la data di ricostituzione sull’etichetta del flacone.

N. di cat. 100094 - Analizzatore Hitachi 717, 911, 912 o 914: Travasare i reagenti ricostituiti nei corrispondenti flaconi vuoti da 100 mL R1 e R2 forniti con il kit. Hitachi 917/Sistema Modular Analytics P: Usare i reagenti ricostituiti senza travasarli. Gettare i flaconi da 100 mL vuoti.N. di cat. 1775561 - Analizzatore Hitachi 747/Sistema Modular Analytics D: Usare l’imbuto fornito per trasferire una parte della soluzione R2 nel flacone vuoto R2 fornito opportunamente etichettato. Benzodiazepina ad alta sensibilità: Per utilizzare il reattivo opzionale -glucuronidasi, aggiungere 0,09 mL di -glucuronidasi per il n. di catalogo 100085; 0,425 mL per il n. di catalogo 100094 e 2,5 ml per il n. di catalogo 1775561 alla soluzione EA ricostituita. Mescolare capovolgendo delicatamente. Annotare sull’etichetta del flacone che la -glucuronidasi è stata aggiunta.

NOTA 1: I componenti forniti in questo kit sono previsti per l’uso concomitante. Non mescolare tra loro componenti di lotti diversi.NOTA 2: Per evitare la contaminazione crociata dei reagenti, non scambiare tra loro i tappi dei diversi flaconi. La soluzione R2 deve essere di colore giallo arancio. La comparsa di un colore rosso scuro o rosso porpora indica la contaminazione del reagente, che va quindi eliminato.NOTA 3: Prima dell’esecuzione del dosaggio, le soluzioni R1 e R2 vanno portate alla temperatura dello scomparto dei reagenti dell’analizzatore. Per ulteriori informazioni, consultare il foglio delle applicazioni relativo all’analizzatore in dotazione.NOTA 4: Per garantire la stabilità del reagente EA ricostituito, non esporlo per un periodo prolungato all’azione diretta di forti sorgenti luminose.

Conservare i reagenti a 2-8°C. NON CONGELARLI. Per il periodo di stabilità dei componenti non aperti, vedere la data di scadenza sulla confezione o sulle etichette dei flaconi.

Soluzione R1: 60 giorni nello scomparto refrigerato dell’analizzatore oppure in frigorifero a 2-8°C.Soluzione R2: 60 giorni nello scomparto refrigerato dell’analizzatore oppure in frigorifero a 2-8°C.

Raccolta e trattamento del campioneRaccogliere il campione di urina in un recipiente pulito di vetro o plastica. In presenza di alta torbidità, il campione va centrifugato prima di sottoporlo all’analisi. Trattare il campione di urina umana come potenzialmente infettivo. Se si sospetta la contaminazione del campione, ottenere un nuovo campione per l’analisi. La contaminazione del campione di urina può influire negativamente sui risultati dell’analisi.

Ai sensi delle direttive The Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs: Final Guidelines: Notice, i campioni non analizzati entro 7 giorni dal loro arrivo al laboratorio vanno conservati in frigoriferi di sicurezza.9

Procedura di analisiAi fini del presente dosaggio è possibile utilizzare gli analizzatori chimici in grado di mantenere una temperatura costante, pipettare i campioni, miscelare i reagenti, misurare i tassi enzimatici e regolare con precisione i tempi di reazione. Fogli delle applicazioni riportanti i parametri specifici per ciascun analizzatore sono disponibili presso la Microgenics, che fa parte della Thermo Fisher Scientific.

Solo con i kit da 17 mL e da 65 mL vengono fornite etichette con codice a barre supplementari per la determinazione semiquantitativa. A tal fine, apporre l’etichetta corretta sopra l’etichetta già presente sul flacone.

2

Controllo di qualità e calibrazione10

Analisi qualitativaPer esaminare i risultati dell’analisi qualitativa dei campioni, usare il calibratore multi-farmaco CEDIA, i valori limite primari, i valori limite clinici primari, i valori limite opzionali o i valori limite secondari (a seconda dei valori limite selezionati). (Per applicazioni ad alta sensibilità, usare soltanto il valore limite secondario.) Consultare il foglio delle applicazioni specifico per l’analizzatore in dotazione.

