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LM Sc.Biosanitarie Ricerca Diagnostica 2013-14

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Diagnosi Prenatale I

Lezione 15


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Diagnosi prenatale

fornire scelte informate alle coppie a rischiorassicurare e ridurre l’ansiapermettere a coppie ad alto rischio di confermare o smentire l’anomalia nel feto mediante il test, anziche’ rinunciare ad avere figlipermettere a coppie con un bambino affetto di avere una preparazione psicologica prima e dopo la nascitapermettere il trattamento prenatale del feto affetto

nata nel 1966 (Steele e Breg); richiede l’intervento di numerose discipline: ostetricia, ultrasonografia, genetica clinica, diagnosi e consulenza genetica e la diagnostica di laboratorio;

scopi:


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Indicazioni Diagnosi prenatale

Incidenza della trisomia 21

1. Eta’ materna avanzata


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Indicazioni Diagnosi prenatale2. un precedente bambino con un’anomalia cromosomica “de novo”

3. la presenza di anomalie cromosomiche di tipo strutturale in uno dei genitori

4. la presenza di una storia familiare per una malattia genetica che puo’ essere diagnosticata o esclusa mediante analisi biochimiche o del DNA

5. La presenza di una storia familiare per una malattia X-linked per la quale non esiste un test prenatale specifico

6. Il rischio dei difetti del tubo neurale

7. Lo screening del siero materno ed ecografia I e II trimestre (NT, nasal bone, CPC, EHF,SUA)


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Considerazione Importante!!!!!

Le diapositive che seguiranno trattano aspetti non genetici: sono teniche che attengono alla pratica medica, tuttavia mi sembra appropriato che li conosciate. Questo non vuol dire che siano l’aspetto piu’ importante o esaustivo …..ANZI!!!!


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Metodi “ostetrici”per la diagnosi prenatale

Tests invasivi:AmniocentesiEsame dei villi corialiCordocentesiDiagnostica genetica preimpianto

Tests non invasivi:Alfa-fetoproteina nel siero maternoScreening del siero maternoEcografiaIsolamento delle cellule fetali dal sangue materno


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Aspetti tecnici (sempre ostetrici) dell’amniocentesi

Esame ecografico preliminare per valutare le condizioni fetali,

il periodo gestazionale, il numero di feti, la normalita’ strutturale e la posizione ottimale per l’inserimento dell’ago

Epoca: tra la 15a e la 16a settimana di gestazione

(eccezionalmente tra la 10a e la 14a)

Esecuzione: ambulatoriale

Preparazione: nessuna

Aghi: 21-22 g (0,8-0,7 mm)

Via: transaddominale


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Complicazioni:LAumento dello 0.5-1% al di sopra del normale rischio del 2-3% di aborto

LRare perdite di liquido amniotico, infezioni e danni al feto causati dalla

puntura dell’ago

LL’amniocentesi precoce (10-14 settimane) ha un rischio d’aborto del 2,6%

contro lo 0,8 dell’amniocentesi tradizionale

LPer prevenire l’immunizzazione Rh della madre, viene somministrata di

routine la globulina immune Rh alle donne Rh negative


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Analisi dei villi coriali (chorionic villus sampling o CVS)

La biopsia dei villi si effettua tra la 10a e la 12a settimana

di gestazione mediante prelievo transaddominale o transcervicale


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Vantaggi del CVS:JDal momento che il trofoblasto é di provenienza embrionale e presenta il medesimo

patrimonio genetico dell’embrione, possono essere effettuate su questo materiale le medesime indagini citogenetiche, biochimiche e sul DNA effettuate con l’amniocentesi.

JI risultati delle successive indagini sono disponibili in un’eta’ gestazionale piu’ precoce rispetto all’amniocentesi, riducendo il periodo di incertezza e permettendo un’eventuale interruzione di gravidanza nel primo trimestre

JFornisce l’esito dell’analisi cromosomica in un periodo di tempo piu’ breve rispetto all’amniocentesi


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Svantaggi del CVSLL’AFP non puo’ essere valutata in questo stadio (a differenza dell’amniocentesi) e lo

screening per le anomalie del tubo neurale deve essere effettuato mediante esame

ecografico durante la 16a settimana di gestazione

LLa frequenza di aborto e’ dell’1% sopra il normale rischio del 2-5% alla 7a-12a

settimana di gestazione

LIl successo dell’analisi cromosomica e’ pari a quello dell’amniocentesi (>99%).

Tuttavia, il 2% dei tests eseguiti da CVS danno risultati ambigui a causa del

mosaicismo cromosomico (sia vero che pseudomosaicismo). Quindi si raccomanda

l’esecuzione di un’amniocentesi successiva per stabilire in maniera inequivocabile se

il feto presenta un’anomalia cromosomica.


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Cordocentesi (Funicolocentesi)

Con il termine funicolocentesi (o cordocentesi) si intende il prelievo di sangue fetale dal cordone ombelicale.La funicolocentesi viene eseguita più tardivamente rispetto alla villocentesi e all'amniocentesi (dopo la 20a settimana fino al termine della gravidanza) ed il prelievo comporta un maggiore rischio di aborto rispetto agli altri tipi di prelievo. Questo esame viene richiesto solo quando ci sono indicazioni specifiche.


