Centro di referenza nazionale e FAO per la rabbia

Schema Diagnosi della rabbia Risultati Circuito RV-D 1-17Dicembre 2017

Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie

Viale dell’Università 10, 35020 – Legnaro, Padova

Ring test nazionale per la diagnosi della rabbia 2017 Schema RV-D 1-17

Report finale

Data di emissione: 29/12/2017

Paola De Benedictis - Responsabile dello schema Barbara Zecchin - Referente tecnico-scientifico

Laboratorio zoonosi e patogeni emergenti/riemergenti –SCS5 Centro di Referenza Nazionale e FAO per la rabbia Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie

Marzia Mancin - Responsabile statistico Dipartimento di Analisi del rischio e sorveglianza in sanità pubblica – SCS1

Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie

2

Sommario

Introduzione ............................................................................................................... 3

TABELLA 1. ELENCO DEI LABORATORI PARTECIPANTI ALLO SCHEMA RV-D 1-17. ........................ 3

Composizione del pannello .............................................................................. 3

TABELLA 2. CEPPI VIRALI PRESENTI NEL PANNELLO DELLO SCHEMA RV-D 1-17. ........................ 4

Analisi della concordanza e criteri di accettabilità ............................ 5

Identificazione qualitativa dell’antigene virale ed isolamento virale ......... 5

Valutazione quantitativa dell’antigene virale ..................................................... 6

Risultati ......................................................................................................................... 6

Emissione report individuale .................................................................................. 6

Risultati ottenuti mediante metodica IF ............................................................... 6

TABELLA 3. TEST DI IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA: IDENTIFICAZIONE E VALUTAZIONE

QUANTITATIVA DELL’ANTIGENE VIRALE. .................................................................................... 7

TABELLA 4. IDENTIFICAZIONE DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA E P. .............................. 8

FIGURA 1. IDENTIFICAZIONE DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA DEI LABORATORI

PARTECIPANTI E KAPPA COMPLESSIVO. ................................................................................... 8

TABELLA 5. VALUTAZIONE QUANTITATIVA DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA E P. ............. 9

FIGURA 2. VALUTAZIONE QUANTITATIVA DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA DEI LABORATORI

PARTECIPANTI E KAPPA COMPLESSIVO. ................................................................................... 9

Risultati ottenuti mediante metodica RTCIT .................................................... 10

TABELLA 6. ISOLAMENTO DEL VIRUS RABBIA SU COLTURE CELLULARI: VALORI DI KAPPA E P. ...... 10

FIGURA 3. ISOLAMENTO DEL VIRUS DELLA RABBIA SU COLTURE CELLULARI: VALORI DI KAPPA DEI

LABORATORI PARTECIPANTI E KAPPA COMPLESSIVO. .............................................................. 10

Confronto dei risultati precedenti, discussioni e raccomandazioni ........ 11

FIGURA 4. IDENTIFICAZIONE E VALUTAZIONE QUANTITATIVA DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI

KAPPA COMPLESSIVI 2015-2017. ......................................................................................... 11

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Introduzione A partire dall’anno 2014, il laboratorio nazionale di riferimento per la rabbia (CRN), nell’ambito delle proprie responsabilità, organizza annualmente il ring test per la diagnosi della rabbia, con l’obiettivo di valutare ed armonizzare le prestazioni tecniche dei laboratori nazionali sulle metodiche di riferimento. Come ogni anno, il requisito minimo per partecipare allo schema, è stata la dichiarazione, da parte del laboratorio partecipante, che il personale coinvolto nelle prove sia stato vaccinato e presenti un titolo anticorpale post vaccinale superiore a 0,5 UI/ml con verifica dello stesso effettuata da un massimo di sei mesi (D. Lgs. 9 Aprile 2008, n. 81). Al ring test 2017 (schema RV-D 1-17) hanno partecipato pertanto 8 laboratori appartenenti alla rete degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali (II.ZZ.SS.), incluso il

laboratorio del CRN (TABELLA 1). Al fine di tutelare la riservatezza dei dati, nel presente

documento i laboratori partecipanti sono resi anonimi e identificati esclusivamente tramite codice alfa-numerico.

TABELLA 1. ELENCO DEI LABORATORI PARTECIPANTI ALLO SCHEMA RV-D 1-17.

