Copia di DISPENSA TEST ELISA short - unimi.it · INDICE* Conoscenzepropedeuche * 1.Introduzione* *...
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Sperimenta il Biolab 1 Università degli Studi di Milano IL TEST ELISA
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Sperimenta il Biolab
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Università degli Studi di Milano
IL TEST ELISA
INDICE
Conoscenze propedeuAche
1. Introduzione Pag. 3 1.1 Test Elisa Pag. 3
2. AnAcorpi Pag. 3 2.1 StruHura e funzione Pag. 3 2.2 Classi di immunoglubile Pag. 4 2.3 Legami anAgene-‐anAcorpo Pag. 7
3. AnAcorpi policlonali e moniclonali Pag. 7 3.1 Produzione di anAcorpi policlonali Pag. 7 3.2 Produzione di anAcorpi monoclonali Pag. 8
4. Test ELISA Pag. 9 4.1 Saggio direHo o sandwich Pag. 9 4.2 Saggio indireHo Pag. 10
5. Enzimi e substraA Pag. 10 5.1 Enzimi coniugaA agli anAcorpi Pag. 10 5.2 SubstraA enzimaAci Pag. 11
6. Principali Applicazioni del test ELISA Pag. 11 6.1 MalaSe infeSve Pag. 11 6.2 Tossine Pag. 13 6.3 Droghe Pag. 14 6.4 Allergeni Pag. 15
7. Laboratorio Pag. 16 7.1 Scopo dell’espeimento Pag. 16 7.2 Materiali a disposizione Pag. 16 7.3 Procedura metodo direHo (determiniazione anAgeni) Pag. 16 7.4 Procedura metodo indireHo (determinazione anAcorpi) Pag. 17
8. Test ELISA scenari Pag. 18 1) Test HIV Pag. 19 2) Guida soHo l’effeHo di stupefacenA Pag. 19 3) Micotossine nel laHe Pag. 19 4) Allergeni Pag. 20
9. Sitografia e Bibliografia Pag. 20 11. Glossario Pag. 21
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Conoscenze propedeuAche
I legami chimici; le proteine: stru5ura e funzioni; gli enzimi e la cine8ca enzima8ca; il sistema immunitario: l’immunità innata e ada5a8va (vedi allegato) ; conce5o di gene, mutazione e ricombinazione.
1. INTRODUZIONE
1.1. TEST ELISA saggio immunoenzimaAco
ELISA un acronimo derivato dall'espressione inglese enzyme-‐linked immunosorbent assay (saggio immuno-‐assorbente legato ad un enzima). Si tra5a di un versa8le metodo d'analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di una sostanza (anAgene) usando uno o più anAcorpi ad uno dei quali è legato un enzima: l’enzima viene legato all’an8corpo in modo da non modificare né le proprietà catali8che dell'enzima né la specificità an8corpale. Questa metodica d'indagine rientra nella categoria dei test immunoenzima8ci. Gli enzimi u8lizza8 catalizzano reazioni i cui prodoK sono colora8 e possono essere perciò rileva8 anche in quan8tà molto basse mediante le5ura colorimetrica allo spe5rofotometro (fig.1).
� � Fig 1. A sinistra piastra in polis8rene dove avviene il Test ELISA e a destra uno spe5rofotometro
Il dosaggio immunoenzima8co è una delle tecniche più u8lizzate in campo clinico, diagnos8co e nell’ambito della ricerca scien8fica per l'analisi quan8ta8va di ormoni proteici (ossitocina, insulina, gonadotropina corionica o hCG, ecc.), ormoni steroidei (progesterone, testosterone, estradiolo, ecc.), ormoni amminoacidici (8roxina, adrenalina, ecc.), farmaci, markers tumorali, citochine, allergeni, tossine nei cibi e numerose altre sostanze.
2. ANTICORPI
2.1 StruHura e funzioni
Gli an8corpi sono proteine plasmaAche indicate anche con i termini di immunoglobuline (Ig) o gammaglobuline (γG) e rappresentano, nell’uomo, circa il 20% del totale proteico del plasma. Sono presen8 nei vertebra8 e svolgono funzioni di difesa all’interno del sistema immunitario ada5a8vo che ha, a sua volta, il ruolo di riconoscere sostanze estranee all’organismo e inaKvarle. Esistono differen8 8pi di an8corpi ma tuK riconducibili a un’unica stru5ura di base che ricorda la forma di una Y. All’estremità di ogni braccio della Y ci sono due si8 iden8ci di legame per l’an8gene (Fab region) mentre la regione della coda (Fc region) media molte altre aKvità dell’an8corpo quali ad esempi la capacità di legarsi alle cellule fagoci8che (macrofagi, eosinofili ecc.) e di aKvare il complemento. Quindi l’azione degli an8corpi non è dovuta solo all’interazione con l’an8gene ma anche alle diverse funzioni della regione della coda.
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Tra le braccia e la coda esiste una regione cerniera (hinge region) flessibile che perme5e di variare la distanza tra i due si8 di legame per l’an8gene (fig. 2).
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Fig 2: Rappresentazione della stru5ura base a Y degli an8corpi. E’ formato da due catene pesan8 H (in azzurro) e due catene leggere L (in verde). Le due braccia della Y sono de5e Fab region e portano all’estremità la zona specifica di legame con l’an8gene (CDR). Nelle parte basale della Y abbiamo la Fc region necessaria per le diverse funzioni effe5rici dell’an8corpo. CH e CL = domini costan8 della catena pesante e leggera, domini variabili. VH e VL = domini variabili della catena pesante e leggera. In rosso i pon8 disolfuro.
Una molecola di an8corpo è composta da qua5ro catene polipep8diche appaiate, iden8che a due a due: due catene leggere o catene L (dall'inglese light) formate ciascuna da circa 220 aminoacidi e due catene pesanA o catene H (dall'inglese heavy) composte da circa 440 aminoacidi (fig. 3). Esistono due 8pi di catene leggere, designate come k e λ , e cinque 8pi di catene pesan8, α, δ, ε, γ e μ che cara5erizzano le cinque classi di an8corpi presen8 nei mammiferi, rispeKvamente IgA ,IgD, IgE, IgG e IgM (fig.4). Ogni 8po di catena leggera può combinarsi con qualunque 8po di catena pesante. Le qua5ro catene polipep8diche sono unite da legami deboli e da pon8 disolfuro intercatenari e intracatenari. Ogni catena è cos8tuita da una porzione costante, o regione C, localizzata dalla parte del gruppo carbossilico terminale e da una porzione variabile, o regione V, disposta dalla parte del gruppo amino-‐terminale. Le catene leggere sono formate da due domini uno nella regione variabile (VL) e l’altro nella regione costante (CL) e, in genere, da quaHro domini nelle catene pesanA, di cui uno nella regione variabile (VH) e tre in quella costante (CH1, CH2, CH3) (fig.2). Le IgG, IgA e IgD hanno 3 domini costan8 e la regione cerniera, mentre le IgM e le IgE sono prive della regione cerniera e hanno cinque domini nelle catene pesan8, di cui uno variabile e qua5ro costan8. Al dominio CH2 di tuK gli an8corpi si legano residui oligosaccaridici, che portano a definire gli an8corpi come glicoproteine e che ne influenzano alcune aKvità biologiche (trasporto, secrezione ecc). In corrispondenza delle anse terminali dei domini variabili sia della catena pesante sia di quella leggera ci sono tre piccole regioni ipervariabili (Complementarity Determining Regions o CDR) di circa 5-‐10 aminoacidi, che formano il vero e proprio sito di legame per l’an8gene. Di conseguenza anche le dimensioni del determinante an8genico ovvero della porzione di an8gene che entra in conta5o con il sito di legame dell’an8corpo, sono generalmente piccole.
2.2 Classi di immunoglobuline
Le cinque classi di immunoglobuline presen8 nell’uomo hanno la stessa stru5ura monomerica di base ma differiscono, oltre che nel 8po di catena pesante, anche nella conformazione dell'intera macromolecola. InfaK le immunoglobuline di classe G, D ed E sono monomeri, le IgA comprendono monomeri e dimeri e le IgM sono pentameri (fig. 3).
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� Fig 3. Rappresentazione della stru5ura delle cinque classi di immunoglobuline presen8 nell’uomo
Tali differenze conferiscono alle varie classi di an8corpi proprietà funzionali diverse. L'appartenenza ad una classe rispe5o che ad un'altra perme5e agli an8corpi di reagire meglio verso i patogeni per dislocazione (le IgA agiscono prevalentemente nelle mucose), per funzione (solo le IgE possono indurre risposte efficien8 verso gli elmin8) e per durata (le IgG hanno un'emivita molto più elevata).
IgG Sono le immunoglobuline più numerose presen8 nel siero umano (70-‐75% circa delle Ig totali) e hanno stru5ura monomerica. Rappresentano la classe an8corpale più importante nella risposta immunitaria secondaria, favorendo l’eliminazione dei microrganismi patogeni, a cui si a5accano, grazie alla capacità di legarsi, a5raverso il frammento Fc, a rece5ori specifici dei macrofagi che possono quindi ingerire e distruggere i patogeni (fig. 4).
� Fig.4. Rappresentazione della modalità a5raverso cui gli an8corpi reclutano i macrofagi per l’eliminazione di patogeni.
Sono anche in grado di aKvare il sistema del complemento (famiglie di proteine circolan8 e di membrana che svolgono un ruolo importante sia nella difesa innata sia acquisita umorale contro i microorganismi) che a sua volta porta alla lisi dei patogeni bersaglio (fig.5).
