L.S. in Scienze e tecnologie alimentariAnno Accademico 2008/2009

Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli

alimenti (7 CFU)Modulo di:

Chimica analitica strumentale (4 CFU)Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)

(CAS-4a)Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)FASE MOBILE: liquidoIl potere analitico della LC attuale deriva dalla varietà delle proprietà di un grande assortimento di fasi mobili (solventi) e di fasi stazionarie, ma anche dall’ampia disponibilità di rivelatori. Le tipologie di cromatografia liquida sono classificate secondo il tipo di interazione che si realizza tra la fase stazionaria e i soluti presenti nella fase mobile, anche se sovente la natura dell’interazione è molteplice.• CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO (LSC)

FASE STAZIONARIA: solido poroso più polare e fase mobile meno polare• CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE IN FASE INVERSA (RPC) FASE STAZIONARIA: liquido meno polare e fase mobile più polare• CROMATOGRAFIA DI SCANBIO IONICO (IEC) FASE STAZIONARIA: liquido con gruppi ionici legati e fase mobile ionica• CROMATOGRAFIA A ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC) FASE STAZIONARIA: solido poroso e fase mobile con funzione solvente Gior

gio

Bona

ga

La cromatografia liquida attuale è fondamentalmente HPLC (High Performance Liquid Chomatography) in tutte le varianti dei metodi di separazione. Essa offre una serie di vantaggi rispetto la cromatografia classica su colonna:• utilizza colonne di piccolo diametro (1-5 mm contro 1-4 cm)• le colonne sono riempite con particelle molto piccole (3-10 m)• può contare sul grande sviluppo di nuove fasi stazionarie• può sopportare pressioni molto elevate (fino a oltre 1000 atm)• consente il minuzioso controllo del flusso della fase mobile • può disporre di rivelatori on line di elevata sensibilità• offre una strumentazione standardizzata ed automatizzata• consente una grande riduzione dei tempi di analisi• offre una elevata risoluzione e una notevole sensibilità analitica

L’HPLC può operare a composizione costante della fase mobile (eluizione isocratica) o con miscele di solventi di diversa polarità miscibili in tutte le proporzioni e in rapporti che possono essere variati secondo un programma (eluizione a gradiente). Quest’ultima modalità produce separazioni più efficienti e tempi di analisi inferiori.

Lo strumento della cromatografia liquida (HPLC) è il cromatografo liquido, le cui parti essenziali sono:

1. serbatoi dei solventi2. filtro3. pompa e valvola dosatrice4. regolatore della pressione (flusso)5. sistema di introduzione del campione (injector)6. precolonna (guard colunn)7. colonna cromatografica (analytical column)8. rivelatore (detector)

Giorgio Bonaga

detector

comparto termostatizzato

registratore.detector

precolonna

colonna(fase fissa)

Giorgio Bonaga

injector

solvente A

pompa reciprocante

filtro

solvente B

camera dimiscelazione

(fase mobile)

detector

comparto termostatizzato

registratore.

valvola dosatrice

filtro

detector

solvente A solvente B

precolonna

colonna(fase fissa)

camera dimiscelazione

(fase mobile)

Giorgio Bonaga

pompa reciprocante

injector

LE VARIABILI DELLA LCNella cromatografia liquida, analogamente alle altre tecniche analitiche, si deve operare una scelta delle variabili del sistema, sulla base delle caratteristiche del campione da analizzare. Nella LC le variabili sono:1. SERBATOI DEL SOLVENTE2. POMPE (pneumatiche, a siringa, reciprocanti) E VALVOLE DOSATRICI3. SISTEMI DI INIEZIONE (con setto, a valvola)4. COLONNE E FASI STAZIONARIE 5. RIVELATORI (RID, UV, FD, ED)6. TECNICHE DI SEPARAZIONE LC (LSC, LLC, RPC, SEC, IEC)

Gli argomenti verranno trattati in riferimento alla cromatografia liquida tradizionale, perché gli ultimi sviluppi di questa tecnica (detti “Fast LC”, e “Extreme LC”) verranno illustrati separatamente.