Analisi semiquantitativaPer esaminare i risultati dell’analisi semiquantitativa dei campioni, usare il calibratore multi-farmaco CEDIA, i valori limite primari, i valori limite clinici primari, i valori limite opzionali o i valori limite secondari (a seconda dei valori limite selezionati) insieme al calibratore negativo e i calibratori multi-farmaco intermedio e alto. Consultare il foglio delle applicazioni specifico per l’analizzatore in dotazione.

Una buona prassi di laboratorio prevede l’analisi dei controlli parallelamente all’analisi dei campioni dei pazienti e ad ogni calibrazione. Si raccomandano due livelli di controllo: uno 25% al di sopra del limite selezionato e l’altro 25% al di sotto del limite selezionato. Per il controllo di qualità, usare il set di controlli multi-farmaco CEDIA o il set di controlli clinici, (valore limite 300) o il set di controlli speciali o il set di controlli opzionali, (valore limite 200). I calibratori dovrebbero essere rianalizzati se ci fosse un cambiamento nei reattivi oppure se i risultati di controllo si trovassero al di fuori dei limiti stabiliti. Ogni laboratorio deve determinare indipendentemente la frequenza dei suoi controlli. Basare la valutazione del controllo di qualità sui valori ottenuti dai controlli, che devono rientrare entro limiti specifici. Se si riscontrano tendenze marcate o deviazioni improvvise nei valori, riesaminare tutti i parametri operativi. Per ulteriore assistenza, rivolgersi al servizio di assistenza tecnica. Tutti i requisiti di controllo della qualità vanno soddisfatti in conformità alle normative vigenti o ai requisiti per l’accreditamento.

Risultati e valori attesiRisultati qualitativiI calibratori multi-farmaco CEDIA, i valori limite primari, i valori limite clinici primari, i valori limite opzionali o i valori limite secondari vengono usati come riferimento per distinguere i campioni positivi da quelli negativi. I campioni che generano un valore di risposta uguale o maggiore rispetto al valore di risposta del calibratore sono considerati positivi. I campioni che generano un valore di risposta inferiore rispetto a quello del calibratore sono considerati negativi. Per ulteriori informazioni, consultare il foglio delle applicazioni relativo all’analizzatore in dotazione.

Risultati semiquantitativiIl calibratore multi-farmaco CEDIA, i valori limite primari, i valori limite clinici primari, i valori limite opzionali o i valori limite secondari, usati insieme al calibratore negativo e ai calibratori multi-farmaco intermedio e alto, possono essere usati per stimare le concentrazioni relative di benzodiazepine.

Si dovrebbe aver cura quando si annotano i risultati delle concentrazioni in quanto esistono molti altri fattori che possono alterare il risultato del test dell’urina, come l’assorbimento di liquidi e altri fattori biologici.

Limitazioni1. Un risultato di analisi positivo indica la presenza di benzodiazepine; non indica o misura

il livello di intossicazione.2. Esiste la possibilità che altre sostanze e/o fattori non elencati (come ad esempio gli

errori tecnici o procedurali) possano interferire con l’analisi e dar luogo a risultati falsi.

Caratteristiche specifiche del rendimento del testLe caratteristiche di rendimento del test tipiche ottenibili mediante l’analizzatore Hitachi 717 sono riportate qui di seguito.11 I valori ottenuti nei diversi laboratori possono essere differenti da quelli riportati in questa sede.

PrecisioneL’esame che segue è stato eseguito usando l’applicazione senza -glucuronidasi. I dati rappresentano sia l’una che l’altra applicazione.

Studi sulla precisione misurata, condotti usando reagenti, calibratori e controlli confezionati, hanno dato i seguenti risultati in mA/min con un analizzatore Hitachi 717 mediante la metodica di replicazione NCCLS modificata (6 replicati due volte al giorno per 10 giorni).