Composizione del pannello Tredici campioni diagnostici, identificati da un codice alfanumerico assegnato in modo casuale, sono stati inviati a ciascun laboratorio partecipante, insieme ad un campione negativo e uno positivo di riferimento. Al fine di ottenere campioni di prova simili alla matrice esaminata nella routine diagnostica, i campioni positivi sono stati ottenuti miscelando encefalo di topo, infettato sperimentalmente, con encefalo di carnivoro (domestico/selvatico) precedentemente identificato come negativo per la rabbia. I campioni negativi sono stati ottenuti da encefalo di carnivoro precedentemente identificato come negativo. I controlli positivo e negativo di riferimento sono stati ottenuti, rispettivamente, da encefalo di topo infettato sperimentalmente o da encefalo di topo non infetto. Nel pannello sono stati inclusi, oltre al ceppo di riferimento CVS-11, anche virus di campo

e lyssavirus rabbia-correlati. La TABELLA 2 riporta in dettaglio i ceppi virali presenti nel

pannello del circuito 2017. Tutti i ceppi utilizzati appartengono al filogruppo I del genere Lyssavirus, per il quale il vaccino umano conferisce protezione efficace (Evans et al., 2012).

Laboratorio Referente del circuito

IZLER – Sede di Brescia Dr. Giovanni Loris Alborali

IZSPLV - Sede di Torino Dr. Alessandro Dondo

IZS Mezzogiorno - Sede di Portici (NA) Dr.ssa Giovanna Fusco

IZS Sicilia - Sede di Palermo Dr.ssa Giuseppa Purpari

IZSUM – Sede di Perugia Dr.ssa Livia Moscati

IZSAM- Sede di Teramo Dr. Giovanni Savini

IZSLT - Sede di Roma Dr.ssa Maria Teresa Scicluna

IZSVe – Sede di Legnaro (PD) Dr. Calogero Terregino

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I campioni sono stati forniti liofilizzati, previa esecuzione di prove di omogeneità e stabilità secondo quanto indicato nel Manuale della Qualità IZSVe, Sezione 6 - Progettazione degli schemi del Circuito interlaboratorio “AQUA”. Per tutti i campioni è stata richiesta l’analisi mediante test di immunofluorescenza diretta (IF) come test gold standard per la diagnosi della rabbia (OIE, 2016). L’esito del test è qualitativo, inteso come positivo oppure negativo. È stato inoltre richiesto di assegnare, ad ogni campione identificato come positivo, un numero da 1 a 4 indicante la quantità (proporzionalmente crescente) di reazione di immunofluorescenza specifica osservata, assumendo come riferimento il controllo positivo con reazione pari a 3-4. La prova di valutazione quantitativa dell’antigene virale non è stata considerata ai fini della determinazione dell’esito (favorevole o meno) della prova per ciascun laboratorio, ma solo a titolo informativo. Inoltre, i laboratori che utilizzano (ovvero sono stati formati per) l’isolamento su colture cellulari del virus della rabbia (RTCIT) (OIE, 2016) come metodica di conferma diagnostica, sono stati invitati a partecipare al circuito, analizzando i campioni presenti nel pannello anche mediante RTCIT. L’invio dei pannelli è avvenuto per 7/8 laboratori il 29 maggio 2017, con termine fissato per l’invio dei risultati a 30 giorni dalla ricezione del pannello. La conferma di ricezione e integrità del pannello è stata inviata da tutti i laboratori all’ente organizzatore entro 2 giorni dall’invio. Contestualmente all’invio dei campioni, ciascun laboratorio partecipante è stato invitato a visionare e/o compilare la seguente documentazione disponibile in AQUAweb:

Modulo di conferma della ricezione del pannello

Istruzioni per la corretta procedura di analisi e conservazione dei liofilizzati

Copia non controllata della procedura di prova per la diagnosi della rabbia mediante test di immunofluorescenza diretta

TABELLA 2. CEPPI VIRALI PRESENTI NEL PANNELLO DELLO SCHEMA RV-D 1-17. Ceppo Specie Lineaggio/sublineaggio

Challenge Virus Standard 11 (CVS-11) RABV Non applicabile

Italy/red fox/V140/2010 RABV Cosmopolita/Western Europe

Botswana/honey dog/BNVL2009-3580/V5493-2010 RABV Cosmopolita/ex-Africa 1

BBLV/France/bat(Myotis nattereri)/129700-2012 BBLV Non applicabile

EBLV2/UK/bat(Myotis daubentonii)/RV1332-2002 EBLV-2 A

Niger/dog/105-251-2007/V6097-2007 RABV Africa 2

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Analisi della concordanza e criteri di accettabilità