Giorgio Bonaga

1. SERBATOI DEI SOLVENTISono contenitori della capacità di 500 ml od anche maggiore. Per evitare la dissoluzione dei gas (N2 e O2) nei solventi che, formando delle bolle, può “disturbare” (rumore di fondo) il sistema di rivelazione dei soluti, ma danneggiare anche il rivelatore (RID), è buona pratica degasare i solventi:• per riscaldamento dei serbatoi che li contengono e utilizzando eventualmente una pompa da vuoto per eliminare i gas;• facendo gorgogliare nei solventi un gas inerte a bassa solubilità (Ar);I cromatografi HPLC attuali non dispongono del sistema di degasamento dei solventi perché l’iniettore, la precolonna e la colonna sono sotto alte pressioni (anche oltre le 1000 atm). Un’altra precauzione è la filtrazione dei solventi per trattenere particelle sospese di cui anche i solventi più puri sono contaminati. Tra i serbatoi dei solventi e la pompa si dispongono dei filtri di acciaio sinterizzato (trattato per ridurre al minimo la porosità) con pori di circa 1 m, che vanno settimanalmente ripuliti in un bagno di ultrasuoni.

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

2. POMPE E VALVOLE DOSARICIa. POMPELe pompe impiegate nei cromatografi HPLC devono soddisfare alcuni requisiti:1. il flusso del sovente deve essere costante, non pulsato, per evitare un segnale di fondo del rivelatore (RID e ED, in misura molto minore anche FD e DAD) non riproducibile. Anche la pressione applicata non deve fluttuare. I flussi comuni sono compresi nell’intervallo 1,0-2,0 ml/min;2. il sistema deve poter operare anche a pressioni molto alte (fino a 15000 psi, pari a oltre 1000 atm), per consentire l’utilizzazione di colonne da LC molto lunghe (fino a 100 cm);3. le pompe non devono produrre un segnale di fondo apprezzabile;4. il materiale della pompa deve essere chimicamente inerte;5. le pompe devono essere di uso semplice.

Giorgio Bonaga

POMPA PNEUMATICAIl solvente si trova in una camera, separato dal gas di spinta da un pistone mobile. L’aumento della pressione del gas di spinta produce la compressione del solvente da parte del pistone e la sua immissione nel circuito della fase mobile. Queste pompe garantiscono un flusso costante, regolato dalla pressione del gas di spinta, ma la pressione costante è anche un parametro invariabile e dunque un limite. Un secondo limite è rappresentato dalla necessità di riempimento periodico della camera del solvente.

gas di spinta

camera delsolvente

pistone

Giorgio Bonaga

POMPA A SIRINGAUn motore asincrono aziona una vite senza fine, la vite muove un pistone che comprime il cilindro della fase mobile.

uscitasolvente

riservasolvente

motoresincrono

avanzamentomanuale

leva diblocco

motoresincrono

Giorgio Bonaga

valvolaunidirezionale

flusso totale

camma

POMPA ALTERNATIVA RECIPROCANTEÈ l’accoppiamento a 180° di due pompe a pistone comandate dalla stessa camma, in modo da ridurre al minimo il flusso pulsato (flusso smorzato). Le valvole a flusso unidirezionale consentono il caricamento delle camere del solvente e il loro svuotamento in modo alternato, in modo da ottenere un flusso di solvente quasi costante.

ingresso solvente Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

VALVOLA DI FLUSSO UNIDIREZIONALE

Giorgio Bonaga

pompa Bpompa A

Giorgio Bonaga

flusso “smorzato”

%A %B %C Flow Rate Pressure(H2O) (MeOH) (ml/min) (atm.)

Ready

pompa ternaria

dai serbatoi del solvente

al detector

alla colonna

smorzatoredi impulsi

all’injector

caricamento

iniezionerheodyne

injector

colonna

Giorgio Bonaga

b. VALVOLE DOSATRICIMISCELAZIONE AD ALTA PRESSIONESi impiega una pompa reciprocante per ogni solvente, con il controllo elettronico del numero di impulsi in funzione della composizione della fase mobile. La mandata della pompa è collegata alla camera di miscelazione.MISCELAZIONE A BASSA PRESSIONEI serbatoi dei solventi sono collegati a valvole dosatrici a tempo che prelevano i solventi e li immettono nella camera di miscelazione. Dalla camera di miscelazione la fase mobile viene inviata ad un’unica pompa reciprocante che ne determina il flusso (il minore volume morto consente la regolazione fine del gradiente).

valvola dosatrice

Giorgio Bonaga

3. SISTEMI DI INIEZIONE LC

Nella HPLC l’iniettore è un sistema delicato, perché deve consentire di portare il campione liquido dalla pressione atmosferica alla pressione più comune in testa alla colonna, pari a circa 1500 psi (100 atm), senza alterare il flusso della fase mobile.I principali sistemi di iniezione sono:

1. iniettore dinamico provvisto di setto 2. iniettore a valvola

1. INIETTORE DINAMICOÈ dotato di un setto elastico (di silicone, ma di piccolo diametro) che viene forato dalla microsiringa, il cui ago alloggia in un tubo nel quale viene a contatto diretto con la fase mobile, che trascina i soluti in testa alla colonna.

