Discrepanze tra lo screening computer-assistito e lo ... · nella routine giornaliera, cosa che...

DISCREPANZE TRA LO SCREENING

COMPUTER‐ASSISTITO E LO SCREENING

MANUALE DI PREPARATI GINECOLOGICI

Lavoro di diploma 2011

Redatto da: Diana Müller

Scuola superiore medico tecnica

Svolto presso: UniversitätsSpital Zürich, Abteilung Zytologie

Responsabili: Patrizia Cione e Céline Rigert

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Sommario 1. RIASSUNTO / ABSTRACT ........................................................................................................................................... 3

2. INTRODUZIONE ........................................................................................................................................................ 4

2.1 Il cancro al collo dell’utero .................................................................................................................................. 4

2.1.1 Il virus del papilloma umano ................................................................................................................... 4

2.1.2 Diagnosi e terapia .................................................................................................................................... 5

2.1.3 Prevenzione ............................................................................................................................................. 5

2.2 Modalità di preparazione, di lettura e d’interpretazione di uno striscio citologico ginecologico ...................... 6

2.2.1 La preparazione ....................................................................................................................................... 6

2.2.2 La lettura .................................................................................................................................................. 6

2.2.3 L’interpretazione ..................................................................................................................................... 6

2.3 Il sistema Bethesda ............................................................................................................................................. 6

2.3.1 La lesione squamosa intraepiteliale di basso grado (LSIL) ....................................................................... 7

2.3.2 La lesione squamosa intraepiteliale di altro grado (HSIL) ....................................................................... 7

2.3.3 Cellule squamose atipiche (ASC) ............................................................................................................. 8

2.3.3.1 Cellule squamose atipiche di significato indeterminato (ASC‐US) ...................................................... 8

2.3.3.2 Cellule squamose atipiche, non si esclude lesione squamosa intraepiteliale alto grado (ASC‐H) ...... 8

2.4 Gestione della paziente ....................................................................................................................................... 9

2.5 Scopo e obiettivi del lavoro ............................................................................................................................... 10

3. MATERIALI E METODI ............................................................................................................................................. 11

3.1 Materiali ............................................................................................................................................................ 11

3.1.1 Campioni ................................................................................................................................................ 11

3.1.1.1 Scelta dei campioni ............................................................................................................................ 11

3.1.1.2 Trattamento dei campioni ................................................................................................................. 11

3.1.2 Strumenti ............................................................................................................................................... 12

3.2 Metodi ............................................................................................................................................................... 12

3.2.1 ThinPrep Integrated Imager .................................................................................................................. 12

4. RISULTATI ............................................................................................................................................................... 14

4.1 Analisi statistica ................................................................................................................................................. 16

5. DISCUSSIONE .......................................................................................................................................................... 17

5.1 Commento delle discrepanze ............................................................................................................................... 17

6. CONCLUSIONI ......................................................................................................................................................... 19

7. BIBBLIOGRAFIA ....................................................................................................................................................... 20

8. LESSICO ................................................................................................................................................................... 21

9. RINGRAZIAMENTI ................................................................................................................................................... 22

ALLEGATI ......................................................................................................................................................................... 23

I. Il sistema Bethesda 2001 .................................................................................................................................. 23

II. L’apparecchio ThinPrep 2000 ............................................................................................................................ 26

III. La colorazione di Papanicolau ........................................................................................................................... 29

IV. Apparecchio Tissue Stainer ............................................................................................................................... 30

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1. RIASSUNTO / ABSTRACT

INTRODUZIONE Nel laboratorio di citologia dell’ospedale universitario di Zurigo è stato introdotto da giugno 2010 il ThinPrep Integrated Imager, un microscopio automatico. Questo però non viene usato ancora nella routine giornaliera poiché i tecnici di laboratori non sono certi dell’affidabilità di questo apparecchio. L’obiettivo di questo lavoro sarà quindi di vedere se ci sono delle discrepanze tra la diagnosi fatta con il microscopio automatico e la diagnosi posta tramite screening manuale. Si dovranno classificare queste discrepanze e stilare una statistica. MATERIALI E METODI I campioni analizzati sono dei preparati ginecologici, strisci in stato sottile ThinPrep®. I campioni sono stati inizialmente guardati con l’Integrated Imager e viene data una diagnosi, poiché non è il microscopio automatico che da la diagnosi. In un secondo momento, da un secondo tecnico di laboratorio vengono analizzati con un microscopio normale e anche qui posta una diagnosi. Se le due diagnosi non coincidono si è in presenza di una discrepanza. RISULTATI E DISCUSSIONE Nell’arco di tre periodi differenti sono stati analizzati in totale 1928 campioni, ma presi in considerazione solo 1915 e si sono trovate 52 discrepanze. Queste discrepanze sono state suddivise in 18 gruppi. La discrepanza che non si voleva trovare, e che non è stata trovata era negativo con l’Imager e HSIL manualmente. Si sono trovate delle differenze significative sulla percentuale di discrepanze rinvenute nei tre periodi, dato dal fatto che i tecnici hanno preso più sicurezza con l’apparecchio e con la colorazione. CONCLUSIONI Dai dati ottenuti si può affermare che il ThinPrep Integrated Imager è affidabile, ed è stato introdotto nella routine giornaliera, cosa che velocizzerà molto il lavoro.