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Fig. 5.Gli an8corpi si legano ad an8geni sulla superficie di un microorganismo. Le par8 Fc degli an8corpi sono accessibili alle proteine del complemento; quando vi si legano inizia una serie di reazioni a cascata che portano alla formazione di pori sulla membrana cellulare, a5raverso cui possono entrare acqua e ioni causando la morte osmo8ca della cellule.
Inoltre, grazie alla presenza di rece5ori sulla membrana delle cellule placentali con cui la coda delle IgG può legarsi, sono i soli in grado di a5raversare la placenta ed essere rilasciate nel sangue fetale per cui proteggono il neonato per alcuni mesi dopo la nascita. I neona8 acquisiscono le IgG della madre anche a5raverso il la5e in quanto possiedono un rece5ore specifico nell’epitelio intes8nale. IgM Nell’uomo sono circa il 10% delle Ig totali e hanno generalmente una stru5ura a pentamero, con aspe5o a stella. Sono formate da cinque monomeri uni8 da un polipep8de di giunzione o catena J (da joining). Si formano durante il processo di maturazione dei linfoci8 B; la forma monomerica si inserisce nella membrana dei linfoci8 B vergini (naïve) come rece5ore per l’an8gene insieme alle IgD. Successivamente al primo incontro con l’an8gene il linfocita B viene aKvato e si differenzia in plasmacellula che secerne IgM in forma pentamerica (fig 3). Sono, pertanto, i primi an8corpi prodoK nella risposta immunitaria (risposta primaria), per cui un loro riscontro rispe5o a un determinato patogeno indica, generalmente, un’infezione in a5o. IgA Rappresentano il 15-‐20% delle Ig sieriche umane ma la loro concentrazione è maggiore nelle secrezioni (saliva, la5e materno, lacrime, sudore, secrezioni respiratorie e intes8nali). Le IgA circolan8 hanno stru5ura monomerica. Le IgA secretorie sono, invece, dimeri, cos8tui8 da due monomeri uni8 da un frammento J (fig.3). La presenza delle IgA a livello delle mucose è fondamentale per impedire ai microrganismi l’adesione e la penetrazione nelle cellule epiteliali. IgD Rappresentano meno dell’1% di tu5e le Ig plasma8che. Insieme con le IgM fungono da rece5ori an8genici sulla membrana dei linfoci8 B naïve mentre altre loro funzioni biologiche sono ancora poco note. IgE Hanno stru5ura monomerica con 5 domini nella catena pesante (fig. 3). Sono presen8 nel siero solo in tracce. Le IgE sono gli an8corpi coinvol8 nelle reazioni allergiche. La parte Fc dell’IgE si fissa al rece5ore specifico presente sulla membrana dei leucoci8 basofili e dei mastoci8 o mastcellule, che sono cellule della reazione infiammatoria localizzate, sopra5u5o, nel tessuto conneKvo della pelle e delle mucose. In questo modo queste cellule diventano rece5ori per an8geni, chiama8 allergeni, normalmente innocui per la maggior parte delle persone. Dopo la prima esposizione all’an8gene, priva di sintomi, vengono prodo5e IgE specifiche. A una successiva esposizione allo stesso allergene, questo si lega alle IgE già fissate sulla superficie delle mastcellule e dei leucoci8 basofili, provocando la liberazione di un'ampia gamma di mediatori chimici, come l’istamina. La reazione allergica si manifesta nell'arco di pochi minu8 con sintomi diversi a seconda dell'apparato colpito: occhi arrossa8, secrezione nasale e starnu8 nel raffreddore da fieno, a5acchi di tosse e dispnea nell'asma bronchiale, eruzioni cutanee nelle allergie alimentari (fig. 6).
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Le IgE svolgono un ruolo importante nella risposta immunitaria contro parassi8 del gruppo degli elmin8. Le IgE sono in grado di legarsi a specifici an8geni presen8 sugli elmin8, la loro porzione Fc, invece, interagisce specificatamente e aKva rece5ori espressi dagli eosinofili i quali liberano il contenuto dei loro granuli che uccidono i parassi8
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Fig. 6. Schema della reazione allergica: l’allergene causa la produzione, da parte dei linfociti B, di IgE, queste ultime si legano ai mastociti e ai leucociti basofili; una successiva esposizione allo stesso antigene, che si lega alle IgE presenti sulla membrana dei mastociti, determina un loro rilascio di istamina e altre sostanze che causano i classici sintomi delle reazioni allergiche.
2.3 Legame anAgeni-‐anAcorpi
Gli an8corpi si legano solo a specifiche par8 degli an8geni denomina8 determinan1 an1genici o epitopi. Un anAgene di grosse dimensioni può avere molA epitopi diversi e ogni an8corpo è specifico per uno solo (fig. 7).
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La natura dei legami an8corpo-‐an8gene è non covalente e di 8po reversibile: pon8 H, legami ionici, interazione idrofobiche, interazioni Van der Waals (fig. 8). La forza complessiva di ques8 legami è chiamata affinità dell'an8corpo. Una maggiore affinità (espressa in termini della costante di dissociazione) significa che basta una bassa concentrazione di an8gene perché il legame avvenga. Durante la risposta secondaria, cara5erizzata dalla produzione di an8corpi IgG, in sos8tuzione degli an8corpi IgM cara5eris8ci della risposta primaria, avviene anche la maturazione della affinità degli an8corpi, e vengono seleziona8 i cloni che producono le IgG con affinità sempre maggiore (per approfondire, vedere la dispensa sul Sistema immunitario).
3. ANTICORPI MONOCLONALI E POLICLONALI 3.1 Produzione di anAcorpi policlonali
L’an8corpo può essere prodo5o contro cellule ba5eriche vive o morte (uccise al calore per 30 minu8 in modo da esporre le molecole che cos8tuiscono la parete), contro specifici prodoK ba5erici come tossine o enzimi e contro frazioni cellulari specifiche (ribosomi, oligosaccaridi, lipoproteine, glicoproteine) [Hampton et al., 1990]. Il modo più semplice, economico e veloce per o5enere an8corpi in grado di riconoscere una certa sostanza è quello di immunizzare un animale, aspe5are la reazione immunitaria ed estrarre infine gli an8corpi dal siero (fig.9). Gli animali più usa8 sono: topi, conigli, pecore, capre. La selezione dell’animale dipenda dalla quan8tà di an8corpi che si vogliono o5enere. L’animale più u8lizzato per la produzione di an8corpi è il coniglio che è rela8vamente semplice ges8re in laboratorio e da cui si o5engono buone quan8tà di siero. Alcuni ba5eri patogeni sono tossici anche per il coniglio sopra5u5o se inie5a8 per
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Fig. 7. Antigene con quattro epitopi diversi rappresentati da forme e colori diversi. I singoli epitopi vengono riconosciuti da anticorpi diversi (Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4).
Fig. 8. Tipi possibili di legami deboli che si possono formare tra an8gene e an8corpo: pon8 idrogeno, legami ionici, interazioni idrofobiche e interazioni di Van der Waals.
endovena (shock anafilaKco), ciò può essere evitato con immunizzazioni so5ocutanee o intramuscolare [Hampton et al.,1990] o con estraK ba5erici uccisi al calore.
� La produzioni di an8corpi policlonali (contenen8 an8corpi reaKvi contro più di un epitopo e per questo mul8specifici) ad alto 8tolo, dipende da diversi fa5ori tra cui uno dei più importan8 è la presenza degli an8geni in circolo per un periodo con8nuato di diverse seKmane. Ciò può essere o5enuto in diversi modi:
-‐ con iniezioni endovenose mul8ple con dosi crescen8 di an8gene (con tempi brevi tra un’iniezione ed un’altra per evitare la distruzione dell’an8gene da parte del sistema immunitario).
-‐ con iniezioni so5ocutanee o intramuscolari: tale metodica garan8sce un lento rilascio dell’an8gene nel sangue assicurando, con un minor numero di iniezioni di richiamo, una presenza con8nua per diverse seKmane [Hampton et al., 1990].
Generalmente le procedure di immunizzazione più rapide portano ad un minor 8tolo ma ad una maggior specificità del siero immune, che viene chiamato an8siero.
Le principali globuline o5enibili con i normali metodi sono IgM ed IgG. Le prime sono le più ada5e per le reazioni di agglu8nazione; le seconde sono invece idonee per i test ELISA [Hampton et al., 1990].
La determinazione del 8tolo di un an8corpo (o di un an8corpo) è data dalla massima diluizione del siero alla quale è ancora osservabile una reazione an8corpo-‐an8gene (Ab-‐Ag). Un buon siero ha un 8tolo di 1:500 -‐ 1:1000 anche se non è eccezionale o5enere an8sieri (o an8corpi) con 8tolo 1:6000 [Hampton et al, 1990] .
3.2 Produzione di anAcorpi monoclonali
Per an8corpi monoclonali si intende una popolazione omogenea di an8corpi prodoK da un clone cellulare (ibridoma) o5enuto per fusione di un linfocita B (proveniente dalla milza o dai linfonodi di un animale immunizzato e quindi in grado di produrre un an8corpo specifico, ma che ha una durata limitata di vita in coltura) con una cellula di mieloma (linea tumorale di plasmacellule che cresce in coltura con8nua8vamente). La fusione tra le membrane (fig.10) delle due cellule si oKene in presenza di un promotore di fusione delle membrane cellulari, il polie8lenglicole. Dopo la fusione, si fanno crescere le cellule in un terreno di coltura seleKvo in cui le cellule di mieloma non fuse non riescono a crescere (i linfoci8 non fusi non sono in grado di crescere in coltura). Cresceranno solo gli ibridomi, cellule capaci di proliferare in vitro e che secernono an8corpi monospecifici.
