Diagnosi di laboratorio

delle infezioni virali

G. Di Bonaventura, PhDUniversità “G. D’Annunzio”, Chieti-Pescara

gdibonaventura@unich.it

Diagnosi di laboratorio delle

infezioni virali

Presuppone un’adeguata diagnosi clinica: corretto inquadramento differenziale sul piano clinico per restringere

lo spettro delle indagini da eseguire

Buona conoscenza della patogenesi delle infezioni sospette corretto prelievo ed invio di un adeguato campione clinico

Diagnosi di laboratorio indispensabile quando: sia prospettabile uno specifico intervento profilattico o terapeutico

il quadro clinico può essere sostenuto da più virus non correlati (forme esantematiche, forme enteriche acute, infezioni respiratorie)

sia necessario seguire “particolari” categorie di pazienti (ad esempio, immunodepressi)

si predisponga il controllo di preparazioni commerciali di emoderivati

si ricerchi l’agente eziologico di nuove o gravi patologie

si eseguano indagini a carattere epidemiologico su una determinata popolazione

Diagnosi di laboratorio delle infezioni

virali

La diagnosi di laboratorio di una infezione virale può essere eseguita seguendo due approcci differenti: approccio DIRETTO, a cui è riconducibile una ricerca di tipo

virologico, si avvale di tecniche atte ad identificare il virus direttamente nel campione clinico: Isolamento virale (coltivazione)

Ricerca di particelle virali (microscopia)

Ricerca di antigeni virus-specifici (immunoenzimatica, immunofluorescenza)

Ricerca di acidi nucleici virali (biologia molecolare)

approccio INDIRETTO, a cui è riconducibile una diagnosi di tipo sierologico, si avvale di tecniche in grado di rilevare nel siero dei pazienti la presenza di anticorpi contro specifici antigeni virali: Ricerca di anticorpi vs antigeni virus-specifici

Isolamento e crescita viraleColtivazione dei virus

E’ il GOLD STANDARD delle metodiche di diagnosi virologica.

I virus sono patogeni “intracellulari obbligati”,

quindi:

richiedono l’inoculazione in ospiti viventi adeguati (cioè: sensibili e permissivi)

Fagi (batteriofagi o virus batterici)

Batteri

Virus animali

Animale

Uova embrionate

Coltura cellulare animale

Virus vegetali

Pianta

Coltura cellulare vegetale

Isolamento virale: pro e contro

Permette di isolare, tipizzare e conservare il virus

Consente di isolare anche virus non sospettabili o non conosciuti al momento dell’isolamento

Importante per HIV (diagnosi precoce in bambini nati da madri sieropositive) e CMV (diagnosi in bambini da madri con infezione in atto od immunodeficenti)

TUTTAVIA:

Richiede lunghi tempi di esecuzione

Non è applicabile a tutti i virus (HPV, EBV, HBV, HCV, rotavirus)

Poco sensibile (soprattutto in caso di infezioni paucivirali) e specifico

Coltivazione di batteriofagi

Batteri seminati su agar

colture, in brodo o agar, di batteri in fase esponenziale

Aggiunta di batteriofagi

l’infezione si manifesterà con:

formazione di “placche” (zone chiare sulla piastra) osservate in colture cresciute su agar

riduzione della torbidità, in colture in brodo

Coltivazione di batteriofagi

Coltivazione di virus animali

Colture cellulari Monostrati di cellule animali

Tecnica maggiormente usata per la coltivazione virale formazione di placche (aree localizzate di lisi e distruzione

cellulare)

comparsa di caratteristici effetti citopatici (CPE)

Animale Topo, coniglio, maiale

Embrione di pollo (uova embrionate) Ancora usata per la produzione di vaccini (influenzali)

Coltivazione di virus animali Colture

cellulari

Colture cellulari “primarie” digestione enzimatica (tripsina, collagenasi) di organi/tessuti

crescono in monostrato (cellule epiteliali) od in sospensione (linfociti)

vita limitata (colture a termine)

esempi: rene di scimmia (paramyxovirus, enterovirus, adenovirus)