INTRODUCTION The ThinPrep Integrated Imager, an automatic microscope, arrived at the laboratory of Cytology of the University Hospital Zurich in June 2010. However, this microscope is not yet in use in the laboratory routine, because biomedical scientists are unsure of the reliability. The purpose of this study was to determine whether there are mismatches between the diagnoses formulated with the ThinPrep Imager and the diagnoses formulated with the manual screening. Discrepancies identified were then classified in order to produce statistics. MATERIALS AND METHODS The samples used were gynecological preparations, Pap smear ThinPrep®. Firstly samples were observed with the automatic microscope Imager and a diagnosis was made, because the automatic microscope does not give the diagnosis. Secondly they were observed by another biomedical scientist using a normal microscope and here also a diagnosis was made. If the two diagnoses were different, a mismatch was noted. RESULTD AND DISCUSSION 1928 samples were collected in three different periods, but only 1915 were taken into consideration and among these 52 discrepancies were found. These mismatches were classify into 18 groups. The discrepancy that we did not want to find, and that we have not found, was negative with the Imager and HSIL manually. Significant differences were noted in the percentage of discrepancies found in the three periods, because biomedical scientists became more assured in using the device and the staining. CONCLUSION From the data obtained it can be said that the ThinPrep Integrated Imager is reliable, and it was introduced into daily routine, which will speed the work up considerably.

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2. INTRODUZIONE

2.1 IL CANCRO AL COLLO DELL’UTERO L’utero è un organo cavo situato tra la vescica e il retto. È costituito da due parti: il corpo e il collo dell’utero o

cervice.

Il corpo è costituito principalmente da uno spesso strato di tessuto muscolare all’esterno e da una membrana

mucosa (endometrio) all’interno.

La parte inferiore dell’utero è costituito dal collo (canale cervicale) e finisce nella vagina, questo ultimo pezzo

viene chiamato orifizio uterino (portio).

Figura 1: Organo genitale femminile [12]

Possono insorgere quindi due tipi diversi di cancro: il cancro del corpo dell’utero, che si sviluppa partendo dalle

cellule endometriali e quello del collo dell’utero, che si sviluppa dalle cellule della cervice. Pur sviluppandosi

nello stesso organo, questi due tipi di cancro sono molto diversi tra loro.

A sua volta il cancro della cervice può avere due aspetti diversi, può originarsi dalle cellule superficiali oppure

dalle cellule cilindriche, anche se molto più raramente.

Il cancro della cervice insorge a causa di infezione cronica del virus del papilloma umano.

In Svizzera ogni anno il cancro al collo dell’utero colpisce circa 230 donne, a circa 5’000 donne viene

diagnosticata una lesione pre‐cancerosa, mentre ne muoiono 90 a causa di questa malattia [1].

2.1.1 Il virus del papilloma umano Il virus del papilloma umano (HPV) è molto comune, al momento esistono più di 100 tipi diversi di HPV, di cui

circa 30 sono trasmessi tramite contatti sessuali [2].

Vengono suddivisi in due grandi categorie:

‐ A basso rischio, causano principalmente verruche genitali (es. tipi 6 e 11)

‐ Ad altro rischio, chiamati così, perché c’è un’alta probabilità di sviluppare un cancro (es. tipi 16 e 18).

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Viene stimato che circa il 70% delle persone sessualmente attive vengono infettate da questo virus [3].

Fortunatamente la maggior parte delle infezioni è transitoria, poiché il sistema immunitario elimina il virus.

Se però questo non avviene, l’infezione viene detta persistente, quindi le probabilità di sviluppare il cancro

aumentano [2].

I fattori di rischio che favoriscono il contagio con l’HPV sono per esempio l’età precoce del primo rapporto

sessuale, il numero di partner sessuali, le gravidanze multiple oppure a causa di un deficit immunitario

(esempio infezione con HIV o persone immunosoppresse) [4].

2.1.2 Diagnosi e terapia Generalmente il cancro alla cervice uterina non presenta sintomi precoci. I primi sintomi possono essere delle

perdite di sangue atipiche.

Quando la donna fa una visita ginecologica, il ginecologo ha varie opzioni, queste di solito variano a seconda

della paziente.

Per prima cosa il medico esegue una palpazione degli organi genitali interni, per eventualmente individuare

degli indurimenti o spostamenti degli organi.

Poi esegue un Pap‐test, o striscio vaginale. Tramite lo speculum vaginale il ginecologo mette in evidenza

l’orifizio uterino e tramite l’uso di speciali bastoncini o spazzole (es: spatola di Ayre e cervibrush) preleva le

cellule dal collo dell’utero e dall’orifizio uterino. Queste cellule devono essere sia della parte esterna della

cervice (esocervice), che di quella interna (endocervice), poiché la maggior parte delle lesioni si sviluppa nella

zona di transizione, cioè quella zona dove l’epitelio piatto pluristratificato dell’esocervice diventa epitelio

cilindrico dell’endocervice. Il materiale viene subito strisciato su un vetrino oppure inserito in un contenitore

ThinPrep® contenente una soluzione alcolica. In seguito viene spedito in un laboratorio specializzato.

Se il medico si accorge che c’è qualcosa che non va nella mucosa può eseguire un altro test, la colposcopia.

Questa tecnica è l’osservazione dell’orifizio tramite una lente a forte ingrandimento, usando anche soluzioni

quali l’acido acetico o il liquido di Lugol [1].

Anche per la terapia ci sono varie opzioni tra cui scegliere a seconda della gravità della malattia.