Precisione entro la provo Precisione totale

ng/mL 200 225 300 375 200 225 300 375

n 120 120 120 120 120 120 120 120

x ̄ 324,3 340,6 366,1 402,0 324,3 340,6 366,1 402,0

SD 2,4 2,7 2,8 3,7 11,4 12,5 13,2 14,6

CV% 0,8 0,8 0,8 0,9 3,5 3,7 3,6 3,6

AccuratezzaSeicento quarantotto campioni di urina sono stati dosati con il dosaggio CEDIA per benzodiazepina, usando l’analizzatore Hitachi 717 e un metodo IDE per le benzodiazepine come riferimento (A e B). Sono stati dosati altri duecento campioni e dieci campioni artificialmente elevati (nitrazepam aggiunto fino a entro una gamma di + 25% del valore limite da 200 in urina negativa) con e senza enzima, -glucuronidasi, utilizzando un analizzatore Hitachi 717, con i seguenti risultati (C). Sono stati ottenuti i seguenti risultati.11

A. 200 ng/mL Cutoff B. 300 ng/mL Cutoff C. 200 ng/mL Valore limite con enzima

CEDIA CEDIA CEDIA+ - + - + -

EIA

+ 111 2EIA

+ 93 2CEDIAValore limite senza

enzima

+ 87 0

- 5 530 - 14 539 - 6 117

SpecificitàI seguenti composti progenitori e metaboliti, quando sono stati analizzati con il dosaggio CEDIA per benzodiazepina (senza -glucuronidasi) e il dosaggio ad alta sensibilità (con -glucuronidasi), hanno dato i seguenti risultati di reattività crociata:

Compound

Without -Glucuronidase With -Glucuronidase

Tested (ng/mL)

%Cross-Reactivity

Tested (ng/mL)

%Cross-Reactivity

Nitrazepam 300 100 200 100

7-NH2-Nitrazepam - - 250 83

Alprazolam 138 205 100 220

α-OH-Alprazolam 163 188 115 167

Alprazolam glucuronide - - 200 100

Bromazepam 300 110 190 104

Chlordiazepoxide 2083 13 1200 16

Clobazam 400 62 300 59

Clonazepam 188 140 225 71

NH2-Clonazepam - - 200 96

Clorazepate 325 84 300 75

Delorazepam 150 184 100 197

Demoxepam 1900 14 1000 19

Desalkylflurazepam 138 210 115 173

Diazepam 110 247 125 154

Estazolam 125 220 95 239

Flunitrazepam 188 135 175 109

7-NH2-Flunitrazepam - - 200 99

Flurazepam 150 189 100 195

Halazepam 200 145 200 101

Lorazepam 208 122 175 115

Lorazepam glucuronide 10000 1 400 45

Lormetazepam 163 165 150 137

Medazepam 200 135 150 118

Nordiazepam 150 211 120 173

Oxazepam 275 107 165 125

Oxazepam glucuronide 10000 1 800 25

Oxaprozin 10000 2 10000 2

Prazepam 150 184 160 116

Temazepam 175 144 180 93

Temazepam glucuronide 10000 1 750 25

Triazolam 138 191 90 217

α-OH-Triazolam 150 193 125 155

Thermo Fisher Scientific Oy Ratastie 2, P.O. Box 100 01621 Vantaa, Finland Tel: +358-9-329100 Fax: +358-9-32910300

3

Si sono analizzati con il dosaggio CEDIA per benzodiazepina, protocollo valore limite 300 ng/mL, anche composti non strutturalmente correlati che, alle concentrazioni qui di seguito elencate, hanno dato risultati negativi. Un risultato simile si è notato utilizzando il dosaggio ad alta sensibilità, protocollo valore limite 200 ng/mL.