Gli ibridomi vengono so5opos8 a screening per la ricerca degli an8corpi specifici di interesse e quelli scel8 vengono avvia8 alla conservazione o alla produzione in massa [Grange et al., 1987].
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Fig. 9. Produzione di an8corpi policlonali: (a sinistra) iniezioni mul8ple dell’an8gene purificato in un animale opportuno; (a destra) prelievo del sangue a cui segue la purificazione degli an8corpi policlonali presen8 nel siero.
Rispe5o alla produzione di an8corpi policlonali, il processo richiede più tempo e una tecnologia più costosa e raffinata, ma una volta o5enuto l’ibridoma può essere usato come sorgente di an8corpi monoclonali, sempre iden8ci, pra8camente indefinitamente. �
4. TEST ELISA
Ci sono diversi varian8 del test ELISA, che si differenziano secondo la componente che si vuole rilevare. Nel test dire5o viene determinata la presenza dell'anAgene (ELISA dire5o o a "sandwich"), in quello indire5o, la presenza di anAcorpi specifici contro l'an8gene.
4.1 Saggio direHo o a "sandwich”
� Secondo tale procedura, l'an8gene è intrappolato tra due stra8 di an8corpi e, per questo mo8vo, tale metodo è anche noto come ELISA sandwich. Il campione è aggiunto ai pozzeK di una piastra per micro8tolazione di polis8rene, precedentemente rives8ta con an8corpi specifici per l'an8gene che si ricerca. Se l'an8gene (VIRUS, BATTERIO O PROTEINA) è presente nel campione, esso verrà ca5urato dal sito legante esposto dagli an8corpi immobilizza8 nella piastra. Dopo aver allontanato il materiale non legato mediante una serie di lavaggi, si aggiunge un secondo an8corpo coniugato all'enzima. Il secondo an8corpo riconosce un determinante an8genico diverso sullo stesso an8gene. In seguito ad un ulteriore lavaggio, la quan8tà di an8gene originariamente sequestrato nella reazione viene determinata aggiungendo il substrato dell'enzima. La quan8tà del prodo5o enzima8co, resa evidente dalla produzione di un colore, è proporzionale a quella dell’an8gene ca5urato.
NB: Essendo le immunoglobuline delle proteine, immunizzando animali con immunoglobuline umane (o porzioni della molecola an8corpale), si possono o5enere an8corpi contro gli an8corpi umani, che vengono chiama8 an8corpi secondari.
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Fig.10. Produzione di an8corpi monoclonali: i linfoci8 B di un animale immunizzato con l’an8gene vengono fusi con cellule di mieloma (un tumore delle plasmacellule) per o5enere gli ibridomi che verranno seleziona8 su terreno seleKvo. Ogni ibridoma produrrà un solo 8po di an8corpo.
4.2 Saggio indireHo
� Per rilevare, invece, an8corpi nel siero umano si impiega il test ELISA indire5o. Per eseguire un test ELISA indire5o, piastre per micro8tolazioni vengono rives8te di una preparazione di an8geni. Viene quindi aggiunto il siero del paziente a diverse diluizioni e la miscela viene incubata per consen8re agli an8corpi specifici di legare gli an8geni. Per rilevare la presenza dei complessi an8gene-‐an8corpo viene poi aggiunto un secondo an8corpo. Questo secondo an8corpo è cos8tuito da una preparazione di IgG an8-‐an8corpi umani, coniuga8 con l'enzima. L'aKvità enzima8ca viene rilevata, in seguito all'aggiunta del substrato specifico, misurando la intensità di una colorazione. Il colore o5enuto è proporzionale alla quan8tà del secondo an8corpo legato. Il legame del secondo an8corpo è l'indicazione che gli an8corpi presen8 nel siero del paziente hanno riconosciuto gli an8geni presen8 sulla piastra. Ciò indica che il paziente possiede an8corpi contro l'an8gene e che, pertanto, è stato infe5ato dal virus o dal ba5erio. Un test ELISA indire5o viene impiegato per rilevare la presenza di an8corpi (sieroposi8vità) contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV).
5. ENZIMI E SUBSTRATI 5.1 Enzimi coniugaA agli anAcorpi
Il metodo più u8lizzato per la rivelazione dell’avvenuto legame an8gene-‐an8corpo consiste nella coniugazione dell’an8corpo secondario con una molecola che può essere dire5amente rivelata.
Gli an8corpi vengono coniuga8 a enzimi in grado di conver8re un substrato incolore in un prodo5o colorato.
Gli enzimi più u8lizza8 sono:
• Alkaline phosphatase: per an8corpi coniuga8 alla fosfatasi alcalina si usa in genere il substrato p-‐nitrophenylphosphate (pNPP), che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a 405-‐410 nm.
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• Peroxidase: per gli an8corpi coniuga8 alla perossidasi si possono scegliere diversi substra8, tra i più u8lizza8:
TMB (3,3',5,5'-‐tetramethylbenzidine) che sviluppa un colore blu che ha un assorbanza massima tra 370 nm e 652 nm.
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OPD (o-‐phenylene diamine ), sviluppa un colore arancio scuro misurabile a 492 nm.
ABTS( 2,2-‐azinodiethyl-‐benzthiazoline sulfonate), che sviluppa un colore blu-‐verde misurabile a 405-‐410 nm.
5.2 SubstraA enzimaAci
Cara5eris8che dei substra8:
• stabile
• sicuro, non tossico
• poco costoso
• sia il substrato che il prodo5o devono essere solubili
6. PRINCIPALI APPLICAZIONI DEL TEST ELISA Elevata sensibilità e specificità, minor costo, assenza di rischi deriva8 dall’esposizione a radiazioni, pra8cità e versa8lità sono alcuni elemen8 che devono essere presi in considerazioni nella scelta della tecnica di analisi. Tra tuK i metodi a5ualmente a disposizione i test ELISA rispondono a ques8 requisi8, oltre a consen8re di realizzare, in breve tempo, analisi su grandi numeri di campioni, in modo semplice ed economico, con buona riproducibilità e facilità nell'interpretazione dei risulta8. . Lo sviluppo della biologia molecolare e la produzione di an8corpi monoclonali, ha permesso, negli ul8mi anni, di disporre di reagen8 di diagnos8ca di grande sensibilità e specificità, anche in forma di KITS, di facile u8lizzazione ed interpretazione. Per ques8 stessi mo8vi il metodo ELISA è u8lizzato, oltre che nella diagnos8ca, anche nella ricerca.
6.1 MalaSe infeSve
Metodi d’indagine mediante test ELISA
Per sapere se si è già contra5o il patogeno basta fare un esame del sangue (o di altri fluidi biologici), alla ricerca della presenza degli anAgeni (metodo direHo) o degli anAcorpi specifici (metodo indireHo). In questo ul8mo caso si cercano due 8pi di immunoglobuline:
Le IgM sono gli an8corpi che si producono nella fase acuta della malaKa, quindi sono rilevabili da subito; restano aKvi per tu5a la durata dell’infezione, dopodiché i valori scendono progressivamente, ma la loro presenza con8nuerà ad essere rilevata nel sangue ancora per 3-‐4 mesi circa (anche se a volte ci sono casi di persistenza della IgM). Le IgG si iniziano a produrre solo 1-‐2 seKmane dopo che è avvenuta l’infezione, ma resteranno presen8 nel’organismo per tu5a la vita, come ‘memoria’ dell’infezione avvenuta, e per questo saranno sempre rilevabili nel sangue. I risulta8 possono essere: IgG assenA IgM assenA: assenza esposizione. In caso di incertezza clinica i pazien8 devono essere monitora8 nel tempo.IgG presenA IgM assenA: infezione pregressa. IgG assenA IgM presenA: infezione in fase molto iniziale. IgG presenA IgM presenA: infezione acuta.
Alcune malaKe infeKve che possono essere diagnos8cate mediante test ELISA: HIV, Adenovirus, Bordetella pertussis / toxin, Candida albicans, Chagas, Clamidia, Coxiella burne8i, Coxsackie, Citomegalovirus, Proteina C reaKva, Dengue, Echinococcus, Epstein-‐Barr-‐Virus, FSME, Epa8te A,
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Epa8te B, Epa8te C, Epa8te E, Herpes, Influenza, Legionella pneumophila, Leptospira, MalaKa di Lyme, Malaria, Micoplasmi, Parvovirus B19, SARS, Strongyloides, Tetano,Toxoplasma, Treponema pallidum (sifilide), Mycoplasma e Ureaplasma.
Test Elisa vengono usa8 anche per rilevare infezioni in animali.
Infezione da HIV. Metodi di indagine: 8pi di Test
I test comunemente u8lizza8, a5raverso un semplice prelievo di sangue sono il test ELISA e il Combo Test.