Linee cellulari diploidi o semicontinue colture di singolo tipo cellulare

derivano dall’embrione umano

stabili (non si differenziano) fino a 100 generazioni

esempi: fibroblasti fetali umani (HSV, VZV, CMV, adenovirus)

Linee cellulari “continue” (a vita illimitata) cellule “trasformate” (cellule tumorali aneuploidi)

possono essere mantenute indefinitamente

esempi: cellule HeLa○ Henrietta Lax, 1951 (cancro cervice uterina)

Metodica di isolamento virale

Monostrato cellulare

(esposto all’azione virale)

Effetto citopatico

(CPE o placca)

Rilevazione di antigeni virali

(virus a crescita lenta, virus CPE-negativi)

CPE in vitro ed in vivo: sincizio

virus del morbillo su carcinoma

gastrico umano (A549)

Sincizio prodotto dal virus del morbillo.

Cellula gigante multinucleata (freccia) in

sezione istologica di campione bioptico di

polmone prelevato da adolescente

immunocompromesso con polmonite.

Sincizi: cellule giganti multinucleate formate dalla fusione, indotta

da virus, di singole cellule.

Prodotti da: Paramyxovirus, Herpesvirus, HIV

CPE: corpi di inclusione

Corpi di inclusione: cambiamenti

istopatologici delle cellule infettate

causati direttamente all’azione di

componenti virali o modificazioni

delle strutture cellulari in seguito

all’infezione.

Corpi del Negri (rhabdovirus)

Inclusioni di Cowdry di tipo A

(herpesvirus, varicella-zoster)

Inclusioni ad “occhio di gufo”

(CMV)

CMV: inclusioni ad “occhio di gufo”

Colture cellulariEffetto citopatico: placca

CPE in vitro (placca): vaiolo su rene di scimmia (BSC40)

Bassa molteplicità di infezione (MOI)

Placca singolaAlta MOI, 48 hr

Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-4

Indagini virologiche: ricerca DIRETTAMetodi rapidi

La ricerca e l’identificazione diretta del virus direttamente nel campione clinico prevede l’utilizzo di metodiche rapide, in grado di fornire una risposta al quesito diagnostico in poche ore oppure, al più, in giornata

Microscopia elettronica La tecnica della colorazione negativa è quella più frequentemente

utilizzata: assorbimento virale su retino, quindi colorazione con un sale metallico

pesante elettron-denso (acetato di uranile, acido fosfotungstico) colorazione del fondo ma non delle particelle virali (contrasto negativo)

diagnosi rapida (15 min) e specifica sulla base di caratteri morfologici (forma, dimensioni, organizzazione)

scarsa sensibilità: 106-107 virioni/ml; necessità di arricchire il campione prima di osservarlo (tranne che per campioni fecali o lesioni da HSV, in cui si hanno 1011 virioni/ml)

aumentata sensibilità mediante utilizzo di anticorpi (immunoelettron-microscopia)

elevati costi di gestione, richiesta di elevata expertise e scarsa sensibilità ne limitano l’impiego routinario

Indagini virologiche: ricerca DIRETTAMetodi rapidi: microscopia elettronica

SARS

HIV Ebola virus

HBV

Conteggio diretto delle particelle virali

mediante microscopia elettronica

La sospensione virale è posta su un retino per ME e colorato.

L’inclusione di una quantità conosciuta di sfere di latex

permette una stima quantitativa del virus

Non è una tecnica standard

Richiede un sufficiente numero di particelle

virali. Adatto per diagnosi di infezioni con

massiva eliminazione virale (Rotavirus)

Aggiunta di anticorpi specifici per aumentare

la sensibilità (immunoelettromicroscopia)

Sovrastima del titolo

Microfotografia di una goccia contenente 15 microsfere in

lattice e 14 unità di virus vaccinico (Poxvirus) (leggermente

più piccoli, forma a “mattone”).