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QUANDO SI CONSIGLIA LA FUNICOLOCENTESI

✏Mosaicismo cromosomico: nel caso di mosaicismo cromosomico rilevato su

liquido amniotico o villo coriale può essere necessario eseguire un esame del

cariotipo su sangue fetale, allo scopo di analizzare un tessuto diverso e

ottenere maggiori indicazioni sull'assetto cromosomico del bambino.

✏Malformazioni fetali evidenziate ecograficamente: le anomalie anatomiche

prendono il nome di malformazioni e colpiscono un neonato su 40. Vengono

frequentemente evidenziate intorno alla 20-22a settimana di gravidanza,

all'ecografia di secondo livello (ecografia morfologica). Alcune di queste

malformazioni possono essere conseguenza di anomalie cromosomiche e

quindi richiedere un esame del cariotipo, che può essere effettuato su liquido

amniotico o sangue fetale, a seconda dell'epoca gestazionale. Nel caso in cui la

gravidanza sia avanzata è preferibile eseguire la funicolocentesi, in quanto si

ottiene una risposta in tempo più breve rispetto all'amniocentesi.


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QUANDO SI CONSIGLIA LA FUNICOLOCENTESI

✏Ritardo nella crescita intrauterina: un importante ritardo della crescita

fetale è talvolta associato ad un'anomalia cromosomica e può essere

necessario un esame del cariotipo.

✏Diagnosi di malattie infettive: un prelievo di sangue fetale può essere

richiesto per valutare un'eventuale trasmissione di un agente infettivo

dalla madre al bambino. Oggigiorno, comunque, questo tipo di indagini

viene effettuato nella maggior parte dei casi su liquido amniotico.


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Il prelievo di sangue fetale

Funicolocentesi: un esame rischioso? I rischi per la madre sono praticamente inesistenti, se vengono rispettate le regole della sterilità.Per quanto riguarda il feto, viene stimato un rischio di aborto dopo prelievo di sangue fetale pari al 3-4%.

Il sangue fetale in laboratorio

Il sangue fetale viene raccolto in apposite provette con un terreno nutritivo che favorisce la proliferazione delle cellule prelevate. Sono necessari circa 3 giorni per poter analizzare al microscopio le cellule fetali.

La funicolocentesi non richiede alcuna preparazione ed è ambulatoriale, anche se sono necessari uno o più controlli ecografici dopo il prelievo.La sua esecuzione consiste nell'aspirazione, mediante un ago sottile introdotto per via transaddominale sotto guida ecografica, di una piccola quantità (circa 0.5-2 ml) di sangue fetale.E' consigliabile, dopo il prelievo, un periodo di riposo di 48 ore.


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Screening dell’AFP nel siero materno alla 16a settimana

Quando il feto presenta difetti del tubo neurale, la concentrazione dell’AFP e’ piu’ alta rispetto ai normali livelli nel siero materno.Questo saggio combinato con l’esame ecografico risulta molto efficace per la diagnosi dei difetti del tubo neurale.


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L’INDAGINE ECOGRAFICA

I feti affetti da anomalie cromosomiche presentano delle

caratteristiche anatomiche particolari individuabili con una indagine

ecografica nel corso del primo trimestre di gestazione.

Nel 2001 un gruppo di ricercatori del King's College Hospital di

Londra ha proposto un ulteriore marker ecografico utile per

l'individuazione degli embrioni affetti da Sindrome di Down, lo studio

delle ossa nasali. Si è infatti scoperto che il 73% dei bambini nati con

Sindrome di Down non ha ossa nasali. Si stima che questa indagine

associata all'ultrascreen può portare la predittività fino al 93% circa.


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L’INDAGINE ECOGRAFICAUna di queste indagini è la valutazione della cosiddetta TRANSLUCENZA NUCALE. Si è visto in effetti che molti embrioni affetti da anomalie cromosomiche hanno, per ragioni ancora non completamente conosciute, un accumulo transitorio di liquido negli strati sottocutanei della regione retronucale del collo nel periodo tra 10 e 14 settimane. Se lo spessore di questa zona supera i 3 mm si ha una probabilità di anomalie cromosomiche pari al 75% con un 5% di falsi positivi. In questi casi è consigliabile procedere quindi subito ad una biopsia dei villi coriali e se questa è negativa è consigliabile comunque ripetere un accurata osservazione del feto mediante un'ecografia di II livello tra la 20a e la 22a settimana, in 1 caso su 20 infatti possono essere presenti altre malformazioni, soprattutto cardiache.


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Tecnologie emergenti

si effettua la biopsia di un blastomero dopo IVF.Il trasferimento degli embrioni sani e’ effettuato dopo analisi molecolari e/o cromosomiche. Non esiste attualmente alcuna evidenza di danni negli embrioni sottoposti a biopsia.