• Il test ELISA non ricerca dire5amente il virus nel sangue, ma rileva gli an8corpi an8-‐HIV, che si sviluppano a seguito dell’infezione. Poiché l’organismo non produce immediatamente gli an8corpi, vi è dunque un periodo in cui il test non è in grado di diagnos8care l’infezione (Periodo Finestra). A seguito di un comportamento a rischio, l’indicazione è quella di effe5uare il test ad un mese di distanza, periodo sufficiente a riscontrare il contagio nella maggioranza dei casi. Se l’esito del test è nega8vo, l’indicazione è quella di ripetere il test a 3 mesi dal comportamento a rischio per o5enere un risultato defini8vo. Se il risultato è posi8vo significa che la persona è venuta a conta5o con il virus, ma potrebbe non avere contra5o la malaKa. Sinonimi: Test Hiv-‐Ab, test di terza generazione.
• Il ComboTest, oltre ad individuare gli an8corpi an8-‐HIV, è in grado di rilevare la presenza di una par8colare proteina virale (l’an8gene p24) che compare e aumenta significa8vamente dopo pochi giorni dal contagio. Il Periodo Finestra è in questo caso rido5o a un mese. C'è da precisare che il test dell’an8gene p24 è rela8vo solo all'HIV-‐1 e non all'HIV-‐2. Sinonimi: Test Combinato, Test Hiv-‐Ag/Ab, test di quarta generazione.
Prima che un risultato posi8vo di un test ELISA venga riferito all'interessato, il dato viene confermato con un altro test chiamato WESTERN BLOT.
• WESTERN BLOT (WB):Questo test ricerca gli anAcorpi nel siero (come il test ELISA) ma, in più, idenAfica le diverse specificità degli anAcorpi presenA, che è molto importante per stabilire la cura e per un inquadramento generale dell'evoluzione della infezione.
Un test ELISA posi8vo, confermato da un WESTERN BLOT (WB) posi8vo esprime con certezza che la persona ha contra5o la infezione, quindi, è infe5a ed infe5ante. L'essere sieroposi8vi non significa avere l'AIDS. La diagnosi di AIDS si basa infaK su parametri clinici e su esami per valutare quanto velocemente il virus si mol8plica (carica virale o viral load), o quanto il sistema immunitario è stato danneggiato (conta dei linfoci8 CD4+ o 8pizzazione linfocitaria).
Test di biologia molecolare: Si tra5a di una PCR (qualita8va e quan8ta8va) per ricercare nel siero il RNA virale. L'importanza di questo esame risiede nel fa5o che è in grado di individuare la presenza dell'HIV fin dal "periodo finestra”.
Per monitorare l’evoluzione della malaKa si u8lizza il dosaggio virale (e provirale) mediante PCR per determinare la carica virale; il conteggio dei linfoci8 CD4 (determinazione del numero di linfoci8 CD4 presen8 nell'unità di volume di sangue) che nelle persone con infezione da HIV può calare dramma8camente, rispe5o al valore normale intorno a 1.100/µl. Le persone con un numero rido5o di linfoci8 CD4 vanno incontro alla possibile comparsa di infezioni opportunis8che. Quando il valore della conta dei CD4 scende al di so5o di 200, è raccomandato l'inizio della profilassi contro alcune di tali infezioni.
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6.2 Tossine Le micotossine, nel loro significato le5erale e più generale, sono sostanze chimiche tossiche prodo5e da funghi. Alcune micotossine (amani8na, muscarina, ecc..) sono responsabili dei fenomeni di avvelenamento causa8 dal consumo di alcune specie di macromice8, cioè di "funghi". Altre micotossine (aflatossine, tricoteceni, fumonisine, ecc..) sono prodoK da muffe e altre specie microscopiche, e sono responsabili di fenomeni di tossicità acuta e cronica, a causa della loro diffusione come contaminan8 di alimen8 o, più raramente, ambientali. Si possono accumulare come prodoK secondari di muffe dei generi Aspergillus, Penicillium e Fusarium che contaminano le colture o le derrate alimentari. EffeS sulla salute dell'uomo ed animaliLe micotossine posseggono azione cancerogena, mutagena e teratogena sulla salute umana, come risulta dalla tabella seguente:
Metodi di indagine
In generale, i metodi anali8ci per la determinazione delle micotossine si possono classificare come segue:
-‐ biosensori: l'elemento biologico interagisce con il substrato da analizzare e un sistema di trasduzione (sensore) converte la risposta biochimica in un segnale ele5rico
-‐ metodi cromatografici
-‐ test immunologici (ELISA, radioimmunologici, immunofluorescen8, basa8 su colonna di immunoaffinità).
Sono disponibili test ELISA (test dire5o) per la determinazione di diverse micotossine. Sono disponibili test di screening qualita8vi per la verifica della presenza o assenza di una determinata micotossina e anche kit quan8ta8vi, che possono anche fornire indicazioni del livello di concentrazione.
Aflatossina B1 Cancerogeno, epatotossico, immunosoppressore
Ocratossina A Nefrotossico, teratogeno, immunosoppressore, cancerogeno
Fumonisina B1 Neurotossico, cancerogeno, citotossico
Tricoteceni Immunosoppressore, dermatotossico, emorragico
Zearalenone Estrogenosimile
Ergotina Neurotossico
Tossina Applicazioni. Dosaggio in:
Aflatossina B1 Granaglie, cereali, foraggi, frutta secca, alimenti e mangimi
Aflatossina M1 Latte, latte in polvere, formaggi
Aflatossina M1, per urina
Urina
Deossinivalenolo (DON)
Granaglie, cereali, foraggi, alimenti e mangimi
Ocratossina A Granaglie, cereali, foraggi, alimenti e mangimi
Vini, mosti e succhi d’uva
Vini, mosti, succhi d’uva e bevande alcoliche e non alcoliche
Caffè verde, caffè tostato, caffè istantaneo, cacao in polvere, burro di cacao e spezie
Siero umano e animale, latte umano e animale
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6.3 Droghe
Sono adaK per l’analisi di droghe in quasi tuK i 8pi di campioni quali: sangue, urina, capello, saliva • Il sangue cos8tuisce la matrice biologica di elezione per le indagini cliniche e forensi. La concentrazione
ema8ca e/o plasma8ca della sostanza ricercata, infaK, consente di stabilire o di escludere la recente assunzione ed è dire5amente correlabile allo status psicofisico del sogge5o al momento del prelievo.
• L’esame delle urine può essere eseguito per mo8vi di semplicità, rapidità o di non invasività; la posi8vità dell’analisi indica che la sostanza è stata assunta da alcune ore ad alcuni giorni prima del prelievo, ma non può correlare l’eventuale stato di alterazione psico-‐fisica ad una recente assunzione. In caso di posi8vità del campione urinario ed in assenza di prelievo ema8co o salivare, non vi è la certezza dell’eventuale stato di alterazione psico-‐fisica in quanto può non essere noto il tempo trascorso tra il momento dell’assunzione della sostanza e quello del prelievo urinario.
• Studi recen8 sul fluido orale hanno dimostrato che la maggior parte delle droghe d’abuso (oppioidi, amfetamine, cocaina, ecc.) e dei farmaci assun8 diffondono nel fluido orale per trasferimento passivo dal torrente circolatorio e le concentrazioni salivari correlano con quelle ema8che (tranne per il principio aKvo della cannabis (Δ9 -‐tetraidrocannabinolo, Δ9 -‐THC o THC) che non diffonde dal sangue alla saliva a causa della sua scarsa idrosolubilità e basicità. L’analisi della saliva consente di determinare una droga d’abuso o un farmaco in un periodo di tempo breve, compreso tra meno di un’ora e 24 ore dall’assunzione, u8lizzabile per verificare l’eventuale stato di alterazione psico-‐fisica del sogge5o.
• I capelli hanno velocità di crescita variabile tra 0.8 e 1.4 cm/mese e possono essere considera8 come “memoria” delle sostanze tossiche presen8 nell’organismo al momento della crescita del pelo. I metalli, gli altri xenobio8ci ed i loro metaboli8 presen8 nell’organismo vengono incorpora8 in misura variabile nella matrice chera8nica durante la crescita del capello e/o pelo e le loro concentrazioni possono essere correlate ai periodi di tempo (mesi, anni) in cui sono state assunte le sostanze tossiche. Nell’interpretazione del dato anali8co è difficile risalire con assoluta precisione al momento esa5o di assunzione di una droga d’abuso, tu5avia è possibile che l’analisi segmentale dei capelli nello stesso individuo possa collocare temporalmente la frequenza delle assunzioni, con una certa variabilità legata alla differente velocità di crescita.
Metodi di indagine
Le metodologie anali8che per la determinazione di laboratorio delle sostanze d’abuso, in base ad esigenze anali8che, procedurali, organizza8ve, ed economiche si dis8nguono in due gruppi: • test di screening (iniziali o di I livello) • test di conferma (o di II livello) I primi sono test che rispondendo prevalentemente a requisi8 di economicità, velocità, standardizzazione, efficacia ed efficienza, perme5ono la ges8one di numerosi campioni in tempi brevi. Le metodiche immunochimiche, applicate su analizzatori automa8ci, a5ualmente più u8lizzate per i test di screening sulle matrici citate sono di diverso 8po ma quello preferenzialmente usate su fluido orale è il test ELISA direHo. I test di II livello (procedure di estrazione del principio aKvo e/o dei suoi metaboli8, in fase liquida o solida, seguite dall’analisi cromatografica accoppiata alla spe5rometria di massa) rispondono prevalentemente a requisi8 di specificità e consentono la conferma della posi8vità dei campioni o la verifica di eventuali falsi posi8vi ai test di screening. Le metodiche cromatografiche u8lizzate per i test di conferma sono la Gas Cromatografia o Cromatografia liquida accoppiata a Spe5rometria di Massa. Le droghe indagate sono:Anfetamina, Barbiturici, Buprenorfina, Benzodiazepine, Cannabinoidi, Cariosoprodol, Fentanyl, Ketamina, Cocaina, Metadone, Metamfetamina, MeAlfenidato, Oppiacei/Morfina, Ossicodone, Fenciclidina, Propossifene, TCA, Tramadolo.