(da: Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds,, 2001)

Indagini virologiche: ricerca DIRETTAMetodi rapidi

Ricerca di antigeni virali E’ necessario che gli antigeni virali siano presenti nel campione e che si

disponga di sieri immuni (anticorpi anti-antigene) specifici A seconda del virus e, quindi, della tipologia del materiale da esaminare

(cellule, feci, sangue-siero) possono essere applicate le seguenti tecniche: Immunofluorescenza (IF): rivelazione “fluorescente” del complesso Ag-Ab

Diretta: l’antigene cellulare viene legato da un anticorpo coniugato con isotiocianato di fluorescina (o rodamina)

Indiretta: l’antigene cellulare viene legato da un anticorpo 1ario che, a sua volta, viene legato da un anticorpo 2ario coniugato (diretto verso Fc delle Ig della specie in cui è stato prodotto l’anticorpo 1ario)

Immunoperossidasi (IP): rivelazione “colorimetrica” del complesso Ag-Ab similare alla IF, sebbene la marcatura dell’anticorpo consiste nella perossidasi

di rafano che, in presenza di idoneo substrato, sviluppa una reazione colorimetrica

molto utile se effettuata su preparati colorati per l’istochimica Immunoenzimatica (ELISA, EIA): rivelazione “colorimetrica” complex Ag-Ab

“sandwich test”: anticorpo (specifico per un antigene) di cattura adsorbito ad una superficie plastica (pozzetto o biglia); legame con anticorpo di rilevazione direttamente marcato con un enzima o viene riconosciuto da un terzo anticorpo marcato in grado di legare Fc delle Ig

utilizzabile anche per antigeni “solubili” non è influenzata dalla qualità (prelievo, trasporto) del campione

Immunofluorescenza (IF):

diretta vs indiretta

Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e l’identificazione di antigeni virali. Nel test diretto, l’anticorpo

marcato con colorante fluorescente è applicato al campione contenente l’antigene, quindi l’anticorpo in

eccesso viene lavato e l’anticorpo rimasto legato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza.

Nel test indiretto, l’antigene è rilevato mediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con

un anti-anticorpo marcato con una sostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo è

umano, il secondo anticorpo sarà un anticorpo contro le Ig umane).

Utile per la ricerca di antigeni virali presenti

nelle cellule epiteliali di sfaldamento delle

vie respiratorie (adenovirus, coronavirus) o

di occhio e cute (HSV, VZV) o l’antigene

precoce pp65 di CMV nei leucociti infetti

IFA: CMV in

leucociti

IFA: Coronavirus

Indagini virologiche: ricerca DIRETTAMetodi rapidi: ricerca antigenica mediante IP

Ricerca di antigeni specifici

mediante ELISA

Ricerca immunoistochimica antigenica del

West Nile virus nel cervello di hamsters infetti.

Particolarmente utile se applicata a tessuti integri contromarcati con

coloranti istochimici (definizione delle relazioni spaziali tra antigene

virale e strutture cellulari)

Indagini virologiche: ricerca DIRETTAMetodi rapidi: ricerca antigenica per ELISA

Ricerca di antigeni specifici

mediante ELISA

Adatta per la ricerca di antigeni virali cellulo-associati, antigeni in fase fluida

(sangue, liquor, siero) od antigeni rilasciati nel surnatante delle colture infette).

Utile per la diagnosi rapida di virus respiratori (influenza, RSV), enterici

(rotavirus), epatitici (HBV) e HIV. E’ la metodica più frequentemente impiegata

nei laboratori di virologia.

Indagini virologiche: ricerca DIRETTAMetodi rapidi

Ricerca di acidi nucleici Permettono la rilevazione di quantità infinitesimali di acidi nucleici virali Tecnica rapida ed altamente sensibile (sensibilità teorica: 1 virione) Trovano particolare applicazione nella ricerca di virus:

difficili o impossibili da coltivare (HPV, HIV, poliomavirus) a lenta crescita (CMV, VZV) ad elevata (enterovirus) o scarsa variabilità antigenica

Non influenzata dalla qualità del campione e dalla sua vitalità Differenti tipologie di saggi molecolari:

Tecniche che amplificano la sequenza bersaglio (PCR, TMA) Polymerase Chain Reaction (PCR): amplificazione di DNA target e

rivelazione elettroforetica Transcription Mediated Amplification (TMA): amplificazione isotermica che

impiega una transcrittasi inversa e T7 RNA polimerasi (maggiore efficienza di amplificazione vs PCR)