La conizzazione è la tecnica in cui viene reciso un pezzo del collo dell’utero a forma di cono. Si possono anche

eliminare le cellule precancerose, se i limiti sono ben delineati, con la vaporizzazione laser. Un'altra tecnica è

l’asportazione con l’ansa elettrica (LEEP). Se siamo già in presenza di cellule tumorali si esegue l’asportazione

chirurgica dell’utero, o isterectomia [1].

2.1.3 Prevenzione La prevenzione avviene tramite controlli regolari di screening della cervice (Pap‐test). Il Pap‐test consente di

identificare le lesioni pre‐cancerose e di intervenire prima che evolvano in carcinoma [5].

L’uso del preservativo durante i rapporti sessuali diminuisce il rischio di infezione da HPV, ma non lo elimina,

poiché non protegge tutte le zone della regione genitale [4].

Fino ad oggi sono in commercio due vaccini il Gardasil® (tetravalente) e il Cervarix® (bivalente), questo viene

fatto alle ragazze tra gli 11 e i 14 anni. Viene somministrato in tre dosi e contiene una proteina dell’involucro

del virus, che previene le lesioni causate da 4 tipi di HPV (6, 11, 16 e il 18) per il Gardasil®, mentre il Cervarix®

solo per l’HPV 16 e 18 [5].

Questo vaccino è più efficace se effettuato prima di un possibile contagio con il virus, quindi è vantaggioso farlo

prima dell’inizio dei rapporti sessuali.

Non ha però purtroppo un effetto terapeutico [3].

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2.2 MODALITÀ DI PREPARAZIONE, DI LETTURA E D’INTERPRETAZIONE DI UNO STRISCIO CITOLOGICO GINECOLOGICO

2.2.1 La preparazione I campioni ginecologici che arrivano nel laboratorio di citologia dell’ospedale universitario di Zurigo sono di due

tipi: strisci in strato sottile, ovvero il materiale è inserito in un contenitore ThinPrep® contenente la soluzione

PreservCyt; oppure strisci convenzionali, cioè il ginecologo subito al momento del prelievo striscia il materiale

su un vetrino e lo fissa con uno spray fissativo a base alcolica.

In seguito vengono allestiti i vetrini dei prelievi ThinPrep® con un apparecchio.

Infine tutti i campioni vengono colorati con la colorazione di Papanicolaou (prende il nome dal suo ideatore).

2.2.2 La lettura Lo striscio citologico si guarda con il microscopio, prima con l’obiettivo 10x per osservare l’aspetto generale.

Per andare nei particolari si usa l’obiettivo 40x, e per segnalare cellule sospette si usa l’obiettivo minore, il 4x, e

con l’inchiostro si fa un puntino leggermente sopra l’area interessata.

Le possibili cellule che si riscontrano nel preparato ginecologico sono:

- cellule squamose dell’esocervice: superficiali, intermedie, parabasali e basali;

- cellule cilindriche dell’endocervice;

- cellule metaplastiche (cellule della zona di trasformazione);

- cellule endometriali (cellule dell’utero);

- cellule del sangue: eritrociti, granulociti, istiociti, linfociti;

- batteri: lactobacilli, Bacillo di Doederlein (flora normale)

Tutte queste cellule, tranne quelle del sangue, possono presentare delle modificazioni se c’è un’infiammazione

cervico‐vaginale. Questa può avere diverse cause: presenza di batteri (flogosi), protozoi (tricomonas), miceti

(candida), virus (HPV, herpes), oppure può essere causata da traumi, dalla gravidanza, dalla menopausa.

Le modificazioni possono essere sia a livello del nucleo che del citoplasma [6].

2.2.3 L’interpretazione L’interpretazione si basa sulle caratteristiche delle cellule.

Si osserva la morfologia del nucleo e del citoplasma e anche come queste cellule sono disposte.

Per quanto riguarda il nucleo, che è una caratteristica molto importante per determinare il grado di un’atipia, si

osserva:

- la cromatina: densità e distribuzione;

- il rapporto nucleo/citoplasma;

- il/i nucleolo/i, se presente/i: dimensione e forma [6].

2.3 IL SISTEMA BETHESDA Nel dicembre 1988 a Bethesda nel Maryland (USA), un gruppo di citologi e istopatologi si incontra e coniano

per la prima volta il sistema Bethesda.

Questo sistema ha lo scopo di creare una classificazione internazionale dei campioni citologici cervicali, per

rendere più comprensibile l’interpretazione della citologia al clinico. Serve anche per poter avere una

terminologia uniforme e riproducibile tra laboratori e patologi diversi.

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Questo sistema è diviso in due classi: lesione squamosa intraepiteliale di basso grado (LSIL) e lesione squamosa

intraepiteliale di altro grado (HSIL).

Le lesioni squamose intraepiteliali dell’epitelio cervicale sono associate all’infezione dell’HPV [7].

Nel 2001 c’è stata una revisione di questo sistema (vedi allegato 1).

Qui di seguito spiego le 4 categorie principali che interessano il mio lavoro.

2.3.1 La lesione squamosa intraepiteliale di basso grado (LSIL) In questa lesione le cellule atipiche sono quelle superficiali e intermedie, che presentano un aumento del

nucleo (circa 3 volte di più), un po’ ipercromici con cromatina uniforme e granulare. Possibile bi‐ o multi‐

nucleazione.

La caratteristica tipica di questa lesione è la presenza di coilociti, cioè le cellule presentano una condensazione

del citoplasma ai bordi e un alone chiaro attorno al nucleo atipico. Se è presente solo l’alone perinucleare

senza atipie del nucleo non può essere considerata LSIL [7].