Fumonisina (B1, B2, B3) Mais e derivati
Zearalenone Granaglie, cereali e pane
Tossina T-2 Granaglie, cereali, foraggi, alimenti e mangimi
Staphylococcus aureus e enterotossine
Latte, salsicce, maionese
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6.4 Allergeni
Test cutanei Il prick test è il test cutaneo u8lizzato per determinare se una sostanza specifica provoca infiammazione allergica. Nel prick test, alcune gocce di allergene purificato vengono posizionate sulla superficie cutanea e successivamente la cute viene scalfita con una lance5a monouso al fine di lasciar penetrare l'allergene a5raverso gli stra8 più superficiali della cute. Dopo un'a5esa di circa 15-‐20 minu8 si valuta la reazione cutanea o5enuta. In caso di reazione posi8va è possibile osservare una reazione cara5erizzata da pomfo (area circoscri5a di edema cutaneo) intensamente pruriginoso, contornato da un alone di eritema. Test emaAci Questi esami hanno bisogno di tempi più lunghi perché dal prelievo all’elaborazione dei risultati possono passare diversi giorni. Sono però a impatto zero perché non si sottopone il paziente alla sostanza a cui può essere intollerante. Si va a valutare la presenza delle IgE specifiche mediante test immunoenzima8ci (ELISA) o immunofluorimetrici (CAP-‐test).
Determinazione analiAca degli allergeni In data 22 novembre 2011 è stato emanato il nuovo Regolamento Comunitario n. 1169/2011 in materia di e8che5atura degli alimen8. Lo scopo principale del regolamento europeo, è quello di garan8re una maggiore trasparenza nei confron8 del consumatore finale riguardo alle cara5eris8che del prodo5o ed alle rela8ve informazioni.
Il nuovo regolamento impone una e8che5atura dei prodoK alimentari chiara, comprensibile e leggibile che deve prevedere anche nell’elenco degli ingredien8 la presenza di determinaA allergeni evidenzia8 con cara5eri grafici par8colari (dimensioni, s8le, colore dello sfondo), la specifica degli olii vegetali presen8, ecc. L’indicazione della presenza degli allergeni diventa obbligatoria anche per i prodoK sfusi e per quelli somministra8 nei ristoran8, mense e bar.
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7. LABORATORIO 7.1 Scopo dell’esperimento
Individuare la presenza di un an8gene (metodo dire5o) o di un an8corpo specifico (metodo indire5o) con il metodo ELISA.
7.2 Materiali a disposizione:
-‐ striscia di pozzeK in polis8rene dove avverrà la reazione
�
- prove5a con an8gene
- prove5a con an8corpi I contro l’an8gene (IgG)
- prove5a con an8corpi II (IgG contro parte costante delle IgG) che ha legato l’enzima perossidasi
- prove5a con PBS (tampone fosfato salino) per lavaggi
- prove5a con TMB ((3,3',5,5'-‐tetramethylbenzidine): substrato della perossidasi
7.3 Procedura metodo direHo (determinazione anAgeni)
1) Segnare i pozzeK per controllo posi8vo e nega8vo con + e – e gli altri pozzeK con una sigla che iden8fichi i campione da testare: 3 pozzeK per campione
�
2) trasferire, con la micropipe5a opportuna, 50 μl di an8corpo in tuK i pozzeK.
3) lavare due volte i pozzeK riempiendoli con PBS e scaricando su fogli di carta assorbente il liquido
4) nei primi 3 pozzeK 50 μl d di an8gene (controllo posi8vo); 50 μl di PBS (controllo nega8vo) nei successivi 3 pozzeK; 50 μl di campione negli altri pozzeK. Lasciare agire 5 minu8.
N.B. cambiare puntale alla micropipe5a ad ogni nuovo reagente
�
5) lavare due volte i pozzeK riempiendoli con PBS e scaricando su fogli di carta assorbente il liquido
�
4) aggiungere 50 μl di an8corpo +E a tuK i pozzeK (facendo a5enzione a non toccare l’interno dei pozzeK) e lasciare agire per 5 minu8
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+ + +_- - - A A A B B B
�
5) lavare 3 volte i pozzeK con PBS come riportato precedentemente
6) aggiungere 50 μl di TMB (substrato) a tuK i pozzeK e osservare la reazione.
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7.4 Procedura metodo indireHo (determinazione anAcorpi)
1) Segnare i pozzeK per controllo posi8vo e nega8vo con + e – e gli altri pozzeK con una sigla che iden8fichi i campione da testare: 3 pozzeK per campione
�
2) trasferire, con la micropipe5a opportuna, 50 μl di an8gene in tuK i pozzeK. Lasciare agire 5 minu8.
�
3) lavare due volte i pozzeK riempiendoli con PBS e scaricando su fogli di carta assorbente il liquido
� � �
4) aggiungere 50 μl di an8corpo I nei primi 3 pozzeK (controllo posi8vo); 50 μl di PBS (controllo nega8vo) nei successivi 3 pozzeK; 50 μl di campione (siero) negli altri pozzeK. Lasciare agire 5 minu8.
�
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Anticorpo+E
+ + +_- - - A A A B B B
3 pozzetti Anticorpo I – 3 pozzetti PBS – 3 pozzetti Siero pazienti
PBS
5) lavare 2 volte i pozzeK con PBS come riportato precedentemente
6) aggiungere 50 μl di an8corpo II (an8corpo+enzima) a tuK i pozzeK (facendo a5enzione a non toccare l’interno dei pozzeK) e lasciare agire per 5 minu8
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7) lavare 3 volte i pozzeK con PBS come riportato precedentemente
8) aggiungere 50 μl di TMB (substrato) a tuK i pozzeK e osservare la reazione.
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8. TEST ELISA SCENARI
1) TEST HIV
"L’untore con l’Hiv ne ha contagiate 33"( Il tempo 27/04/2016)
È incredibilmente ampio il bilancio delle viFme di Valen1no T… Il 30enne romano accusato di «aver cagionato volontariamente lesioni personali gravissime», avrebbe contagiato con il virus Hiv 33 persone…
L’indagato, già dal 2006, era consapevole di essere sieroposi1vo ma avrebbe avuto circa 50 rappor1 sessuali non proteF, con altreSante donne ignare della sua malaFa…
Nonostante la «consapevolezza di essere affeSo dal virus dell’Hiv», come scrivono gli inquiren1, per 9 anni l’uomo avrebbe avuto rappor1 sessuali non proteF senza informare le sue partner del rischio a cui andavano in contro…
Il 30 seSembre del 2014 Valen1no avrebbe inviato a una ragazza, tramite Whatsapp, un falso cer1ficato medico rilasciato dall’ospedale Sant’Eugenio. L’obieFvo dell’indagato, secondo la procura, era quello di rassicurare falsamente una ragazza che aveva rifiutato di pra1care un rapporto senza u1lizzare le opportune protezioni. La viFma successivamente aveva scoperto di aver contraSo il virus e lo denunciò. Il 24 novembre è stato messo in prigione in isolamento. La no1zia venne riportata in TV e sui giornali.
In seguito alla diffusione della no8zia si recano in ospedale 2 persone che hanno avuto rappor8 sessuali non proteK con le viKme dell’untore per verificare la loro condizione. In ospedale viene fa5o un prelievo di sangue e voi dovete, tramite test ELISA, verificare la sieroposi8vità o nega8vità dei paziente.
Spunto di riflessione: E’ giusto che sia preservato l’anonimato del paziente risultato posi8vo al test dell’HIV?
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2) GUIDA SOTTO L’EFFETTO DI STUPEFACENTI
Due giovani, uno su una automobile e uno su uno scooter, sono rimas8 coinvol8 in un incidente stradale in cui sono rimas8 lievemente feri8. La polizia stradale intervenuta ha trovato i due giovani in stato alterato.
U8lizzando il “Test An8droga” hanno rilevato la posi8vità dei due giovani.
Il test an1droga è’ un test immunologico rapido cromatografico per l’individuazione qualita1va di più droghe e loro metaboli1 nella saliva. E’uno dei droga test No1ficato presso il Ministero della Salute con una aSendibilità del 98% con risultato in 5 minu1 dopo la raccolta del campione della saliva. Il test rileva: Oppiacei (40ng/ml), Cocaina (30 ng/ml), Cannabinoidi (THC) (25ng/ml), Anfetamine (40ng/ml), Metanfetamine (40ng/ml) compreso MDMA Ecstasy (50ng/ml) e Ossicodone/Idrocodone (40ng/ml). Questo test fornisce solo un dato preliminare che deve essere poi confermato.
I giovani sono sta8 condoK presso il locale Pronto Soccorso per eseguire le medicazioni necessarie e per compiere esami approfondi8 in grado di verificare la posi8vità alle droghe. Si ricorda che nel caso di guida in stato di ubriachezza o so5o l’effe5o di stupefacen8, le sanzioni previste sono par8colarmente gravi: revoca della patente di guida, confisca del veicolo ed arresto sino ad un anno. (art. 187 c.d.s.).