Giorgio Bonaga

fasemobile

setto

colonna

puliziadel setto

INIETTORE DINAMICO CON SETTO

Giorgio Bonaga

2. INIETTORE A VALVOLA (microsample injector valve)Consente l’introduzione del campione senza interruzioni significative di flusso. È dotato di tubi capillari di acciaio montati su un disco metallico rotante su un perno. L’immissione del campione in colonna avviene in due fasi:

a) CARICAMENTOil campione viene introdotto con un una siringa in un capillare (sample loop) a volume tarato (10, 20, 50, 100 l) non inserito nel circuito della fase mobile e collegato al capillare di spurgo.

b) INIEZIONE quando il campione iniettato emerge dal capillare di spurgo, si

ruota la valvola e i collegamenti dei capillari cambiano: il sample loop entra in serie con il circuito della fase mobile e il campione che lo riempe viene “spinto” nella colonna senza interruzione del flusso della fase mobile. Il volume di campione iniettato non dipende dal volume della

siringa, ma dal volume del sample loop. Giorgio Bonaga

INIETTORE A VALVOLAa) CARICAMENTO (4-3/1-2-5-6)

scarico

campione

fasemobile

sampleloop

Giorgio Bonaga

scarico

campione

fasemobile

sampleloop

b) INIEZIONE (1-6/4-5-2-3)

colonnacolonna

12

45

3

6

54

3

2

6

1

VALVOLA CAMPIONATRICE(Microsample Injector Valve)

scarico

caricamentodel campione

fase mobile

alla colonna

loop del campione

Giorgio Bonaga

scarico

iniezionedel campione

alla colonna

fase mobile

loop del campione

RHEODYNE INJECTOR

Giorgio Bonaga

Colonna HPLC in acciaio: 250 mm x 4,6 mm i.d.

Colonna LC in vetro: 1000 mm x 50 mm i.d.

TIPO DICOLONNA

LUNGHEZZA(mm)

DIAMETRO INTERNO

(mm)

FLUSSO DI LAVORO(ml/min)

capillare 150 0,32 0,001microbore 150 1,0 0,02analitica 250 4,6 0,5

semipreparativa 250 10 5,0

preparativa 250 20 10,0

4. COLONNE E FASI STAZIONARIELe fasi stazionarie verranno dettagliatamente trattate in associazione con le tecniche di separazione LC.

Gior

gio

Bona

ga

COLONNA E FASE LC CLASSICA HPLCCOLONNALunghezza (mm)Diametro interno (mm)

500-200020-50

250 (analitica) 4,6 (analitica)

FASE STAZIONARIAForma Dimensione (m)Tipo Strato pellicolare (m)

regolare150

a corpo poroso-

regolare10-40

pellicolare1-2

irregolare3-60

a corpo poroso-

3-10 m

Gior

gio

Bona

ga

40-60 m40 mstrato: 2 m

10 mstrato: 1 m

150 m

Giorgio Bonaga

particella regolare di silice porosa

5. RIVELATORI PER LCSi distinguono in:1. Bulk property detectors (BPD): sono quelli sensibili a proprietà

specifiche dell’insieme soluto/solvente (RID)2. Solute property detectors (SPD): sono quelli sensibili a proprietà

specifiche soltanto del soluto (FD, UVD, ED)

1. Il segnale S di un bulk property detector è proporzionale al flusso di massa del soluto (m/t) e dipende da una costante km caratteristica del rivelatore:

Moltiplicando numeratore e denominatore per il volume V di fase mobile:

S = km

mt

Ma m/V = C (concentrazione del soluto) e V/t = F (flusso della fase mobile), pertanto:

V . tS = km

m . V

S = kmC . F

Giorgio Bonaga

Il segnale in uscita è proporzionale al prodotto della concentrazione del soluto per il flusso della fase mobile che, proprio per questo motivo, deve essere mantenuto costante.A flusso costante l’area del picco cromatografico (approssimata all’area del triangolo di base = t e altezza = S) è:

cioè proporzionale alla quantità assoluta del soluto.