Tecniche che amplificano il segnale di rilevazione (bDNA, HC): bDNA: rilevazione in chemioluminescenza (sonde marcate con fosfatasi

alcalina complementari alla molecola di bDNA) Hybrid capture (HC): ibridazione in fase liquida del DNA target denaturato

con sonda a RNA specifica per la sequenza in esame

Indagini virologiche: ricerca DIRETTAMetodi rapidi: PCR

Indagini virologiche: ricerca DIRETTAMetodi rapidi: Hybrid capture (HPC)

Misurazione della carica virale

Misurazione della concentrazione

delle unità infettanti (virali)

Titolo virale (ufp/ml) Concentrazione di unità infettanti in grado di indurre la

formazione di placche (ufp) in cellule animali in coltura

Dose di coltura tessutale (TVD) Numero di virus che causa effetto citopatico in coltura cellulare

Dose letale 50 (LD50) Numero di virus che uccide il 50% di un gruppo di cavie

Dose infettante (ID50) Numero di virus che dà inizio a sintomi rivelabili, o risposta

anticorpale, nel 50% di un gruppo di animali da esperimento

1:100

1:10 1:101:101:101:10

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

virus

serial dilution

plate 1 ml

plaques (n) 100 10 11.000100.000 10.000

Titolo = 1 x 107 ufp (unità formanti placca) / ml

Misurazione delle unità infettantiMetodo diretto: Plaque assay

Plaque assay

da: Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-5

da: Davis, Duylbecco, Eisen, Ginsberg “Microbiology” 4th ed, J.B. Lippincott 1990, Fig. 48-1

Misurazione delle unità infettantiMetodo indiretto: inoculazione di uova embrionate

Formazione di “pock” indotte da cowpox

virus sulla membrana corion-allantoidea

(CAM) di embrioni di pollo.

CAM di embrioni sani di pollo (11 giorni)

vengono inoculate con cowpox e le uova

incubate per 3 gg a 37.5°C. La CAM

viene quindi rimossa dall’uovo e

fotografata.

Le immagini evidenziano la formazione di

pocks emorragici.

(da: Fields Virology, 4th ed, Knipe &

Howley, eds, Lippincott Williams &

Wilkins, 2001, Fig. 2-1)

Misurazione delle unità infettantiMetodo indiretto: inoculazione di uova embrionate

Misurazione della concentrazione

delle unità infettanti (virali)

Titolo virale (ufp/ml) Concentrazione di unità infettanti in grado di indurre la

formazione di placche in cellule animali in coltura

Dose di coltura tessutale (TVD50) Numero di virus che causa effetto citopatico in coltura cellulare

Dose letale 50 (LD50) Numero (titolo) di virus che uccide il 50% di un gruppo di cavie

Dose infettante (ID50) Numero di virus che dà inizio a sintomi rivelabili, o risposta

anticorpale, nel 50% di un gruppo di animali da esperimento

Calcolo di LD50

Conteggio indiretto di particelle virali:

Emoagglutinazione (HA)

virus No virus

Emoagglutinazione

aggiungere 0.1 ml PBS a 0.1 ml di campione

allestire diluizioni seriali tipo “2-fold”

(1/2, 1/4, 1\8, …)

aggiungere 0.05 ml 1% RBC animali (maiale,

pollo)

incubare a +4°C per 1-2 h

Titolo = 32 unità HA/ml (max diluizione virale che causa emoagglutinazione)

Test di emoagglutinazione1:8

1:2 1:21:21:21:2

8 16 32 64 128 256

virus

serial dilution

mix with red

blood cells

side view

top view

Saggio di emoagglutinazione. Sette differenti tipi di influenzavirus, numerati da 1 a 7, sono stati diluiti

serialmente come indicato nella prima riga, esposti ad eritrociti di pollo (RBC), ed incubati in ghiaccio per

1-2 hs. I pozzetti dell’ultima riga non contengono virus (ctrl negativo). Il Titolo (indicato nell’ultima colonna)

è l’ultima diluizione in grado di causare emoagglutinazione completa. (da: Fields Virology, 4th ed, Knipe &

Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-8)

Test di Emoagglutinazione: virus influenzale

Tecnica Quantità (per ml)

