Cromatografia Cromatografia GeneraleGenerale

Un sistema cromatografico…Un sistema cromatografico…

Si compone di TRE elementi Si compone di TRE elementi essenziali che lo caratterizzano essenziali che lo caratterizzano SEMPRE :SEMPRE :

1.1. Una fase STAZIONARIAUna fase STAZIONARIA

2.2. Una fase MOBILEUna fase MOBILE

3.3. L’analita (o una miscela di analiti)L’analita (o una miscela di analiti)

CromatografiaCromatografia

1.1. Analisi antidoping e degli stupefacentiAnalisi antidoping e degli stupefacenti

2.2. Metabolismo di xenobiotici e farmaciMetabolismo di xenobiotici e farmaci

3.3. Inquinanti ambientali (aria, terreni, acqua)Inquinanti ambientali (aria, terreni, acqua)

4.4. Analisi DNA, purificazione proteineAnalisi DNA, purificazione proteine

5.5. Analisi degli alimentiAnalisi degli alimenti

6.6. Analisi dei profumi e dei cosmeticiAnalisi dei profumi e dei cosmetici

7.7. etc etc.etc etc.

CROMATOGRAFIA

La CROMATOGRAFIA interessa la separazione di miscele liquide complesse.

La separazione avviene grazie alle differenze nei coefficienti di distribuzione (equilibrio di distribuzione) delle specie chimiche presenti nel campione tra 2 FASI differenti. Una di queste fasi è la fase mobile e l’altra è la fase stazionaria.

- Stesso principio dell’estrazione con solvente !!!

Definizione:

 

La diversa affinità di 2 componenti la miscela verso la fase stazionaria determina la separazione cromatografica

Concentrazione del componente A nella fase stazionaria

Concentrazione del componente A nella fase mobile

Coefficiente di distribuzione (Equilibrio di distribuzione )

AAmobilemobile A Astazionariastazionaria

K distr =

K distr

Tipi di Cromatografia

1. Cromatografia Liquida su Colonna

 (HPLC)

2. Gas Cromatografia

 (GC)

3. Cromatografia su strato sottile

(TLC)

Processo CromatograficoProcesso Cromatografico

Sistemi CromatograficiSistemi Cromatografici

Tecniche CromatograficheTecniche Cromatografiche

TLC/PC

HPLC

GC/SFC

PC-Paper Chrom

Cromatografia – Meccanismo separazioneCromatografia – Meccanismo separazione

AdsorbimentoAdsorbimento PartizionePartizione Scambio Ionico – Interazione ionicaScambio Ionico – Interazione ionica Esclusione dimensionaleEsclusione dimensionale Affinità (interazione anticorpo-antigene; Affinità (interazione anticorpo-antigene;

interazione chimica; attrazione)interazione chimica; attrazione) Complessazione - ChelazioneComplessazione - Chelazione

Problemi di assorbimento!!!!!

ASsorbimento ADsorbimento

Diversi tipi di assorbimento

Adsorbimento Partizione Scambio ionico

Cromatografia – Meccanismo di SeparazioneCromatografia – Meccanismo di Separazione

Cromatografia – Meccanismo di SeparazioneCromatografia – Meccanismo di Separazione

Affinità Esclusione dimensionale

Cromatogramma – Parametri di baseCromatogramma – Parametri di base

tR = Tempo di ritenzionetm = Tempo morto

H

1/2HW1/2

Picco non trattenuto

Teoria CromatograficaTeoria Cromatografica

Tempo di ritenzione Tempo di ritenzione : : ttR’R’ = t = tRR – t – tMM

Teoria dei piattiTeoria dei piatti – distillazione – – distillazione – numero di piattinumero di piatti

N = 5.54[(tN = 5.54[(tRR – t – tMM)/w)/w1/21/2]]22

Altezza dei piatti Altezza dei piatti H = L/NH = L/N

Questa teoria non tiene conto della interazione degli Questa teoria non tiene conto della interazione degli analiti con la fase stazionariaanaliti con la fase stazionaria

Cromatografia – Allargamento dei picchi

Cromatografia - TeoriaCromatografia - Teoria

Teoria delle velocità Teoria delle velocità – fattori cinetici – – fattori cinetici – van Deemtervan Deemter

H = B/u + Cu (+ A)H = B/u + Cu (+ A)Dove:Dove: u – velocità della fase mobileu – velocità della fase mobile