2. Il segnale S di un solute property detector è proporzionale alla concentrazione (m/V) e dipende da una costante kc caratteristica del rivelatore: S = kc

mV

Moltiplicando numeratore e denominatore per t :

V . tS = kc

t . m

A = km. m1

2

Giorgio Bonaga

L’area del picco cromatografico (approssimata all’area del triangolo di base = t e altezza = S) è:

Ma t/V = 1/F (reciproco del flusso della fase mobile), pertanto:

F . tS = kc

1 . m

cioè inversamente proporzionale al flusso della fase mobile.

mF

altezza del picco proporzionale al flusso della fase mobileBPD

area del picco indipendente dal flusso della fase mobile

altezza del picco indipendente dal flusso della fase mobileSPD

area del picco inversamente proporzionale al flusso della fase mobile

S . t = 2A = kc

mF

A = kc. 1

2

Giorgio Bonaga

CARATTERISTICHE IDEALI DEI RIVELATORI PER LCIl detector ideale dovrebbe avere le seguenti caratteristiche:1. minima deriva della linea di base (drifting)2. minimo rumore di fondo (noise)3. elevata selettività, sensibilità e riproducibilità4. risposta rapida, come tutti i rivelatori “on line”

5. ampio range dinamico: R= k . C (105)6. minimo volume morto della cella a flusso per evitare l’allargamento dei

picchi7. non produrre il rimescolamento dei soluti nella cella a flusso8. non essere sensibile alla variazione di composizione della fase mobile

(cioè deve consentire l’eluizione a gradiente), alla temperatura e al flusso della fase mobile

9. non essere distruttivo

rumoredi fondo

deriva

Giorgio Bonaga

CELLE A FLUSSOÈ un componente critico della strumentazione HPLC perché deve possedere un volume morto molto piccolo, dal momento che il volume determina l’ampiezza della base del picco del soluto in termini di tempo. Pertanto, per separare due soluti occorre che essi abbiano tempi di ritenzione almeno uguali al tempo necessario perché fluisca dalla cella il volume occupato dal soluto che eluisce per primo.

Cella di tipo Z la lunghezza è al massimo di 10 mm (1000 m) e il diametro del cilindro da 10 a 16 m, per un volume morto molto piccolo, pari a 3-8 l. Il percorso della fase mobile è lungo la direzione del raggio luminoso.

Cella conica nell’eluizione a gradiente, la variazione della composizione della fase mobile determina una sensibile variazione dell’indice di rifrazione (RI), indipendentemente dalla presenza di soluti nella fase mobile. La cella conica ha una sezione che si allarga nella direzione del fascio luminoso, trasformando il gradiente di indice di rifrazione in una lente liquida convessa (convergente) che riallinea il fascio luminoso.

Giorgio Bonaga

CELLA A FLUSSO TIPO ZZ type cell

CELLA A FLUSSO CONICAtapered type cell

lentedi quarzo

entrata fase mobile

entrata fase mobile

uscita fase mobile

uscita fase mobile

lenteliquida

poliammide

corpodi Al

Giorgio Bonaga

sorgente

sorgente

tVc < tRB

tVc < tRB

tVc > tRBA B

A B

A B

EFFETTI DELLA DIMENSIONE DELLA CELLA A FLUSSO SULLA RIVELAZIONE DEI SOLUTI

BB

Giorgio Bonaga

RIVELATORE A INDICE DI RIFRAZIONE (RID)L'indice di rifrazione di un materiale è un parametro macroscopico, solitamente indicato col simbolo “n”, che rappresenta il fattore numerico (vettore d’onda) per effetto del quale la velocità di propagazione di una radiazione elettromagnetica (luce) viene rallentata, rispetto alla sua velocità nel vuoto, quando attraversa il materiale.

raggio incidente

raggio

rifless

o ( =

)

raggio rifratto

aria: n1 = 1vetro: n2 = 1,5

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

TEORIA CORPUSCOLARE: variazione della velocità dei fotoni (Newton)

LA VELOCITA’ DELLA LUCE E’ MAGGIORE NEI MEZZI PIU’ RIFRANGENTI

fotone

Giorgio Bonaga

TEORIA ONDULATORIA: variazione della velocità dell’onda nelle due fasi

LA VELOCITA’ DELLA LUCE E’ MAGGIORE NEI MEZZI MENO RIFRANGENTI

A

B

Dalle equazioni di Maxwell si può scrivere che:

n = c/vdove:n = indice di rifrazionec = velocità della lucev = velocità di fase

Si può verificare che nell’aria (dove v = c): n = 1

Dall’ equazione di Maxwell si ottiene la Legge di Snell:

sin . n1 = sin . n2 (sin/sin = n2/n1)