Dovete verificare mediante test ELISA se i due giovani sono so5o l’effe5o di cocaina.
Spunto di riflessione:
Preoccupata per “il progressivo dilagare della droga e della cultura dello sballo che sta rappresentando in Umbria una pesante emergenza”, il capogruppo dell'Udc, Sandra Monacelli ha presentato una mozione aSraverso la quale impegnare la Giunta regionale a “MeSere in aSo strumen1 di prevenzione nelle scuole, aFvando, di concerto con le Asl e gli Is1tu1 scolas1ci, test an1droga per gli alunni di tuSe le classi delle scuole medie inferiori e superiori”.
3) MICOTOSSINE NEL LATTE
Le micotossine sono sostanze tossiche prodo5e dal metabolismo di funghi (o muffe). Le muffe del 8po Aspergillus, Fusarium e Penicillium sono le principali produ5rici di tossine ritenute dannose. Si sviluppano in par8colari condizioni su foraggi insila8, cereali e mangimi.
EffeS sulla salute d'uomo ed animaliLe micotossine possiedono azione cancerogena, mutagena e teratogena sulla salute umana. Le più pericolose sono l’aflatossina B1 (cancerogeno, epatotossico, immunosoppressore) e la fumosinina B1 (Neurotossico, cancerogeno, citotossico). Tra gli alimen8 d'origine animale, e quindi d'interesse per l'alimentazione umana, il la5e e i suoi deriva8 sono i prodoK più frequentemente contamina8 dalla presenza di micotossine, a causa del trasferimento di ques8 metaboli8 dai mangimi contamina8 di cui si nutrono le bovine.
LaHe con aflatossine (traHo da Il faHo alimentare)La vicenda inizia il 12 dicembre 2013 quando la La5eria Soligo di Treviso res8tuisce alle La5erie Friulane, una par8ta di 3.504 confezioni di la5e perché “non conforme” (l’unica tra i dieci acquiren8 del medesimo lo5o). Il sistema di autocontrollo dell’azienda trevigiana ha rilevato la presenza di aflatossine in quan8tà cinque volte superiori ai limi8 di legge. A questo punto la procura di Udine apre un’indagine che affida al Nucleo an8 sofis8cazioni dei carabinieri (Nas). Il lavoro di inves8gazione dura cinque mesi e porta alla luce almeno sei illeci8. Nelle frodi erano coinvol8 allevatori e personale del Consorzio La5erie Friulane. Il reato consisteva nel miscelare par8te di la5e contaminato da aflatossine con la5e des8nato all’alimentazione umana, in questo modo si diluiva la presenza delle tossine o5enendo un prodo5o con valori entro i limi8 di legge. …. Quando la soglia di aHenzione per l’aflatossina nel la5e è superiore a quella consen8ta le aziende devono avvisare il Servizio veterinario delle Ausl. Se invece si supera il limite di legge oltre alla segnalazione all’autorità competente, l’azienda non può per diversi giorni conferire il la5e, e quello contaminato va smal8to.
Fai parte dei NAS e devi verificare due par8te sospe5o di la5e per verificare la presenza di aflatossina B1 con il test ELISA e stabilire se il la5e è innocuo oppure contaminato.
Spunto di riflessione:
Mais OGM Bt è preservato dall’a5acco di funghi e quindi risulta meno contaminato da micotossine ! 19
4) ALLERGENI
Carmelo, 57 anni, si presenta in Pronto soccorso con dolore toracico, nausea, eritema e prurito diffusi. La sintomatologia è comparsa circa 15 minu8 dopo l’assunzione di una compressa di amoxicillina/acido clavulanico 1 g per una odontalgia.
L'amoxicillina è un an1bio1co appartenente alla classe dei β-‐laSamici, gruppo delle penicilline semisinte1che. L'amoxicillina agisce da baSericida inibendo la sintesi del pep1doglicano (parete cellulare del baSerio).L’acido clavulanico è un inibitore irreversibile delle beta-‐laSamasi, enzimi che idrolizzano l’anello beta-‐laSamico dell’amoxicillina e di altri an1bio1ci beta-‐laSamici susceFbili a tali enzimi di inaFvazione.In pra1ca l’acido clavulanico, privo di aFvità an1baSerica, consente il dispiegarsi dell’azione an1baSerica dell’amoxicillina anche su ceppi produSori di beta-‐laSamasi che altrimen1 sarebbero resisten1 a tale an1bio1co.
In Pronto soccorso il pazien8 è immediatamente tra5ato con cor8costeroidi e an8staminici per via endovenosa.
Viene svolto il test ELISA sul siero dei paziente per individuare la presenza di IgE specifiche verso l’allergene (amoxicillina o acido clavulanico) e verificare se ha avuto una reazione anafilaKca da an8bio8co.Sostanze che possono provocano reazioni allergiche: farmaci; alimen1 come il laSe di mucca, le arachidi, le uova, i crostacei, le noci, il grano, il riso e soia; pollini; acari della polvere; peli di animali (saliva)….
N.B. Le e1cheSe alimentari contengono l’elenco degli ingredien1 in nere;o i potenziali allergeni.
Spunto di riflessione: abuso di an1bio1ci e loro conseguenze
9. SITOGRAFIA e BIBLIOGRAFIA
h5ps://www.youtube.com/watch?v=iVMIZy-‐Y3f8&ebc=ANyPxKrejGiteIWjEBVFRYutcc-‐Z9wvp�_0Ux3U-‐9KB67xU_z-‐B5_oEbj4FSSicsJ6wDq28LFx4
h5p://highered.mheduca8on.com/sites/0072556781/student_view0/chapter33/anima8on_quiz_1.html
h5p://www.sumanasinc.com/webcontent/anima8ons/content/elisa.html
h5p://www.biology.arizona.edu/immunology/ac8vi8es/elisa/main.html
h5p://media.hhmi.org/biointerac8ve/vlabs/immunology/index.html
h5p://www.bio-‐rad.com/LifeScience/jobs/2004/04-‐0522/04-‐0522_ELISA.html
h5p://www.learnerstv.com/anima8on/anima8on.php?ani=406&cat=biology
h5p://www.elisa-‐an8body.com/ h5p://ed.ted.com/lessons/how-‐do-‐pregnancy-‐tests-‐work-‐8en-‐nguyen h5p://www.springer.com/cda/content/document/cda_downloaddocument/1802s.swf?SGWID=0-‐0-‐45-‐753246-‐0 h5p://www.slideshare.net/vishwanth555/elisa-‐ria h5p://www.slideshare.net/AnitaSingh13/elisa-‐ppt?related=1 h5p://www.slideshare.net/wadi_oo/elisa-‐enzymelinked-‐immunosorbent-‐assay?next_slideshow=1 h5p://www.slideshare.net/amitgajjar85/elisa-‐14027063 h5p://highered.mheduca8on.com/sites/0072556781/student_view0/chapter33/anima8on_quiz_1.html h5ps://www.youtube.com/watch?v=oyiz2lci4dY h5ps://www.youtube.com/watch?v=6Ue1Hd3dyaQ h5ps://www.youtube.com/watch?v=Jmrv137VQIA h5ps://www.youtube.com/watch?v=qHNXCBgSQl8 h h5p://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm 5p://technologyinscience.blogspot.it/2011/12/elisa-‐protocol-‐types-‐of-‐elisa.html#.Vr8yAPnhDs2
h5p://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm
h5p://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp
h5p://www.uniroma2.it/didaKca/immunotlb/deposito/Immunopatologia.pdf h5p://www.gene8capediatrica.it/archivi/2010/archivio4/page.php?id=1
Bibliografia
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h5ps://it.wikipedia.org www.treccani.it/enciclopedia www.federica.unina.it/medicina-‐e-‐chirurgia/biochimica-‐umana ebook.scuola.zanichelli.it/sadavabiologia www.humanitas.it/enciclopedia/anatomia/ www.osservatoriomalaKerare.
11. GLOSSARIO
Allergène: sostanza solitamente innocua per la maggior parte delle persone, ma che in taluni individui (i soggeK allergici) è in grado di produrre manifestazioni allergiche di varia natura (asma, or8caria, etc.). Gli allergene possono raggiungere l'organismo a5raverso l'inalazione (è il caso di polveri, pollini), l'inges8one (alimen8, principio aKvo o eccipiente di farmaci), l'iniezione (punture di inseK), il conta5o (pomate, profumi, detersivi, scaglie di pelle di animali, nichel), e sono responsabili delle allergie. Le reazioni allergiche sono dose-‐indipenden8 e sono quindi sufficien8 piccole quan8tà dell'alimento contenente l'allergene per determinare la risposta del sistema immunitario e provocare i rela8vi sintomi.