Identificazione qualitativa dell’antigene virale ed isolamento virale

Per ogni laboratorio partecipante è stata calcolata la statistica K di Cohen, che indica il grado di accordo tra i risultati forniti dal laboratorio in esame e gli esiti attesi, fornendo una valutazione individuale di performance. La statistica K è stata anche calcolata per valutare il grado di accordo tra i laboratori partecipanti, fornendo in questo modo una valutazione di performance dell’intero circuito. Tale calcolo è stato eseguito sugli esiti qualitativi ottenuti mediante IF e RTCIT per i laboratori in grado di effettuare quest’ultima analisi. A scopo interpretativo della statistica K, si suggerisce l’utilizzo della scala di Landis & Koch così strutturata:

K Concordanza

0 Scarsissima

0.01-0.20 Scarsa

0.21-0.40 Discreta

0.41-0.60 Moderata

0.61-0.80 Buona

0.81-1.00 Ottima

CRITERI DI ACCETTABILITÀ

La prestazione dei laboratori che abbiano raggiunto almeno una concordanza BUONA (K=0,61-0,80) è ritenuta ACCETTABILE per il circuito RV-D 1-17.

Tuttavia, indipendentemente dal valore di concordanza ottenuto, l’esito del circuito è

considerato NON FAVOREVOLE per quei laboratori che abbiano fallito nell’identificazione di almeno un campione positivo (presenza di uno o più FALSI NEGATIVI), considerata la rilevanza in termini di sanità pubblica della mancata

identificazione di un caso di rabbia.

6

Valutazione quantitativa dell’antigene virale I risultati di quantificazione dell’antigene virale mediante test IF sono stati utilizzati per calcolare la statistica K di Cohen pesata, al fine di valutare il grado di accordo tra i risultati forniti dal laboratorio e gli esiti attesi (come valutazione individuale di prestazione). E’ stata inoltre calcolata la statistica K per valutare il grado di accordo nella quantificazione del segnale tra i laboratori partecipanti al circuito, dando così una valutazione di performance dell’intero circuito. La determinazione dei pesi per il calcolo della statistica K è stata condotta come segue:

1) Risposta corretta al 100% nel caso di intensità di IF riportata pari a:

1 o 2 per i campioni che prevedevano un segnale compreso tra 1-2

2 o 3 per i campioni che prevedevano un segnale compreso tra 2-3

3 o 4 per i campioni che prevedevano un segnale compreso tra 3-4

0 per i campioni negativi

2) Risposta corretta all’ 80% nel caso di intensità di IF riportata pari a:

3 per i campioni che prevedevano un segnale compreso tra 1-2

1 o 4 per i campioni che prevedevano un segnale compreso tra 2-3

2 per i campioni che prevedevano un segnale compreso tra 3-4

3) Risposta errata in tutti gli altri casi.

Risultati

Emissione report individuale Un report individuale contenente informazioni sull’esito della prova di ciascun laboratorio partecipante e sulla performance individuale (K e K pesata) e stato inviato ai singoli laboratori mediante AQUAweb.

Risultati ottenuti mediante metodica IF

Nel circuito 2017, sette degli otto laboratori partecipanti sono stati in grado di identificare correttamente tutti i campioni diagnostici come positivi oppure negativi mediante IF. Un laboratorio ha ottenuto un esito non corretto nell’identificazione dell’antigene per un solo campione (falso positivo).

I risultati complessivi della prova di IF sono riportati nella TABELLA 3. I risultati errati (non

corretta identificazione di un campione e/o non corretta quantificazione dell’antigene virale) sono evidenziati in rosso.

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TABELLA 3. TEST DI IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA: IDENTIFICAZIONE E VALUTAZIONE QUANTITATIVA DELL’ANTIGENE VIRALE.