Se, ad es., l’angolo di incidenza () del raggio di luce su una superficie di vetro è di 40°, l’angolo del raggio rifratto () è:

sin 40° . 1,0 = sin . 1,5 = 25,018°

(http://ww2.unime.it/weblab/ita/RefractionOfLight/lightrefract_ita.htm)

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

MATERIALE RIVuoto 1,00000Aria (760 mm/Hg) 1,00029Ghiaccio 1,31Acqua (20° C) 1,33Acetone 1,36Alcol etilico 1,36Soluzione zuccherina (30%) 1,38

Quarzo fuso 1,46Glicerina 1,47Soluzione zuccherina (80%) 1,49

Vetro “crown” 1,52Cloruro si sodio 1,54Disolfuro di carbonio 1,63Ioduro di metilene 1,74

SOLUZIONE RI

H2O (100) 1,330

H2O: EtOH (75:25) 1,337

H2O: EtOH (50:50) 1,345

H2O: EtOH (25:75) 1,352EtOH (100) 1.360

Il RID interferenziale misura in continuo la differenza di indice di rifrazione tra la la fase mobile pura e la fase mobile che contiene i soluti. Il fascio prodotto da una sorgente di radiazione visibile viene diviso in due raggi rifratti da un prisma polarizzatore; i due raggi attraversano due celle a flusso contenenti solo la fase mobile pura. All’uscita dalle celle i due raggi vengono ricomposti da un prisma ricompositore del fascio e collimati su un fotomoltiplicatore che misura l’intensità della radiazione (linea di base). Quando la fase mobile trasporta un soluto si avrà una variazione dell’indice di rifrazione (minore o maggiore) a cui corrisponderà una variazione (diminuzione o aumento) della velocità della luce del raggio che attraversa la cella del campione. Questa modificazione produrrà uno sfasamento dei due raggi, tanto maggiore quanto maggiore è la differenza dell’indice di rifrazione. Nella ricombinazione dei due raggi sfasati si ha un’interferenza distruttiva proporzionale alla differenza di velocità, cioè alla concentrazione del soluto. La riduzione di intensità viene misurata dal fotomoltiplicatore ed inviata al registratore che la traduce in un picco. Il rifrattometro richiede la termostatizzazione della fase mobile, perché l’indice di rifrazione dipende dalla temperatura e le variazioni di temperatura produrrebbero la deriva della linea di base. Il rifrattometro è anche incompatibile con una eluizione a gradiente, perché la variazione della composizione della fase mobile produce delle grandi variazioni dell’indice di rifrazione.

Giorgio Bonaga

campione

fase mobile

prisma polarizzatore

del fascio

prisma ricompositore

del fascioSorgenteVIS

lente lente fotomoltiplicatore

registratore

RIFRATTOMETRO INTERFERENZIALE

Giorgio Bonaga

picchi positivi: aumento dell’indice di rifrazione per effetto di soluti con indici di rifrazione maggiori di quello della fase mobile

picchi negativi: diminuzione dell’indice di rifrazione per effetto di soluti con indici di rifrazione minori di quello della fase mobile

HPLC DI ZUCCHERI E POLIALCOLICON RIVELATORE RIFRATTOMETRICO

Giorgio Bonaga

inie

zione

0 7,5 15 min

sacc

aros

io

gluc

osio ga

latto

siofru

ttosio m

anni

tolo

sorb

itolo

RIVELATORE A FLUORESCENZA (FD)La fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze eccitate da una radiazione di una certa energia (o) di emettere radiazioni di energia inferiore (cioè di più elevata).E

E0

E1

E2

01234

01234

01234

01234

01234

01234

01234

01234

01234

ASSORBIMENTOMOLECOLARE

RILASSAMENTONON RADIOATTIVO

RILASSAMENTODI FLUORESCENZA

rilas

sam

ento

vib

razio

nale

conversione internabanda 1 banda 2

Giorgio Bonaga

Per tutte le molecole si può definire il rendimento quantico di fluorescenza ():

= RfRf + Rnr

con: Rf = velocità di rilassamento flurescente

Rnr = velocità di rilassamento non radioattivo

Per la maggior parte delle molecole Rnr >> Rf per cui ≈ 0Alcune sostanze danno luogo a fluorescenza naturale, ma è possibile formare derivati altamente fluorescenti mediante reazioni di derivatizzazione, prima dell’introduzione nel cromatografo. Tra i numerosi reagenti è molto comune il dansil-cloruro nell’analisi di ammine e amminoacidi. N