Figura 2: LSIL, obiettivo 40X. Coilociti [13].

2.3.2 La lesione squamosa intraepiteliale di altro grado (HSIL) Le modificazioni da HSIL coinvolgono le cellule meno mature, cioè le cellule parabasali e basali.

Ingrandimento dei nuclei, con marcato aumento del rapporto nucleo/citoplasma. Nuclei con forme e grandezze

diverse, contorno della membrana nucleare irregolare. Presenza di ipercromasia. Cellule singole oppure in

aggregati [7].

Figura 3: HSIL, obiettivo 60X. Cellule presentano un aumento del rapporto nucleo‐citoplasma [13].

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2.3.3 Cellule squamose atipiche (ASC) Il termine ASC sta ad indicare delle alterazioni citologiche di lesione intraepiteliale squamosa, ma che sono

quantitativamente e qualitativamente insufficienti per poter dare una diagnosi certa [7].

2.3.3.1 Cellule squamose atipiche di significato indeterminato (ASCUS) I criteri morfologici sono molto simili a quelli della LSIL. I nuclei ingranditi 2,5‐3 volte, leggero aumento del

rapporto nucleo/citoplasma. Leggera ipercromasia [7].

Figura 4: ASCUS, obiettivo 60X. Nucleo ingrandito e leggero alone perinucleare [14].

2.3.3.2 Cellule squamose atipiche, non si esclude lesione squamosa intraepiteliale alto grado (ASCH)

Le cellule di questa categoria sono di solito rare e disperse, con le seguenti caratteristiche: dimensioni della

cellula metaplastica con nuclei ingranditi, aumento rapporto nucleo/citoplasma. Se presente ipercromasia,

cromatina e forma del nucleo irregolare la lesione va più verso l’HSIL [7].

Figura 5: ASCH, obiettivo 60X. Cellule atipiche, membrana nucleare irregolare, ipercromasia, leggero aumento del rapporto nucleo‐citoplasma [13].

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2.4 GESTIONE DELLA PAZIENTE In base al risultato dell’esame ginecologico, l’approccio con la paziente del ginecologo cambia. Se la diagnosi è:

- Negativa: paziente continua con controlli regolari ogni tre anni circa.

- ASC‐US: in donne sopra i 20 anni si hanno 3 possibili vie: ripetere il Pap‐test dopo 6 mesi, se diagnosi

normale ripeterlo ancora dopo 6 mesi fino a che non si hanno due diagnosi negative di seguito, se però

risulta ancora positivo è consigliata la colposcopia; fare il test dell’HPV, se positivo per alto rischio

eseguire una colposcopia, se negativo ripetere il Pap‐test dopo 1 anno; oppure eseguire subito la

colposcopia. Alle adolescenti si consiglia di ripetere lo striscio dopo 12 mesi, poiché si hanno buone

probabilità che la lesione guarisca da sola; mentre il test dell’HPV è sconsigliato, perché probabilmente

risulta positivo. Infatti in questa fascia d’età è molto elevato il tasso d’infezione, ma molto basso il tasso

di cancro della cervice.

- LSIL: alle adolescenti è consigliato ripetere lo striscio dopo 12 mesi, se risulta ancora positivo si consiglia

la colposcopia. Alle donne è consigliata la biopsia previa colposcopia, mentre alle donne incinte solo la

colposcopia. Alle donne in post‐menopausa si consiglia la colposcopia, il test dell’HPV o ripetere il Pap‐

test dopo 6 e 12 mesi.

- ASC‐H: consigliata la colposcopia.

- HSIL: alle donne adulte, incinte e alle adolescenti consigliata la biopsia previa la colposcopia [11].

Qui di seguito uno schema riassuntivo del possibile follow‐up delle pazienti:

Figura 6. schema riassuntivo della gestione della paziente in base alla diagnosi

Pap‐Test

Negativo Positivo

Screening

di routine

ASCUS LSILASCH

HSIL

Ripetere

citologia

(6‐12 mesi)

Test HPV

positivo

positiva

negativo

Negativa

Colposcopia

Biopsia e

colposcopia

Ripetere

citologia

(6‐12 mesi)

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La gestione della paziente varia molta a seconda del medico. All’ospedale universitario di Zurigo generalmente

una paziente con la diagnosi HSIL viene ricontrollata subito con una colposcopia e una biopsia. Mentre per

pazienti con ASCUS, LSIL o ASCH si preferisce ripetere il Pap‐test dopo 3‐6 mesi.

2.5 SCOPO E OBIETTIVI DEL LAVORO Questo lavoro di diploma è incentrato sul microscopio automatico ThinPrep Integrated Imager della ditta

Hologic. Questo è attivo da giugno 2010 all’ospedale universitario di Zurigo, nel dipartimento di citologia.

Prima di metterlo in funzione è stata svolta una piccola analisi di campioni, e si è notato che ci sono delle

discrepanze tra la diagnosi fatta usando il microscopio automatico e quella osservando il vetrino in modo

tradizionale direttamente da un TAB.

La ditta e i tecnici di Hologic sanno che questo apparecchio fa degli errori, non riconosce i coilociti se questi non

hanno il nucleo abbastanza grande e atipico. Il personale per essere sicuro della diagnosi osserva il vetrino due

volte, poiché non è certo dell’affidabilità di questo apparecchio.