Conta al microscopio elettronico 1010 particelle EM

Saggio in uova embrioate 109 egg ID50

Saggio di formazione di placca 108 ufp

Saggio di emoagglutinazione 103 unità HA

Diagnosi infezione viraleComparazione sensibilità metodiche quantitative

Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Table 2-4

Diagnosi sierologica delle

infezioni virali

Meccanismi di difesa immunitariRisposta umorale (produzione anticorpale)

Tutte le proteine virali sono immunogene. Nel corso dell’infezione virale vengono prodotte tutte le tipologie anticorpali:

IgM, che si manifestano precocemente (indice di infezione in atto/recente) e solo nella “prima infezione” di soggetto non immune

IgG, che si presentano più tardivamente e sono prontamente mobilizzate a seguito dei possibili successivi contatti con l’antigene. “Controllo” virale a livello sierico. Più efficaci delle IgM

IgA secretorie mucosali, che svolgono un importante ruolo di “barriera” alla penetrazione virale delle mucose

Gli anticorpi non hanno tutti funzione protettiva:

La migliore risposta anticorpale è quella sviluppata nei confronti degli antirecettori (capsidici o di peplos)

Diagnosi sierologica

La prevalente componente proteica della struttura virale rende il virione altamente immunogeno

La diagnosi sierologica si basa essenzialmente sulla ricerca di IgM (indice di infezione in atto o recente)

Alternativamente: Sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di

infezione (primaria) in atto

Aumento del titolo anticorpale (fase acuta vs convalescenza): indice di infezione (riattivazione o reinfezione) in atto

Diagnosi sierologica

Tecniche sierologiche SAGGI FUNZIONALI: evidenziazione di specifiche

attività derivanti dalla formazione dell’immunocomplex○ Saggio di neutralizzazione: Abs specifici neutralizzano un

caratteristico effetto citopatico. Rappresenta il “gold standard”, sebbene richieda elevati costi e tempi di esecuzione

○ Reazione di inibizione dell’emoagglutinazione: Abs specifici in grado di inibire l’attività emoagglutinante di alcuni virus (influenza, parainfluenza, morbillo)

○ Reazione di fissazione del Complemento: in presenza di Abs specifici si forma un immunocomplesso che lega il Complemento. In queste condizioni, il Complemento non può lisare gli eritrociti (sistema di rilevazione della formazione dell’immunocomplesso: Ag + eritrociti)

Titolo anticorpale: la più alta diluizione in grado di inibire …

Diagnosi sierologicasaggi di neutralizzazione/inibizione

emoagglutinazione

Saggio di inibizione della

emoagglutinazioneSerumdilution

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

1/640

1/1280

-ve control

1 wk8 wksVirus

HA

Diagnosi sierologica

Tecniche sierologiche SAGGIO SU MEMBRANA (Western blot):

identificazione di Abs diretti verso singole e specifiche proteine virali○ separazione degli Ags virali (da cellule infette) mediante

elettroforesi

○ trasferimento Ags su membrana

○ esposizione al siero in esame

○ sistema di rilevazione colorimetrica dell’immunocomplex: Abs anti-Ig umane marcati con enzima

○ aggiunta del substrato per l’enzima

○ rilevazione segnale (colorimetrico, chemiluminescenza)

Diagnosi sierologicaWestern blot

Diagnosi sierologica

Tecniche sierologiche SAGGI DI LEGAME (immunoenzimatico e

radiometrico): ○ adsorbimento Ags su supporto solido (pozzetto o biglie di

polistirene)

○ aggiunta del siero in esame

○ rilevazione immunocomplex mediante aggiunta Ab 2ario anti-IgG umane marcato con:

EIA (saggio immunoenzimatico): enzima in grado di reagire con idonei substrati (reazione colorimetrica, misurata allo spettrotometro)

RIA (saggio immunoradiometrico): isotopo radioattivo (125I), segnale misurato con un contatore di raggi gamma

Il saggio EIA viene comunemente preferito perchè automatizzabile,

versatile, standardizzabile

Immunological detection

Immunoistochimica Immunofluorescenza

bovine herpesvirus antigens

in endothelial cells

BHV-1 antigens in neuron

In trigeminal ganglion