AnAcorpo: sostanza di natura glicoproteica globulare, appartenente alla classe delle immunoglobuline, o gammaglobuline, che si sviluppa nel corso di una risposta immunitaria e che svolge un’azione antagonista verso gli an8geni (➔ immunità). Oltre alla loro funzione di difesa dell’organismo da agen8 estranei, gli a. vengono a5ualmente u8lizza8 in laboratorio per la ricerca e per la diagnosi di malaKe. La produzione di a. avviene da parte di speciali cellule, i linfoci8 B, durante la cosidde5a risposta immunitaria umorale. La produzione di a. avviene già in soggeK di pochi mesi, quando il sistema immunitario è ormai maturo, mentre nei neona8 gli a. presen8 nel sangue sono di origine materna; altri a. possono essere introdoK ancora per alcuni mesi dopo la nascita con il la5e materno. La reazione an8gene-‐a. è altamente specifica e coinvolge il sito an8genico dell’an8gene e il sito combinatorio dell’an8corpo. Il dosaggio di a. specifici è u8lizzato per iden8ficare la presenza di infezioni in essere o pregresse (per es., la rosolia) e l’avvenuta risposta alla vaccinazione (per es., an8-‐HBV). La ricerca di a. naturali direK contro i gruppi sanguigni (isoagglu8nine) consente la 8pizzazione dei gruppi AB0. La ricerca di autoan8corpi è essenziale nelle malaKe autoimmuni. A. monoclonali sono u8lizza8 nella diagnos8ca (per es., nella iden8ficazione delle so5oclassi linfocitarie) o in terapia (per es., nel tra5amento di alcune neoplasie o dell’artrite reumatoide). Immunoglobuline umane, adeguatamente purificate e provenien8 da plasma di donatori sani (Ig policlonali), sono u8lizzate nel tra5amento delle malaKe con carenza di a. e nell’immunomodulazione. Quelle con alte concentrazioni di a. specifici (per es., Ig an8tetano) sono u8lizzate nella sieroprofilassi.
monoclonale è un an8corpo in grado di legarsi ad un solo epitopo dell’an8gene. Un clone di cellule che produce un solo an8corpo può essere generato ar8ficialmente a5raverso la fusione di un linfocita B (che produce an8corpi, ma ha una durata limitata di vita) con una cellula tumorale (che è immortale e col8vabile in laboratorio). La cellula ibrida che ne deriva, definita ibridoma, produce uno specifico an8corpo monoclonale e cresce in coltura. Rispe5o alla produzione di an8corpi policlonali, il processo richiede più tempo e una tecnologia costosa e raffinata, ma una volta o5enuto l’ibridoma può essere usato come sorgente di an8corpi monoclonali, sempre iden8ci, per lungo tempo. Gli an8corpi monoclonali hanno diverse applicazioni pra8che: • I dosaggi immunologici sfru5ano la straordinaria specificità degli an8corpi per rilevare piccolissime quan8tà di molecole nei tessu8 e nei liquidi biologici. Questa tecnica è impiegata, per esempio, nei test di gravidanza che misurano gli ormoni prodoK dall’embrione in via di sviluppo • L’immunoterapia impiega an8corpi monoclonali direK contro gli an8geni presen8 sulla superficie di cellule tumorali. L’associazione con un ligando radioaKvo o con una tossina trasforma l’an8corpo in una sorta di «bomba intelligente». In alcuni casi, il legame stesso dell’an8corpo alle cellule è sufficiente a scatenare una risposta immunitaria cellulare che elimina il cancro. policlonale è una miscela di an8corpi o5enu8 dall'immunizzazione di un animale (a5raverso iniezione so5ocutanea, intramuscolare o endovenosa) con un an8gene. Gli an8corpi che risultano da questa immunizzazione saranno gene8camente diversi (perché prodoK da plasmacellule diverse) e ognuno di essi riconoscerà un epitopo diverso dello stesso an8gene.
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AnAgene: sostanza in grado di essere riconosciuta dal sistema immunitario. La sostanza può essere di provenienza ambientale o formarsi all'interno del corpo. Il sistema immunitario uccide o neutralizza qualsiasi an8gene che riconosce come estraneo e potenzialmente dannoso. Un immunogeno è un 8po specifico di an8gene. L'immunogenicità è la capacità di indurre una risposta umorale e/o cellulo-‐mediata di 8po immune. L'an8genicità è invece la capacità di combinarsi specificamente con i prodoK finali della risposta immunitaria (cioè gli an8corpi secre8 e/o i rece5ori di superficie presen8 sulle cellule T). Anche se tu5e le molecole che hanno proprietà di immunogenicità hanno anche la proprietà di an8genicità, il contrario non è vero. A livello molecolare, un an8gene è cara5erizzato dalla sua capacità di essere "legato" al sito di legame dell'an8gene di un an8corpo. Si no8 inoltre che gli an8corpi tendono a discriminare tra le stru5ure molecolari specifiche presentate sulla superficie dell'an8gene. Gli an8geni sono generalmente proteine o polisaccaridi. Questo include par8 (rives8men8, capsule, pare8 cellulari, flagelli, fimbrie etossine), di ba5eri, virus e altri microrganismi. I lipidi e gli acidi nucleici sono an8geni solo quando si combinano con proteine e polisaccaridi. An8geni non-‐microbici esogeni (non-‐self) possono includere pollini, albume d'uovo, e proteine di tessu8 e organi trapianta8 o presen8 sulla superficie di globuli rossi trasfusi. I vaccini sono esempi di an8geni immunogenici somministra8 intenzionalmente per indurre immunità acquisita nel ricevente.
Citochine: proteine di piccole dimensioni che si legano a specifici rece5ori presen8 sulla membrana e comunicano alla cellula un'istruzione specifica come, ad esempio, lo s8molo a crescere, oppure a differenziarsi o ancora l'ordine di morire. Vengono prodo5e da diversi 8pi di cellule e, una volta liberate nell'organismo, inducono specifiche reazioni nelle cellule adiacen8 (effe5o paracrino), in altre molto lontane (effe5o endocrino) oppure in quelle che le hanno create (effe5o autocrino). In par8colare quelle prodo5e dalle cellule del sistema immunitario, come le interleuchine e le chemochine, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione e nell'aKvazione dei nostri meccanismi difensivi e nei processi infiammatori.
Enzima: sostanza che svolge la funzione di catalizzatore nei processi biologici. La stragrande maggioranza degli enzimi sono proteine (proteine enzima8che). Una piccola minoranza di enzimi sono par8colari molecole di RNA, chiamate ribozimi (o enzimi a RNA). Il processo di catalisi indo5o da un enzima (come da un qualsiasi altro catalizzatore) consiste in un aumento della velocità di reazione (diminuendo l’energia di aKvazione e creando spesso un pathway metabolico) e quindi in un più rapido raggiungimento dello stato di equilibrio termodinamico. Un enzima incrementa unicamente le velocità delle reazioni chimiche, dire5a e inversa (dal composto A al composto B e viceversa), senza intervenire sui processi che ne regolano la spontaneità. Il suo ruolo consiste infaK nel facilitare le reazioni a5raverso l'interazione tra il substrato (la molecola o le molecole che partecipano alla reazione) e il proprio sito aKvo (la parte di enzima in cui avvengono le reazioni), formando un complesso. Avvenuta la reazione, il prodo5o viene allontanato dall'enzima, che rimane disponibile per iniziarne una nuova. L'enzima infaK non viene consumato durante la reazione. L'aKvità degli enzimi è determinata dalla stru5ura terziaria (ovvero la conformazione tridimensionale) degli enzimi stessi. La maggior parte degli enzimi presenta dimensioni decisamente maggiori dei substra8 su cui agiscono e solitamente la regione del sito aKvo è molto rido5a (conta spesso solo 3-‐4 amminoacidi). Gli enzimi possono anche contenere regioni che legano cofa5ori necessari per la catalisi (ioni metallici o molecole di natura organica de5e coenzimi come le vitamine). L'aKvità enzima8ca può essere anche influenzata dalla temperatura, dal pH e dalla concentrazione di substrato. Gli enzimi si dis8nguono dai catalizzatori inorganici per alcuni aspeK peculiari: • sono straordinariamente efficien8: la velocità della reazione catalizzata può risultare 105 volte superiore rispe5o a
quella non catalizzata • mostrano spesso livelli eleva8ssimi di stereospecificità (prediligere come reagente un ben determinato
stereoisomero), regioseleKvità (procedere preferenzialmente con la ro5ura o formazione di determina8 legami tra quelli possibili, con la produzione di un dato composto chimico che risulta favorita rispe5o a quella di un altro correlato) e chemoseleKvità (reagire preferenzialmente solo con alcuni gruppi funzionali)
• sono modulabili: la velocità di una reazione catalizzata da un enzima può essere regolata in maniera fine e seleKva mediante l’interazione tra quest’ul8mo e un’altra molecola (diversa dal substrato) che agisce da modulatore con meccanismi diversi: allosterismo ( il sito aKvo è reso più o meno accessibile), modificazioni covalen8 (l’enzima è aKvato mediante legami covalen8 con specifici gruppi chimici: esempio la fosforilazione), inibitori enzima8ci (molecole in grado di inibire l’ aKvità catali8ca come mol8 farmaci e veleni).
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• agiscono in condizioni fisiologiche: sono in grado di agire nelle condizioni di pH, temperatura e pressione cara5eris8che degli organismi viven8
La teoria che viene u8lizzata per interpretare la cine8ca enzima8ca è quella di Michaelis-‐ Menten
Epitopo o Determinante anAgenico: parte di un an8gene che entra in conta5o con il sito di legame di un an8corpo o col rece5ore per l’an8gene delle cellule T (gli epitopi sono pra8camente le porzioni più importan8 dell’an8gene, capaci di evocare la risposta immunitaria). La singola molecola di an8gene può contenere diversi epitopi riconosciu8 da an8corpi differen8. Si dis8nguono, in linea di massima, due 8pi di epitopi: • epitopi sequenziali, cara5erizza8 da una specifica sequenza lineare aminoacidica (ad esempio Arg-‐Glu-‐Ser); • epitopi conformazionali, riconosciu8 dal sistema immunitario come complessi tridimensionali. Gli epitopi
conformazionali possono essere cos8tui8 da elemen8 anche molto distan8 tra loro in termini di stru5ura primaria (lineare), ma estremamente vicini a livello della stru5ura terziaria (tridimensionale) a causa del ripiegamento che cara5erizza molte macromolecole biologiche.