H3C CH3

SO O

+ +- -N

HCR

HCOOHCl

H

Giorgio Bonaga

SOSTANZE NATURALMENTE FLUOSCENTI

sostanza formula(nm)

eccitazione emissione

intensitàrelativa

benzene C6H6 270 310 10 (rifer.)toluene C6H5 - CH3 270 320 17propilbenzene C6H5 - C3H7 270 320 17fluorobenzene C6H5 - F 270 320 10clorobenzene C6H5 - Cl 275 345 7bromobenzene C6H5 - Br 290 380 5iodobenzene C6H5 - I - - 0fenolo C6H5 - OH 285 365 18ione fenato C6H5 – O - 310 400 10anisolo C6H5 - OCH3 285 345 20anilina C6H5 - NH2 210 405 20ione anilinio C6H5 -+NH3 - - 0acido benzoico C6H5 - COOH 310 390 3benzonitrile C6H5 - CN 280 360 20nitrobenzene C6H5 - NO2 - - 0

Giorgio Bonaga

300 350 400

300 350 400

eccitazione (nm)

emissione (nm)

inte

nsità

di

flu

ores

cenz

a

È intuitivo che lo spettro di eccitazione (lunghezze d’onda delle radiazioni assorbite) delle sostanze fluorescenti è circa uguale al loro spettro di emissione (lunghezze d’onda delle radiazioni fluorescenti)

Giorgio Bonaga

I fluorimetri misurano la fluorescenza dei soluti presenti nella fase mobile che sono attivi a questo rilassamento.Il fluorimetro a semisfera riflettente raccoglie la metà della radiazione di fluorescenza emessa in un semispazio e dunque eleva notevolmente la sensibilità strumentale. Esso prevede un primo sistema ottico costituito da una sorgente (a deuterio) che emette delle radiazioni collimate e focalizzate su una combinazione di filtri. I filtri selezionano la della radiazione di eccitazione che viene focalizzata sulla cella a flusso. Le radiazioni di fluorescenza che vengono emesse vengono raccolte da una semisfera riflettente che le invia ad un secondo sistema ottico i cui filtri hanno il compito di selezionare la di emissione, trasformarla con il fotomoltiplicatore in un segnale la cui intensità è proporzionale alla concentrazione del soluto che l’ha prodotta ed infine, per mezzo di un registratore, in un picco.Il FD è ovviamente un rivelatore selettivo per soluti fluorescenti o capaci di fissare un gruppo che li rende fluorescenti. Ha una sensibilità dell’ordine di 10-12 g/ml (dunque particolarmente idoneo all’analisi di soluti presenti in tracce) e un range dinamico lineare effettivo di circa 103 (inferiore e quello teorico per effetto dello spegnimento della fluorescenza a causa di decadimenti non radiattivi o quenching). Giorgio Bonaga

IN

semisferariflettente

cella a flusso(5 l)

OUT sorgente

(D)

I° sistema otticoeccitazione)

II° sistema otticoemissione)

fotomoltiplicatore

RIVELATORE A FLUORESCENZA

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

I0 I

b

, C

RIVELATORE AD ASSORBIMENTO UV-VIS (UVD)Le radiazioni elettromagnetiche di specifiche che colpiscono le molecole trasferiscono energia ai loro gruppi funzionali (se cromofori) con eccitazioni elettroniche della configurazione elettronica (passaggio dallo stato fondamentale allo stato eccitato). L’assorbimento di parte dell’energia produce dunque una diminuzione dell’intensità della radiazione incidente. L’assorbimento delle radiazioni UV-VIS (VIS = 380-800 nm; UV = 210-380 nm; UV lontano = < 210 nm) è molto utilizzato nella HPLC di molecole organiche, proprio per la particolare configurazione elettronica dei loro gruppi funzionali.

Questa proprietà, detta assorbanza, è governata dalla Legge di Lambert-Beer (una legge limite, valida solo per soluzioni diluite, con C < 0,01 mol/l).

dove: A = assorbanzaI0 = intensità della radiazione incidenteI = intensità della radiazione trasmessa = assorbività molare (costante di ogni sostanza)b = cammino ottico della cella di misura (cm)C = concentrazione molare della sostanza

= log = b CI0 I

Giorgio Bonaga

Naturalmente solo le sostanze contenenti dei gruppi funzionali cromofori assorbono dellle caratteristiche del gruppo, con assorbività molari note.

gruppo funzionale cromoforo (nm)

aldeide - CHO 210, 280-300 1500; 11-18ammina - NH2 195 2800

aromatico: antracene benzene bifenile naftalene piridina

C6H6252; 375

184; 202; 255246

220; 275; 312174; 195; 251

199000-790046700; 6900;