B – effetto della diffusione molecolare B – effetto della diffusione molecolare C – resistenza al trasferimento di massaC – resistenza al trasferimento di massaA – allargamento dovuto alla diversa A – allargamento dovuto alla diversa distanza percorsa dalle molecole distanza percorsa dalle molecole

nelle colonne impaccatenelle colonne impaccate

Cromatografia – Effetto dell’impaccamento Cromatografia – Effetto dell’impaccamento sull’allargamento dei picchisull’allargamento dei picchi

Parametri di van Deemter (B) :Parametri di van Deemter (B) :

Diffusione Molecolare (B)Diffusione Molecolare (B) – nella fase – nella fase mobile: mobile:

proporzionale al tempo che l’analita passa proporzionale al tempo che l’analita passa nella colonnanella colonna

influenzato dal coefficiente di diffusione influenzato dal coefficiente di diffusione dell’analita nella fase mobiledell’analita nella fase mobile

influenzato dalla temperatura e pressioneinfluenzato dalla temperatura e pressione poco importante in LC – basso coefficiente poco importante in LC – basso coefficiente

di diffusione di diffusione inversamente proporzionale alla velocità inversamente proporzionale alla velocità

della fase mobiledella fase mobile

Parametri van Deemter (C):Parametri van Deemter (C):

Resistenza al trasferimento di massa (C):Resistenza al trasferimento di massa (C): trasferimento di massa nelle fasi stazionaria e trasferimento di massa nelle fasi stazionaria e

mobile mobile mancanza di equilibrio – fase mobilemancanza di equilibrio – fase mobile influenzata dallo spessore della fase liquidainfluenzata dallo spessore della fase liquida inversamente influenzata dal diamentro delle inversamente influenzata dal diamentro delle

particelle o dal diametro interno della colonna particelle o dal diametro interno della colonna capillare capillare

diminuisce all’aumentare della temperatura diminuisce all’aumentare della temperatura (viscosità)(viscosità)

Parametri van Deemter:Parametri van Deemter:

Conclusioni:Conclusioni: Il più basso valore di H si ottiene quando:Il più basso valore di H si ottiene quando:

lo spessore della fase stazionaria è minimolo spessore della fase stazionaria è minimo la colonna è impaccata con particelle molto finila colonna è impaccata con particelle molto fini le colonne capillari hanno il diametro più piccolole colonne capillari hanno il diametro più piccolo la fase mobile e stazionaria mobile hanno bassa la fase mobile e stazionaria mobile hanno bassa

viscosità e elevato coefficiente di diffusioneviscosità e elevato coefficiente di diffusione

Cromatografia – van Deemter Cromatografia – van Deemter

Velocità fase mobile

Effettomultipercorso

Trasferimento di massa

Diffusione (Longitudinale)

Alt

ezza

dei

pia

tti (

cm)

H

Cu

A

B/u

Cromatografia - RisoluzioneCromatografia - Risoluzione

Response

tR1 tR2tR

Wb1

R = 2(tR1 – tR2)/Wb1 – Wb2

Wb2

Baseline resolution for Gaussianshape peaks = 1.5

100%

Cromatografia - RisoluzioneCromatografia - Risoluzione

Equazione per il parametro di risoluzioneEquazione per il parametro di risoluzione

RRss = ½ = ½ xx ( (-1/-1/+1) +1) xx k’ k’22/1+k’/1+k’22xx (L/h) (L/h)1/21/2

Dove:Dove: – fattore di selettività (separazione) – fattore di selettività (separazione) = = ttR1R1/t/tR2R2

k’ – termine di migrazione, fattore di capacità; k’ – termine di migrazione, fattore di capacità;

k’ = mk’ = mss/m/mmm

L – lunghezza della colonnaL – lunghezza della colonna

h – altezezza piatto h – altezezza piatto

Chromatography - ResolutionChromatography - Resolution

CromatografiaCromatografia

Analisi QualitativaAnalisi Qualitativa Retention data – RT; RRetention data – RT; Rff; RRT; Kovacs ; RRT; Kovacs

IndexIndex

Analisi QuantitativaAnalisi Quantitativa Peak ar ea and height usually proportional Peak ar ea and height usually proportional

to the amount of componentto the amount of component CalibrationCalibration Internal Standard method Internal Standard method External Standard methodExternal Standard method Area Normalization method Area Normalization method

Chromatogram – Basic ParameterChromatogram – Basic Parameter

tR = retention timetm = dead time

H

1/2HW1/2

unretained

THE ENDTHE END