Composto ng/mL Composto ng/mL

11-nor-∆9-THC-COOH 10.000 Fenobarbitale 500.000

Acetamminofene 500.000 Fluossetina 500.000

Acido acetilsalicílico 500.000 Ibuprofene 500.000

Acido salicilurico 500.000 Levotiroxina 50.000

Amfetamina 500.000 Metadone 100.000

Amossicilina 100.000 Metamfetamina 500.000

Benzoilecgonina 500.000 Morfina 100.000

Captoprile 500.000 Nifedipina 500.000

Cimetidina 500.000 Propossifene 500.000

Codeina 500.000 Ranitidina 500.000

Digossina 100.000 Secobarbitale 500.000

EDDP 500.000 Sertralina 250.000

EMDP 100.000 Tolmetin 500.000

Enalaprile 500.000 Verapamil 500.000

Fenciclidina 250.000

Non è stata osservata alcuna interferenza dovuta all’aggiunta delle seguenti sostanze alle normali concentrazioni endogene ritrovate nelle urine con il dosaggio CEDIA per benzodiazepina.

Sostanza Concentrazione Sostanza Concentrazione

Acetone < 1,0 g/dL Galattosi < 10 mg/dL

Acido ascorbico < 0,15 g/dL γ−globulina < 0,5 g/dL

Acido ossalico < 0,1 g/dL Glucosia < 3,0 g/dL

Cloruro di sodio < 6,0 g/dL Riboflavina < 7,5 mg/dL

Creatinina < 0,5 g/dL Sieroalbumina umana < 0,5 g/dL

Emoglobina < 0,3 g/dL Urea < 4,0 g/dL

Etanolo < 1,0 g/dL

SensibilitàApplicazione standardPer l’applicazione qualitativa, il limite di rilevamento (LOD) è stato rispettivamente di 10,8 ng/mL e di 12,8 ng/mL per i protocolli valore limite 200 ng/mL e 300 ng/mL. Per l’applicazione semiquantitativa, l’LOD è stato rispettivamente di 6,4 ng/mL e di 8,3 ng/mL per i protocolli valore limite 200 ng/mL e 300 ng/mL.

Applicazione ad alta sensibilità per benzodiazepinaPer l’applicazione qualitativa, l’LOD è stato di 12,3 ng/mL. Per l’applicazione semiquantitativa, l’LOD è stato di 7,3 ng/mL.

CEDIA è un marchio depositato della Roche Diagnostics.

Per gli aggiornamenti del foglietto illustrativo, visitare:www.thermoscientific.com/diagnostics

Bibliografia1. Hawks RL. Analytical methodology. In: Hawks RL, Chiang CN, eds. Urine Testing for

Drugs of Abuse. NIDA Research Monograph. 1986; 73: 30-41.2. Katzung BG, ed. Basic and clinical pharmacology. 5th ed. Norwalk, Conn: Appleton &

Lange, 1992.3. Julien RM. A primer of drug action. 6th ed. New York, NY: W.H. Freeman & Co; 1992.4. Goodman and Gilman’s The Pharmacological basis of therapeutics. 8th ed. New York,

NY: Pergamon Press, 1990.5. Adams EH. Prevalence of prescription drug abuse: Data from the National Institute on

Drug Abuse. NY State J Med 199; 91 (suppl 11): 32s-36s.6. Henderson DR, Friedman SB, Harris JD et al. CEDIA™, a new homogeneous immunoassay

system. Clin Chem. 1986; 32: 1637-1641.7. Beck O, Lafolle P, Hjemdahl P et al. Detection of Benzodiazepine Intake in Therapeutic

Doses by Immunoanalysis of Urine: Two Techniques Evaluated and Modified for Improved Performance. Clin Chem. 1992; 38: 271-275

8. Simonsson P, Liden A, Lindberg S. Effect of a-Glucuronidase on Urinary Benzodiazepine Concentrations Determined by Flourescence Polarization Immunossay. Clin Chem. 1995; 41: 920-923

9. Notice of Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Program: Final guidelines. Federal Register. 1994; 110 (June 9): 11983. (le direttive rivalutate sono attese nel 2002).

10. Dati sulla tracciabilità sono disponibili presso la Microgenics Corporation, che fa parte della Thermo Fisher Scientific.

11. Dati disponibili presso la Microgenics Corporation, che fa parte della Thermo Fisher Scientific.

Microgenics Corporation46360 Fremont Blvd.Fremont, CA 94538-6406 USAAssistenza tecnica e assistenzaalla clientela negli USA:1-800-232-3342

Negli altri Paesi:Consultare il rappresentante Thermo Fisher Scientific di zona.

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