17020000

80000; 4000; 3500

azide - C=N - 190 5000azo - N=N - 285-400 3-25bromuro - Br 208 300carbossilico - COOH 200-210 50-70chetone - C=O 195; 270-285 1000; 15-30disolfuro - S-S - 194; 255 5500; 400estere - COOR 205 50etere - O - 185 1000

Gior

gio

Bona

ga

insaturazione: alifatica aliciclica

210-230230-260

210003000-8000

insaturazione coniugata

- (C=C)3 –- (C=C)4 -- (C=C)5 -

260300330

3500052000

118000

insaturazione isolata: doppio legame triplo legame

- C=C –- C C -

190175-180

80006000

ioduri - I 260 400nitrato - ONO2 270 12

nitrile - C=N 160 -nitrito - ONO 220-230; 300-

4001000-2000; 10

nitro - NO2 210 forte

nitroso - NO 302 100ossima - NOH 190 5000solfone - SO2 180 -

solfossido - S - O 210 1500tiochetone - C=S 205 fortetioetere - S - 194; 215 4600; 1600tiolo - SH 195 1400

Gior

gio

Bona

ga

Per ottenere il risultato analitico è essenziale che le sostanze analizzate forniscano un assorbimento sufficiente e che i solventi impiegati come fase mobile non assorbano una quantità rilevante della radiazione UV utilizzata. È pertanto utile conoscere ledi “cut-off” dei principali solventi, ovvero la alla quale un solvente è trasparente solo per il 10% e per questo impedirebbe di misurare gli assorbimenti dei soluti.

solvente di cut off

solvente di cut off

acetato di etile 244 eptano 200acetone 330 esano 200acetonitrile 190 etere dietilico 220benzene 280 metanolo 205butan-2-olo 260 metil-i butilchetone 335carbonio tetracloruro

265 pentano 200

carbonio dicloruro 235 piridina 330cloroformio 245 propan-1-olo 210cicloesano 200 tetraidrofurano 210dimetilsolfossido 270 toluene 285diossano 215 o-Xilene 285Gi

orgi

o Bo

naga

I rivelatori UV utilizzati in HPLC possono essere a lunghezza d’onda fissa o a lunghezza d’onda variabile. I primi sono dotati di una lampada a vapori di mercurio che emette un’intensa radiazione a 254 nm, ma non possono essere utilizzati per rivelare sostanze che assorbono a < 254 nm ed hanno anche ridotta sensibilità. I secondi possono registrare lo spettro completo di assorbimento UV di qualsiasi soluto. Attualmente il più diffuso è il DAD (Diode Array Detector).Nel rivelatore a striscia di diodi (DAD), la sorgente VIS è una lampada alogena di tungsteno (380-800nm) e la sorgente UV è una lampada ad arco di deuterio (190-380 nm). Il fascio di luce policromatica, focalizzata da lenti acromatiche e da un filtro di olmio, attraversa la cella a flusso, preferibilmente conica per evitare le variazioni dell’indice di rifrazione della fase mobile nel caso di eluizione a gradiente. Il fascio di luce emergente viene focalizzato da una fenditura su un reticolo monocromatore che disperde la luce su una serie di fotodiodi (fino a 1024, per un range di = 190-950) collocati lungo una striscia (diode array). Ciascun fotodiodo misura l’intensità del segnale ad una certa ed è collegato con un calcolatore che memorizza, istante per istante, tutti i segnali di assorbanza forniti dai sensori della striscia di fotodiodi. Il DAD, dunque, fornisce lo spettro UV-VIS completo dei soluti che eluiscono dalla colonna.Giorgio Bonaga

campione

UV(D)

lentiacromatiche

RIVELATORE A STRISCIA DI DIODI(DAD = Diode Array Detector)

VIS(Tg)

filtrodi olmio

fenditura

reticolomonocromatore

Giorgio Bonaga

striscia di fotodiodi(diode array)

ABS AUFS RunTime EndTime 0.001 2.000 254 0.00 min 10.0 min

Ready

Giorgio Bonaga

ABS AUFS RunTime EndTime 0.001 2.000 254 0.00 min 10.0 min

Ready

Giorgio Bonaga

tiammina

solv

enti

Giorgio Bonaga

RIVELATORE ELETTROCHIMICO (ED)I rivelatori elettrochimici (amperometrici, polarografici, coulombometrici) sono utilizzati nella rivelazione di soluzioni ioniche o si soluzioni di elettroliti, cioè soluti presenti in forma ionica e suscettibili di essere ossidati o ridotti con facilità.1. Rivelatore conducimetrico: misura la conduttanza ( = 1/R, in Siemens) di soluzioni ioniche, direttamente proporzionale alla mobilità degli ioni in soluzione;2. Rivelatore amperometrico: misura l’ intensità (I = V/R, in Ampère) della corrente prodotta dalle reazioni di ossidazione o dalla reazioni di riduzione di soluzioni di elettroliti, direttamente proporzionale alla concentrazione dei soluti.. Durante le ossidazioni gli elettroni vengono trasferiti dal soluto all’elettrodo, durante le reazioni di riduzione gli elettroni si trasferiscono dall’elettrodo al soluto.