Identificativo Laboratorio

L0

00

39

6

L0

00

43

8

L0

00

45

6

L0

00

54

5

L0

00

54

9

L0

00

63

3

L0

00

63

5

L0

00

63

6

Identificativo Campione

Ide

nti

fica

zio

ne

Qu

an

tifi

cazio

ne

Ide

nti

fica

zio

ne

Qu

an

tifi

cazio

ne

Ide

nti

fica

zio

ne

Qu

an

tifi

cazio

ne

Ide

nti

fica

zio

ne

Qu

an

tifi

cazio

ne

Ide

nti

fica

zio

ne

Qu

an

tifi

cazio

ne

Ide

nti

fica

zio

ne

Qu

an

tifi

cazio

ne

Ide

nti

fica

zio

ne

Qu

an

tifi

cazio

ne

Ide

nti

fica

zio

ne

Qu

an

tifi

cazio

ne

C1 P 4 N 0 P 4 P 4 P 1 P 4 P 2 P 3

C2 P 2 P 2 N 0 P 2 P 4 N 0 P 3 P 4

C3 N 0 P 4 P 3 N 0 N 0 P 4 P 3 N 0

C4 P 3 N 0 P 2 P 1 P 2 P 3 P 2 P 3

C5 P 4 P 4 P 3 P 4 N 0 N 0 N 0 N 0

C6 N 0 P 1 P 1 P 2 P 3 N 0 P 4 P 1

C7 N 0 P 2 P 2 N 0 P 3 P 4 P 2 N 0

C8 P 3 N 0 P 3 N 0 P 1 P 3 N 0 P 2

C9 P 4 N 0 P 1 P 4 N 0 P 4 N 0 P 3

C10 P 3 P 4 N 0 P 1 P 4 P 2 N 0 N 0

C11 N 0 P 3 P 2 P 4 N 0 P 2 P 3 P 4

C12 P 1 P 2 N 0 N 0 P 3 P 3 P 3 P 2

C13 P 2 P 4 P 4 P 4 P 2 N 0 P 4 P 3

C- N 0 N 0 N 0 N 0 N 0 N 0 N 0 N 0

C+ P 4 P 4 P 4 P 4 P 3 P 4 P 4 P 4

I risultati evidenziati in giallo e in arancione indicano, rispettivamente, una risposta corretta all’80% e una risposta errata nell’ambito della valutazione quantitativa. Le risposte evidenziate in rosso indicano una non corretta identificazione dell’antigene virale.

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Il valore di K ottenuto nella prova di identificazione dell’antigene virale mediante IF per ciascun laboratorio, quello complessivo tra tutti i laboratori partecipanti e i relativi livelli di significatività (p)

sono riportati in TABELLA 4.

La statistica K calcolata per valutare le prestazioni di ogni laboratorio indica che 7 su 8 laboratori partecipanti hanno mostrato "ottima" concordanza, 1 laboratorio ha ottenuto concordanza “buona”. Considerando i dati complessivi di tutti i laboratori, il valore di concordanza dell’intero circuito è

risultato pari a 0,9620 (p=0,000) classificata come “ottima” (TABELLA 4 e FIGURA 1).

TABELLA 4. IDENTIFICAZIONE DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA E P.

Lab

ora

tori

o

L0003

96

L0004

38

L0004

56

L0005

45

L0005

49

L0006

33

L0006

35

L0006

36

Co

mp

lessiv

o

Kappa 1,0000 1,0000 0,8421 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9620

p 0,0001 0,0001 0,0005 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0000

FIGURA 1. IDENTIFICAZIONE DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA DEI LABORATORI PARTECIPANTI

E KAPPA COMPLESSIVO.

9

La statistica K pesata, calcolata per valutare la performance di ogni laboratorio nella valutazione quantitativa dell’antigene virale, indica che 6 su 8 laboratori partecipanti hanno ottenuto concordanza "ottima", ed i restanti 2 laboratori hanno ottenuto concordanza “buona”. Il valore di K ottenuto per ciascun laboratorio (determinato includendo anche la quantificazione indicata per i due controlli positivo e negativo), quello complessivo tra tutti i laboratori partecipanti e il relativo livello di significatività (p) sono riportati in Tabella 5. Considerando i dati di tutti i laboratori nella valutazione quantitativa dell’antigene, il valore di concordanza complessivo del circuito è risultato

pari a 0,8197 (p=0,000), classificata come “ottima” (TABELLA 5 e FIGURA 2).

TABELLA 5. VALUTAZIONE QUANTITATIVA DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA E P.

Lab

ora

tori

o

L0003

96

L0004

38

L0004

56

L0005

45

L0005

49

L0006

33

L0006

35

L0006

36

Co

mp

lessiv

o

Kappa 0,8394 0,9778 0,8647 1,0000 0,9778 0,9761 1,0000 1,0000 0,8197

p 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

FIGURA 2. VALUTAZIONE QUANTITATIVA DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA DEI LABORATORI

PARTECIPANTI E KAPPA COMPLESSIVO.