Diagnosi genetica preimpianto (PGD)


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Diagnosi genetica preimpianto (PGD)Nel caso di malattie monogeniche si applica l’analisi molecolare mediante PCR, mentre per le anomalie cromosomiche si utilizza la FISH in interfase dopo fissazione su vetrino di uno o piu’ blastomeri.


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Cellule fetali nel sangue materno

In ogni gravidanza sono presenti cellule fetali (linfociti, cellule trofoblastiche, eritrociti) nel sangue materno (1 su 103-107). Queste possono essere arricchite mediante MACS ed utilizzate per la FISH con speciali sonde di DNA per il cromosoma 13, 18 e 21, X e Y. Queste tecniche pero’ non sono ancora applicabili nella pratica clinica e devono, per il momento, essere considerate delle tecniche sperimentali.


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Test di laboratorioAnalisi citogenetica

Analisi del DNAteoricamente saggi biochimici per la diagnosi di malattie metaboliche

(dosaggi enzimatici su liquido amniotico o direttamente su villi coriali)

questi ci riguardano quando si parla di diagnosi prenatale di malattie genetiche!!!!!


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Il liquido amnioticoIl liquido amniotico contiene cellule di origine fetale che possono essere messe in coltura per i successivi tests diagnostici.


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Analisi citogenetica

✏Sia l’amniocentesi che il CVS forniscono cellule fetali per l’analisi del cariotipo.

✏La preparazione e successiva analisi dei cromosomi puo’ richiedere da 1 a 2 settimane.

✏Si possono, in alternativa, usare nuclei interfasici da cellule fetali non coltivate per diagnosticare le comuni aneuploidie dei cromosomi 13, 18, 21, X ed Y immediatamente dopo amniocentesi o CVS. Questo rapido test citogenetico deve essere ancora realmente valutato come metodo diagnostico da utilizzare di routine.


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Tecniche di bandeggio cromosomico

Bandeggio Q Bandeggio G Bandeggio R


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MOSAICISMO✏Si riferisce alla presenza di due o piu’ linee cellulari in un campione o tessuto.Si distinguono tre livelli di mosaicismo nel liquido amniotico o nelle colture CVS:

LMOSAICISMO VERO (elevato rischio di anomalie fetali)

KMOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion)

JPSEUDOMOSAICISMO (una singola cellula anomala): viene ignorato

La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali


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problemi dell’analisi cromosomica prenatale:

riarrangiamento cromosoma marker

de novo??

Analisi del cariotipo dei genitori

1. Genitori non portatori :“de novo”

2. Un genitore (sano) portatore di un riarr.bilanciato

Stesso riarrangiamento nel feto

Feto sano?

Riarrangiamento sbilanciato nel feto

Gravi anomalie fetali

Fallimento della coltura cellulare (rischio basso) Situazioni avverse inattese


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CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

• Cromosomi di cui non è riconoscibile con le metodiche classiche la provenienza

• Frequenza alla nascita 0.14-0.72/1000

• Difficile correlazione genotipo-fenotipo in diagnosi prenatale

• Importante il rilievo della caratterizzazione molecolare


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In più del 50% dei casi è oggi possibile fare previsioni fenotipiche corrette:

• Invdup15 (50% ESAC)

• Cromosomi sessuali


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CBG positivo DA/DAPI positivoFISH centromero 15 positiva

Invdup(15)

Definizione del tipo


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FISH sonde pericentromeriche(D15S11; GABR3) NEGATIVA

Invdup(15) tipo I

Assenza di anomalie del fenotipo


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Rischio di Disomia Uniparentale 15q11-q13 da origine postzigotica del

marcatoreMaterna Paterna

s. Prader/Willi s. Angelman


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D15S130 D15S165

P F M P F M

Polimorfismi Cromosoma 15 - Tecnica PAGE


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ESCLUSIONE DISOMIA UNIPARENTALECON MARCATORI POLIMORFICI DEL

CROMOSOMA 15


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Mosaicismo

• Amniocentesi cellule dall’epiblasto della massa cellulare interna.

• Villocentesi – Coltura a breve termine cellule del trofoblasto.

• Villocentesi – Coltura a lungo termine cellule dello stroma (mesoderma extraembrionario).


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MOSAICISMO

• I Livello: singola cellula

• II Livello: due o più cellule in una flask con la stessa anomalia o singolo clone

• III Livello: due o più cellule in più flask con la stessa anomalia o almeno 2 cloni


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Liquido Amniotico Mosaicismi

• Livello I 2.5-7 %• Livello II 0.7-1.1 %• Livello III < 0.2 %


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MOSAICISMO

• PSEUDOMOSAICISMO

• MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion)

• MOSAICISMO VERO

La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali


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Diagnosi Malattie DNA

• Numero elevato malattie• Numero elevato di mutazioni (es.

Fibrosi cistica)• Coinvolgimento geni diversi (es. Retinite

pigmentosa)


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Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti

→ Conoscenza gene/i

� Identificazione della specifica mutazione


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Conoscenza geni

8000 malattie

geni noti 30%

(60-70% pazienti)

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