Quindi tramite il mio lavoro cercherò di testare appunto l’affidabilità del microscopio, cioè vedere se il

ThinPrep Integrated Imager non tralascia dei punti importanti che potrebbero modificare la diagnosi. Il

primario del dipartimento di citologia, la Dottoressa Beata Bode ha posto una condizione: se non si trova la

discrepanza negativo con l’Imager e HSIL manualmente il ThinPrep Integrated Imager può essere introdotto

nella routine giornaliera.

Per fare ciò, cercherò di raggiungere i seguenti obiettivi: ampliare e completare l’analisi differenziale fatta in

precedenza e cercare di classificare le non correlazioni.

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Figura 8. Striscio in strato sottile, ottenuto da campione ThinPrep®. L’etichetta che si vede nella foto a sinistra è quella apposita per l’Imager. Mentre quella a destra è l’etichetta

Figura 7. Flacone ThinPrep® [15]

3. MATERIALI E METODI

3.1 MATERIALI

3.1.1 Campioni

3.1.1.1 Scelta dei campioni I campioni presi in esame sono strisci ginecologici in strato sottile, ThinPrep®. Questo è un flacone dove

vengono sospese le cellule prelevate durante il Pap‐test. Contiene una soluzione alcolica che serve per

preservare le cellule (figura 7). Viene usato questo tipo di campioni, poiché il ThinPrep Integrated Imager, ha

bisogno di vetrini speciali che devono essere eseguiti con l’apparecchio ThinPrep 2000, 3000 o 5000.

Vengono analizzati tutti i prelievi che arrivano nel dipartimento di citologia.

I campioni provengono direttamente dall’ospedale universitario, oppure da ginecologi esterni.

3.1.1.2 Trattamento dei campioni Per prima cosa i campioni vengono etichettati.

In seguito viene fatto il vetrino del preparato tramite l’apparecchio ThinPrep 2000 (vedi allegato 2).

Infine vengono colorati con la colorazione di Papanicolau (allegato 3) mediante l’apparecchio Tissue Stainer

(allegato 4).

I vetrini vengono etichettati con due diverse etichette: quella interna del laboratorio con il numero del caso

dietro il vetrino, mentre davanti l’etichetta apposita per l’Integrated Imager (vedi figura 8).

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3.1.2 Strumenti Lo strumento principale di questo lavoro è il ThinPrep Integrated Imager (Hologic, USA), si tratta di un

microscopio automatico.

L’Integrated Imager è composto da:

- il microscopio, regolabile individualmente con fotocamera, lettore ID del vetrino, piatto

portaoggetti automatico, comandi manuali e interfaccia touch‐screen personalizzabile.

- il controller, che controlla il sistema elettromeccanico e i sottosistemi di imaging

- il computer, dove si trova il database e l’applicazione del sistema.

Figura 9. ThinPrep Integrated Imager. A destra si vede lo schermo touch‐screen, dove vengono segnalati i 22 punti dal controller [15]

3.2 METODI

3.2.1 ThinPrep Integrated Imager Il ThinPrep Integrated Imager è un microscopio automatico, che però può anche essere usato come un

microscopio normale.

Il vetrino viene posto sul piatto e fatta partire la scansione, questa dura circa 90 secondi, nei quali ogni cellula

viene analizzata e tramite un algoritmo vengono identificate le caratteristiche cellulari e tenuto conto del grado

d’intensità d’oscuramento del nucleo (l’ipercromasia) vengono selezionate le cellule o i gruppi di cellule che

possono essere significative per porre una diagnosi. Memorizza nel database e indica sul touch‐screen 22

coordinate, specifiche per quel determinato vetrino [8,9]. 20 punti segnano cellule squamose, un punto segna

(se presenti) le cellule ghiandolari e un punto segna cellule che non sono ne squamose ne ghiandolari (per

esempio un ammasso di granulociti).

Questi 22 punti vengono poi osservati da un tecnico in analisi biomediche (TAB), che analizzando ad uno ad uno

i 22 campi, sceglie le cellule per lui significative per ogni campo e con l’inchiostro di china, guardando nel

microscopio con l’obiettivo 4x, fa un puntino leggermente sotto la zona interessata.

13

Per passare da una coordinata all’altra ci sono due sistemi possibili, o direttamente con lo schermo touch‐

screen, oppure tramite una manopola apposita. Segnati tutti i 22 punti viene data una diagnosi, poiché non è il

microscopio stesso che pone la diagnosi. In un secondo momento un altro TAB riguarda il vetrino intero e i 22

punti con un normale microscopio. Pone a sua volta una diagnosi.

Se le due diagnosi non coincidono si è in presenza di una discrepanza.

Se si trovano delle cellule che non corrispondono alla diagnosi fatta con l’Imager vengono segnate a loro volta

con l’inchiostro di un altro colore.

In caso di risultato negativo, e la paziente non ha precedenti o sono negativi, in generale il vetrino viene

osservato solamente da un TAB diplomato. Se il risultato è negativo, ma la paziente ha risultati precedenti

positivi, l’esame colposcopio sospetto, oppure tutto l’insieme del vetrino è sospetto, viene osservato da due

TAB. Mentre se la diagnosi è positiva viene guardato da due TAB e da un medico.

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4. RISULTATI

I risultati sono stati raccolti nell’arco di tre periodi diversi:

PERIODO CAMPIONI DISCREPANZE

1 Marzo – Maggio 2010 513 37

2 Novembre – Dicembre 2010 601 12

3 Gennaio – Marzo 2011 814 3

Nel terzo periodo ho analizzato personalmente 64 campioni, ed ho trovato 1 discrepanza.