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Risultati ottenuti mediante metodica RTCIT

La statistica K calcolata per valutare la performance di ogni laboratorio nell’isolamento virale su coltura cellulare indica che ciascuno dei quattro laboratori partecipanti ha ottenuto concordanza “ottima” (p=0,0002) ed il valore di concordanza complessivo del circuito per tale metodica è

risultato pari a 1 (p=0,000) (Tabella 6 e Figura 3).

TABELLA 6. ISOLAMENTO DEL VIRUS RABBIA SU COLTURE CELLULARI: VALORI DI KAPPA E P.

Laboratorio L000636 L000545 L000549 L000438 Complessivo

Kappa 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

p 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002 0,0000

FIGURA 3. ISOLAMENTO DEL VIRUS DELLA RABBIA SU COLTURE CELLULARI: VALORI DI KAPPA DEI

LABORATORI PARTECIPANTI E KAPPA COMPLESSIVO.

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Confronto dei risultati precedenti, discussioni e raccomandazioni I risultati del circuito RV-D 1-17 dimostrano un complessivo miglioramento delle performance diagnostiche a livello nazionale rispetto agli anni precedenti. In particolare, i laboratori afferenti hanno dimostrato nel complesso un ottimo grado di accordo per l’identificazione e per la

quantificazione dell’antigene virale mediante prova di immunofluorescenza diretta (FIGURA 4).

L’unico caso di incorretta identificazione dell’antigene virale registrata nel circuito RV-D 1-17 riguarda un campione negativo, recante colorazione gialla aspecifica, ed identificato erroneamente come positivo. Tale risultato potrebbe derivare da molteplici fattori, quali ad esempio, la scarsa esperienza degli operatori nell’interpretazione della prova, la contaminazione crociata dei campioni, oppure l’erronea identificazione degli stessi al momento dell’apertura del pannello. I pochi casi di incorretta quantificazione dell’antigene virale sono relativi a ceppi virali RABV di origine extra-europea (lineaggio Cosmopolita - exAfrica 1 e lineaggio Africa 2) ovvero a lyssavirus rabbia correlati (BBLV ed EBLV-2).

FIGURA 4. IDENTIFICAZIONE E VALUTAZIONE QUANTITATIVA DELL’ANTIGENE VIRALE: VALORI DI KAPPA

COMPLESSIVI 2015-2017.

Per quanto riguarda la metodica di conferma di isolamento su colture cellulari (RTCIT), anche quest’anno i laboratori partecipanti hanno ottenuto ottimo grado di accordo. Inoltre, la partecipazione al circuito per tale metodica da parte di un nuovo laboratorio rappresenta un successo importante nell’armonizzazione della diagnosi della rabbia animale a livello nazionale. A questo proposito si ribadisce che la conferma diagnostica del risultato ottenuto mediante immunofluorescenza diretta è necessaria in tutti i casi di esposizione dell’uomo confermata o sospetta. Benché la metodica raccomandata per la conferma diagnostica sia l’isolamento su

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colture cellulari (RTCIT), allo stato attuale solo 4 degli 8 laboratori partecipanti al circuito sono in grado di effettuare tale metodica. Nella prospettiva del rimpiazzo degli animali da sperimentazione a favore dell’utilizzo di metodiche in vitro, risulta ormai imperativo l’abbandono del test di inoculazione intracerebrale nel topo (MIT), tuttora eseguito presso due laboratori della rete degli II.ZZ.SS., a favore della metodica RTCIT.

Relativamente alla protezione del personale di laboratorio, ai sensi del D. Lvo 81/2008, si ricorda

l’obbligo di ciascun ente di assicurare la protezione e la prevenzione del personale, nella fattispecie

la vaccinazione antirabbica pre-esposizione e la relativa valutazione semestrale della risposta

anticorpale di tutto il personale coinvolto. Il CRN è disponibile a supportare ed assicurare la

sicurezza degli operatori mediante detta valutazione anticorpale.

Riferimenti bibliografici Decreto Legislativo n. 81 del 9 aprile 2008. Testo Unico in materia di salute e sicurezza sul lavoro. Gazzetta Ufficiale n. 101 del 30 aprile 2008 - Suppl. Ordinario n. 108. Evans JS, Horton DL, Easton AJ, Fooks AR, Banyard AC. Rabies virus vaccines: is there a need for a pan-lyssavirus vaccine? Vaccine. 2012 Dec 14;30(52):7447-54. doi:10.1016/j.vaccine.2012. 10.015. Review. OIE 2016. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Chapter 2.1.17. Rabies.