Giorgio Bonaga

eHCOO-

+ +_ _e Na+

AMPEROMETRIA CONDUCIMETRIA

Ox

Red

I rivelatori amperometrici, i più diffusi tra i rivelatori elettrochimici, si basano sul potenziale di un elettrodo di lavoro rispetto il potenziale di un elettrodo di riferimento. Si ha un passaggio di corrente quando dalla colonna eluisce una specie chimica che, depolarizzando l’elettrodo rispetto il potenziale impostato, rende possibile il processo di elettrolisi, di cui si misura l’intensità (I) della corrente prodotta. Il rivelatore elettrochimico amperometrico è costituito da 3 elettrodi (wall jet detector): un elettrodo di riferimento (RE = reference electrode), un elettrodo di lavoro di platino o di grafite (WE = work electrode) e un elettrodo ausiliario (CE = counter electrode). Si impone una d.d.p. tra WE e CE in modo che si possa determinare l’intensità della corrente prodotta dalla reazione red-ox di elettrolisi. La reazione red-ox dei soluti avviene ad un potenziale che permette, tramite un circuito potenziostatico, di mantenere costante il potenziale dell’elettrodo WE. L’elettrodo di riferimento serve a mantenere ad un valore prestabilito il potenziale dell’elettrodo WE. La fase mobile con i soluti lambisce l’elettrodo WE e si disperde radialmente. L’intensità della corrente di idrolisi è il segnale che produce il picco proporzionale alla concentrazione del soluto.La purezza dei solventi è molto importante perché la presenza di ossigeno, contaminanti metallici e alogeni può innalzare sensibilmente il disturbo di fondo e la deriva della linea di base.

Giorgio Bonaga

RIVELATORE ELETTROCHIMICO (AMPEROMETRICO)

elettrodoausiliario

(CE)

elettrododi lavoro

(WE)

elettrododi riferimento

(RE)

IN

OUT

filo di platino e pasta di grafite

Giorgio Bonaga

SOSTANZE SENSIBILI ALL’ EDOSSIDAZIONE RIDUZIONE

• ammine• composti eterociclici• diammine aromatiche• diidrossiderivati• fenoli• idroperossidi• mercaptani• ossime• perossidi• purine

• acidi• aldeidi• chetoni• composti aromatici alogenati• composti eterociclici• doppi legami coniugati• esteri• nitrili coniugati• nitrocomposti• ossime

André-Marie Ampère

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

RIVELATORE A LUCE DIFFUSA IN EVAPORAZIONE (Evaporative Light Scattering Detector = ELS)

L’eluato dalla colonna attraversa un nebulizzatore nel quale viene trasformato in un aerosol da un flusso di azoto o di aria. In un tubo termostatato avviene l’evaporazione del solvente e la formazione di una nube di soluto. Questa nube particellare viene attraversata da un raggio laser posto ortogonalmente e la diffusione della luce prodotta dai soluti viene rivelata da un fotodiodo al silicio.

Giorgio Bonaga

N2 o aria

colonna

nebulizzatore

camera dinebulizzazione

sifone

sorgentelaser

tubo dievaporazione(termostatato)

luce diffusa

fotodiodo(silicio)

Giorgio Bonaga

RIVELATORE GRANDEZZAMISURATA

SPECIFICITA’

LOD(*)

(grammi)

RANGE DINAMICOLINEARE

ad indice di rifrazione indice di rifrazione

universale 10-10 103

a fluorescenza fluorescenza selettivo 10-14 103

ad assorbimento UV-VIS assorbanza selettivo 10-11 104

elettrochimico (amperometro)

conduttanza selettivo 10-15 105

evaporative light scattering luce diffusa universale 10-12 105

spettrometro di massa massa/carica universale 10-12 105

PRESTAZIONI DEI RIVELATORI HPLC

(*) LOD = limit of detection (diverso da: LOQ = limit of quantification)

Giorgio Bonaga