Il metodo di raccolta dei dati varia tra i tre periodi: nel primo, come pure i miei 64 campioni, sono stati

analizzati tutti da due TAB, prima con l’Imager e poi manualmente. Nel secondo e nel terzo periodo (i 750

campioni che sono stati analizzati da TAB diplomati), i vetrini non sono stati ricontrollati manualmente, se la

diagnosi all’Imager era negativa e la paziente non aveva risultati precedenti positivi.

Per poter avere un numero di dati da analizzare maggiore ho deciso di riunire le tre serie di dati.

Purtroppo 13 campioni del primo periodo non hanno potuto essere processati, poiché il ThinPrep Integrated

Imager ha segnalato un errore (per esempio: il vetrino aveva troppe cellule, presenza di artefatti, errore della

fotocamera). Quindi in totale i campioni analizzati sono 1915, e le discrepanze 52.

La percentuale di risultati corretti è di 97.28%, mentre si ha un 2.72% di discrepanze.

Tabella 1. Insieme dei risultati ottenuti

Imager

Diagnosi NO ASCUS LSIL1 LSIL2 ASCH HSIL ALTRO Totale

Manuale

NO 1524 11 0 0 1 0 1 1537

ASCUS 9 114 2 0 2 1 0 128

LSIL1 1 6 98 0 0 0 0 105

LSIL2 0 3 1 17 1 2 0 24

ASCH 2 4 0 0 21 0 0 27

HSIL 0 0 2 1 2 59 0 64

ALTRO 0 0 0 0 0 0 30 30

Totale 1536 138 103 18 27 62 31 1915

NO = nessuna malignità; ASCUS = cellule atipiche di significato indeterminato; LSIL1 = lesione di basso grado; LSIL2 =

lesione di basso grado, presenza di cellule sospette per l’HSIL; ASCH = cellule atipiche, non si esclude HSIL; HSIL = lesione di

alto grado; ALTRO = categoria contenente diagnosi rare (adenocarcinoma, carcinoma o cellule ghiandolari atipiche) oppure

i campioni dove il materiale non era rappresentativo.

15

Nella Tabella 1. sono riassunti tutti i risultati ottenuti. Leggendo le colonne si osservano le diagnosi date con il

microscopio automatico, mentre nelle righe quelle date con il microscopio normale.

Nella diagonale colorata si osservano il numero di diagnosi uguali che si sono date, prima con l’Imager e dopo

confermate manualmente. Mentre in rosso è segnato il numero di discrepanze ritrovate, cioè con l’Imager si è

data una diagnosi, che però è stata smentita manualmente.

Esempio di lettura: nella colonna 2 riga 1, si legge che con l’Imager si sono date 11 diagnosi di ASCUS, ma che

però riguardando il vetrino con il microscopio normale, si è data invece la diagnosi di nessuna malignità.

Nella tabella 2 sono riportate le discrepanze ottenute.

Tabella 2. classificazione delle discrepanze trovate, con rispettive percentuali

Numero discrepanze

Diagnosi Imager

Diagnosi manuale

Percentuale su discrepanze

Percentuale su campioni totali

1 11 ascus no 21.15% 0.57%

2 9 no ascus 17.31% 0.47%

3 6 ascus lsil1 11.54% 0.31%

4 4 ascus asch 7.69% 0.21%

5 3 ascus lsil2 5.77% 0.16%

6 2 no asch 3.85% 0.10%

7 2 lsil1 ascus 3.85% 0.10%

8 2 lsil1 hsil 3.85% 0.10%

9 2 asch ascus 3.85% 0.10%

10 2 asch hsil 3.85% 0.10%

11 2 hsil lsil2 3.85% 0.10%

12 1 no lsil1 1.92% 0.05%

13 1 lsil1 lsil2 1.92% 0.05%

14 1 lsil2 hsil 1.92% 0.05%

15 1 asch no 1.92% 0.05%

16 1 asch lsil2 1.92% 0.05%

17 1 hsil ascus 1.92% 0.05%

18 1 agc2* no (Tamoxifenzellen)** 1.92% 0.05% * cellule ghiandolari atipiche, sospetto di trasformazione neoplastica. ** Tamoxifenzellen, cellule che presentano delle

modificazioni a causa del medicamento che assume la paziente.

Le 52 discrepanze rinvenute si sono divise in 18 gruppi, riportati nella Tabella 2. Nella prima colonna si osserva

il numero di discrepanze classificate in un determinato gruppo.

Si sono poi calcolate la percentuale di un determinato tipo di discrepanza prima sul totale delle discrepanze, e

in seguito sul totale dei campioni analizzati.

16

4.1 ANALISI STATISTICA Sono state calcolate l’accuratezza, la sensibilità e la specificità, riportate nella tabella seguente.

Tabella 3. Accuratezza, sensibilità e specificità

ACCURATEZZA SENSITIVITÀ SPECIFICITÀ

% % CI (%) % CI (%)

NO 98.7 96.6 94.7 ‐ 98.5 99.2 98.8 ‐ 99.6

ASCUS 98 89.1 83.9 ‐ 94.3 98.6 98.0 ‐ 99.2

LSIL1 99.4 93.3 88.5 ‐98.1 99.7 99.4 ‐ 100

LSIL2 99.6 70.8 49.8 ‐ 91.8 99.9 99.8 ‐ 100

ASCH 99.4 77.8 62.1 ‐ 93.5 99.7 99.5 ‐ 100

HSIL 99.6 92.2 85.5 ‐ 98.9 99.8 99.6 ‐ 100 Accuratezza = quantità delle analisi corrette; Sensitività = frazione di soggetti malati che risultano positivi

al test; Specificità = frazione di soggetti sani che risultano negativi al test; CI = Intervallo di confidenza al 95%

Per calcolare i dati della Tabella 3. si è usato come gold standard (standard di riferimento) la diagnosi manuale.

Si nota che le percentuali trovate sono molto alte, quindi la probabilità di trovare falsi negativi (soggetti positivi

nella diagnosi manuale, ma negativi all’Imager) o falsi positivi (soggetti negativi nella diagnosi manuale, ma

positivi all’Imager) è molto bassa.

In seguito è stato eseguito il metodo della Kappa di Cohen. Viene utilizzato quando si vuole determinare il

grado di accordo tra due valutatori, in questo caso il grado di accordo tra i due metodi di screening [10]. Il

perfetto accordo si ha con un valore di k uguale a 1. Di solito questo avviene quando tutte le celle non poste

sulla diagonale colorata della Tabella 1. sono uguali a 0, ma non è questo il caso.

L’indice k è uguale a 0.922 (intervallo di confidenza al 95%: 0.901 – 0.943), che se si tiene conto della tabella

proposta da J. Richard Landis e Gary G. Koch nel 1977 [10], questo valore corrisponde a un livello di accordo

molto buono. Quindi il valore della Kappa di Cohen ci indica che non ci sono molte discrepanze tra le diagnosi

fatte con l’Imager e quelle manuali, anzi l’accordo tra la diagnosi data con il ThinPrep Integrated Imager e la

diagnosi data dopo aver ricontrollato il vetrino manualmente è molto buono.

17

5. DISCUSSIONE

Il confronto tra il numero di discrepanze trovate e il totale dei campioni analizzati nei tre diversi periodi mostra

che c’è una differenza: nel primo periodo la percentuale di discrepanze è del 7.21%, nel secondo del 1.99%,

mentre nell’ultimo periodo è solamente del 0.37%.

Una possibile spiegazione è che le TAB diplomate, quando sono all’Imager, guardano solamente i 22 punti, se

risultano negativi e la paziente non ha precedenti positivi, il vetrino non viene guardato una seconda volta

manualmente. Quindi non si è segnalata una discrepanza se in questi casi l’Imager non ha segnalato delle

cellule sospette, che però si sarebbero viste durante lo screening manuale.

Un’altra ipotesi potrebbe essere che il secondo TAB che ricontrolla il vetrino manualmente, se trova una

discrepanza non l’ha segnalata al TAB responsabile di tener conto delle discrepanze.

Oppure, ma molto probabilmente, con il passare del tempo, i TAB hanno preso più sicurezza con l’apparecchio

e con la colorazione. Quest’ultima l’hanno dovuta modificare per far si che l’Imager analizzasse le cellule

correttamente, per cui i TAB all’inizio non erano abituati a questa nuova colorazione, che colorava i nuclei in

modo più marcato (risultavano più scuri del normale).

5.1 COMMENTO DELLE DISCREPANZE Dalla Tabella 2. si nota che si sono trovati 18 tipi di discrepanze diverse.

La più frequente (21.15%), è ASCUS con Imager, mentre nessuna malignità con il microscopio normale.

Guardando solo le 22 coordinate, se c’è una cellula con il nucleo leggermente ingrandito sembra molto più

grave, se non ho osservato le caratteristiche dell’intero vetrino; potrebbe per esempio solo trattarsi di una

modifica cellulare causata da un’infiammazione.

Può anche essere spiegata dal fatto che la colorazione, come detto sopra, è stata modificata apposta per

l’Imager, così i nuclei di cellule normali potevano sembrare più atipici.

Al secondo posto si ha l’inverso, con il 17.31%, nessuna malignità con l’automatico e ASCUS manualmente.

L’ASCUS è una delle diagnosi più problematiche in citologia, poiché si basa molto sull’interpretazione del

singolo TAB o medico. Si tratta appunto di un quadro non ben definito per poter dare una diagnosi più

specifica.

Per la terza discrepanza più ritrovata (ASCUS con l’automatico e LSIL1 manualmente, 11.54%) e per la

discrepanza numero 5 (ASCUS con l’Imager e LSIL3 manualmente, 5.77%), può essere data dal fatto che, come

detto in precedenza (capitolo 2.5), il ThinPrep Integrated Imager non riconosce a volte i coilociti, che sono la

caratteristica principale, ma non necessaria, della LSIL.

La discrepanza numero 18 della Tabella 2. per esempio è un caso raro, la diagnosi all’Imager è stata di cellule

ghiandolari atipiche, mentre manualmente di nessuna malignità. Si è poi scoperto che erano cellule normali

che presentavano delle modificazioni dovute al medicamento antitumorale (Tamoxifene) che prendeva la

paziente.

La ditta ha affermato che l’apparecchio non riconosce a volte bene la presenza di coilociti, e come si vede 5 tipi

di discrepanze su 18 (27.7%), la diagnosi definitiva manuale è stata di LSIL.

18

Uno dei problemi che sta dietro al fatto di trovare delle discrepanze tra i due metodi di screening è che in base

alla diagnosi il modo di seguire la paziente da parte del medico varia (capitolo 2.4).

Se la diagnosi data con il microscopio automatico Integrated Imager è di grado di malignità inferiore rispetto a

quella ritrovata manualmente è una discrepanza più significativa, perché appunto l’approccio con la paziente

può cambiare anche radicalmente. La discrepanza che non si voleva ottenere era quella di nessuna malignità

con l’Imager, e manualmente un HSIL. Non si voleva trovare questa discrepanza, perché all’ospedale

universitario di Zurigo se una paziente ha un HSIL vengono fatti subito degli altri controlli (biopsia previa

colposcopia), mentre ASCUS, LSIL, ASCH vengono ricontrollati dopo 3‐6 mesi e se non ci sono malignità si

continua con lo screening normale.

Tra le discrepanze ritrovate in questo studio la più significativa è: LSIL1 dell’Imager e HSIL manualmente

(3.85%).

19

6. CONCLUSIONI

Lo scopo di questo lavoro era di testare l’affidabilità del microscopio automatico ThinPrep Integrated Imager.

La raccolta dati svolta nei mesi di marzo‐maggio 2010 è stata ampliata, e le discrepanze ottenute sono state

classificate.

L’apparecchio è affidabile, poiché la discrepanza che il primario del dipartimento di citologia non voleva

ottenere, cioè nessuna malignità con l’Imager e HSIL manualmente, non è stata ottenuta.

Si dovrebbe prestare però attenzione al fatto che non riconosce i coilociti. Generalmente l’Imager indica

comunque delle cellule atipiche per dare la diagnosi di ASCUS, e ricontrollando il vetrino manualmente si

trovano poi i coilociti.

Quindi il microscopio automatico è stato introdotto nella routine del laboratorio di citologia dell’ospedale

universitario di Zurigo. Questo fatto velocizzerà molto il lavoro del TAB, poiché il TAB non deve più guardare

tutto il vetrino, ma solo i 22 punti ottenuti dopo solo circa 90 secondi.

Il tempo di osservazione di un vetrino con l’utilizzo del ThinPrep Integrated Imager verrà dimezzato rispetto allo

screening manuale.

20

7. BIBBLIOGRAFIA

Testo

1. http://www.legacancro.ch/it/il_cancro/malattie_cancerogene/cancro_del_collo_dell_utero_/, gennaio

2011

2. http://www.acog.org/publications/patient_education/bp073.cfm, marzo 2011

3. http://www.bag.admin.ch/themen/medizin/00682/00685/03212/index.html?lang=it&download=NHzL

pZeg7t,lnJ6IzdeIp96km56VmGdvmJhOqdayYLGH4crdzYam3aiFfm2vv2ym162epYbg2c_JjKbNoKOn6A,

marzo 2011

4. http://www.nicer‐swiss.ch/Editor/files/Krebs_in_der_Schweiz_i.pdf, marzo 2011

5. http://www4.ti.ch/fileadmin/DSS/DSP/ICP/RCT/pdf/Relazioni_poster/2008/Pedrazzini_vaccino2008.pd

f, marzo 2011

6. Borsari A., corso di citologia ginecologica, dispense scolastiche di citologia, febbraio 2009

7. Solomon D., Nayar R., The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology, New York, Springer, 2004.

p. IX‐XII, 65‐79, 85‐101.

8. ThinPrep® Integrated Imager Betriebshandbuch

9. http://www.hologic.com/it/news‐releases/173‐id.234881569.html, marzo 2011

10. http://www.dsa.unipr.it/soliani/capu20.pdf, aprile 2011

11. http://www.uptodate.com/index, aprile 2011

Figure

12. http://assets.krebsliga.ch/downloads/2010_broschure_ghk_i_def.pdf, gennaio 2011

13. www.cytologystuff.com, marzo 2011

14. http://nih.techriver.net/listing.php?chapterOutline=4‐1, marzo 2011

15. Foto scattate da Diana Müller presso l’ospedale universitario di Zurigo, nel dipartimento di citologia

21

8. LESSICO

HPV: virus del papilloma umano

LSIL: lesione squamosa intraepiteliale di basso grado

HSIL: lesione squamosa intraepiteliale di alto grado

ASC‐US: cellule atipiche di significato indeterminato

ASC‐H: cellule atipiche di significato indeterminato, non si esclude HSIL

TAB: tecnico in analisi biomediche

22

9. RINGRAZIAMENTI

I miei ringraziamenti vanno a tutte le persone che mi hanno aiutato e sostenuto nello svolgimento di questo

lavoro:

Le mie due responsabili la capo laboratorio Patrizia Cione e la TAB Céline Rigert per la loro disponibilità

nel rispondere alle mie domande e per avermi seguita durante il lavoro

Il primario la Dott.ssa Beata Bode per avermi permesso di svolgere il lavoro nel dipartimento di

citologia dell’ospedale universitario di Zurigo

Tutto il personale del laboratorio per avermi aiutata nello svolgere il lavoro raccogliendo i dati

Il direttore della scuola superiore medico tecnica di Locarno Andrea Boffini e i docenti Giovanni Togni,

Claudio Naiaretti e Sonja Marci per i preziosi consigli di metodologia

La docente Susan Gilbert per la disponibilità e l’aiuto nella stesura del testo in inglese

La mia famiglia e i miei compagni di classe

23

ALLEGATI

I. IL SISTEMA BETHESDA 2001

26

II. L’APPARECCHIO THINPREP 2000

29

III. LA COLORAZIONE DI PAPANICOLAU

30

IV. APPARECCHIO TISSUE STAINER

Discrepanze tra lo screening computer-assistito e lo ... · nella routine giornaliera, cosa che...

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