Gene: l'unità ereditaria fondamentale degli organismi viven8. I geni corrispondono a porzioni di genoma localizzate in precise posizioni all'interno della sequenza di DNA (o più raramente RNA in cer8 virus) e contengono le informazioni necessarie per la produzione di una proteina o di RNA (senza la produzione di proteine): sono geni tuK i segmen8 del genoma susceKbili di essere trascriK. Durante la fase riproduKva della cellula sono organizza8 nei cromosomi, che nelle cellule umane sono presen8 in 23 coppie di cromosomi omologhi, con la sola eccezione dei game8, che presentano una singola copia di ciascun cromosoma. Ogni gene può presentare forme alterna8ve che differiscono leggermente nella sequenza nucleo8dica e prendono il nome di alleli.
Ibridoma: cellula ingegnerizzata o5enuta dalla fusione, mediante ausilio di un agente chimico o virale, di una linea o clone di cellule (per es., linfoci8 sensibilizza8 da un solo an8gene: cellule B rimosse dalla milza dell’animale immunizzato) con una linea cancerosa che presenta il vantaggio di mol8plicarsi indefinitamente. L’i. così o5enuto eredita le informazioni per la funzione desiderata dalla cellula normale e la capacità di riprodursi dalla cellula cancerosa proliferando e secernendo in grandi quan8tà il prodo5o desiderato. La fusione tra i linfoci8 B e le cellule del mieloma è o5enuta per intervento di promotori della fusione di membrane, come il polie8lenglicole.Le applicazioni pra8che hanno portato alla disponibilità di an8corpi monoclonali, di largo impiego nella ricerca biomedica, in diagnos8ca e in terapia. Immunità innata: insieme con l'immunità ada5a8va, rappresenta una delle due modalità di difesa immunitaria nell'uomo. Si tra5a di un insieme di meccanismi biochimici di difesa cellulare vol8 a prevenire, a comba5ere e a distruggere gli agen8 infeKvi che penetrano a livello tessutale. Questa prima linea difensiva dell’organismo è il sistema di difesa più an8co ed è comune a tuK gli organismi pluricellulari, compresi gli inseK e le piante. L’Immunità Innata comprende i meccanismi di barriera non specifici per gli elemen8 patogeni: barriera anatomica (cute, mucose..), fisiologica (pH, temperatura..) ,fagocitaria (macrofagi, monoci8, granuloci8, cellule NK), infiammatoria (vasodilatazione, aumento della permeabilità capillare..) L'immunità innata non è un meccanismo dissociato dall'immunità ada5a8va, ma contribuisce a s8molarla e ad influenzarla tramite alcuni mediatori e segnali molecolari.
Immunità specifica o adaHaAva: nota anche come immunità acquisita, rappresenta l’insieme delle risposte di 8po specifico aKvate dal sistema immunitario verso i microrganismi patogeni. Può essere acquisita in modo naturale e aKvo (quando, cioè, il sistema immunitario conserva il ricordo di malaKe già avute, de5a immunità acquisita naturale aKva), in modo naturale ma passivo (dovuta, ad esempio, ad an8corpi preforma8 di origine materna, de5a anche immunità acquisita naturale passiva o immunità del neonato), in modo ar8ficiale (mediante la somministrazione di vaccini e sieri, de5a anche immunità acquisita ar8ficiale). Mentre l’immunità aspecifica è il sistema di difesa più an8co che si ritrova in tuK gli organismi pluricellulari, compresi inseK e piante, l’immunità specifica o acquisita compare con i vertebra8. In presenza di un microrganismo patogeno l’immunità specifica si basa sull’aKvazione mirata dei linfoci8 B e T, cellule specializzate in funzioni immunitarie, ed è cara5erizzata dall’importante specificità dei rece5ori coinvol8 (gli an8corpi nel caso dei linfoci8 B e il cosidde5o rece5ore delle cellule T, ovvero il T-‐cell receptor, nel caso dei linfoci8 T).Le strategie a5raverso cui opera l’immunità specifica sono due e collaborano stre5amente tra loro: l’immunità umorale (ovvero per via ema8ca) e l’immunità cellulo-‐mediata. Nel primo caso a intervenire sono i linfoci8 B, che si
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aKvano per produrre an8corpi con i quali debellare gli agen8 infeKvi. Nel secondo caso ad agire sono i linfoci8 T che si aKvano per secernere alcune molecole infiammatorie, le citochine, e rivelando le loro proprietà citotossiche.La memoria -‐ ovvero la capacità di rispondere in modo più rapido e più efficace nei confron8 di agen8 infeKvi già precedentemente incontra8 -‐ è una delle cara5eris8che principali dell’immunità specifica.
Marcatori tumorali: sostanze presen8 nel sangue per lo più proteine, che possono essere presen8 nell'organismo anche in condizioni diverse dal cancro ma che alcune cellule tumorali producono in quan8tà molto superiori alla norma. Per questo possono indirizzare o confermare una diagnosi, anche se difficilmente sono sufficien8 a dimostrarla in assenza di altri elemen8. In alcuni casi ques8 test possono essere u8li anche per seguire in maniera poco invasiva l'andamento della malaKa o individuare precocemente una sua ripresa dopo una fase di remissione. Nessuno dei test a5ualmente disponibili è tu5avia consigliato come screening per la diagnosi precoce in assenza di disturbi che facciano sospe5are la malaKa. È infaK importante ricordare che alcuni di ques8 esami possono risultare posi8vi per ragioni diverse dal cancro e che, viceversa, è possibile avere un tumore senza che il corrispondente marcatore risul8 elevato. Alcuni marcatori sono prodoK solo dalle cellule di un organo e quindi specifici di un par8colare tumore (come l'an8gene prosta8co specifico, PSA per la prostata o CA 125 per l'ovaio), altri (come il CEA, an8gene carcino-‐embrionario, o l'alfafetoproteina) possono essere eleva8 in presenza di tumori diversi, rispeKvamente del colon o della mammella e del fegato o dei tumori delle cellule germinali. A oggi non esiste un marcatore unico per tu5e le forme di cancro.
Mieloma: Mul8plo (MM): tumore del midollo osseo, più frequente negli uomini che nelle donne, che si presenta nella larga maggioranza dei casi dopo i 60 anni. La malaKa è causata dal danneggiamento del DNA di alcune plasmacellule, cellule immunitarie che hanno la funzione di produrre an8corpi e difenderci dalle infezioni. Le cellule del mieloma sono cara5erizzate dalla produzione in eccesso di un an8corpo, noto come paraproteina o Componente M, che viene rilevato nel siero del paziente e facilita la diagnosi. Inoltre, viene prodo5a anche una grande quan8tà di citochine, segnali dell’infiammazione, che possono interferire con la formazione delle altre cellule del sangue o con la sintesi di osteoclas8, le cellule dell’osso, innescando fragilità e fra5ure ossee 8piche di questa forma tumorale.
Mutazione: fenomeno di variazione della stru5ura del materiale gene8co, spontanea o indo5a da agen8 fisici o chimici (mutageni), ma non dalla ricombinazione gene8ca La m. può verificarsi a livello di un singolo gene (m. genica o pun8forme) o nella stru5ura dei cromosomi (m. cromosomica) o nel numero dei cromosomi (m. genomica); tale variazione è trasmissibile alle generazioni successive solo se si verifica nel nucleo dei game8 (m. germinale); quando riguarda invece cellule soma8che (m. soma8ca), i suoi effeK si riscontrano solo nelle linee cellulari in cui si è verificata. In mol8 casi le m. portano a un dife5o funzionale: infaK un gene mutato codifica una proteina anormale oppure nessuna proteina. Le m. gene8che più gravi sono spesso dovute all’inserzione o alla delezione di un tra5o di DNA, modificazione che comporta uno spostamento nell’ordine di le5ura durante la trascrizione (malaKe gene8che del cervello).
Ormone: ( dal greco s8molare): qualsiasi sostanza prodo5a dall’organismo (cellula endocrina) che traspor8 un segnale capace di indurre una qualsiasi modificazione in cellule localizzare a varia distanza (distante o vicina) dalla sua sede di produzione o nella stessa cellula di produzione. Tali cellule, chiamate cellule bersaglio, sono provviste di stru5ure di riconoscimento, deK rece5ori. Gli ormoni fanno parte di un sistema complesso di interazioni, in cui interviene anche il sistema nervoso centrale, che consente all'organismo di comportarsi come un'unica en8tà coordinata. Operano in concentrazioni molto basse e vengono prodoK secondo cicli che possono essere diurni, mensili o annuali o in base a dei cicli di fer8lità. La durata media della loro vita è molto breve; vengono inaKva8 dopo aver svolto il loro compito per avere un controllo migliore sulla loro azione. I livelli specifici degli ormoni sono regola8 dal sistema nervoso centrale. La regione del cervello che regola i livelli degli ormoni è l'ipotalamo, che viene s8molato da segnali provenien8 dall'ambiente esterni (es. segnali di pericolo, la composizione del sangue, la pressione sanguigna) a produrre specifici ormoni deK fa5ori di rilascio, che, raggiungendo l'ipofisi anteriore, s8molano quest'ul8ma a produrre un altro 8po di ormoni, le tropine. Le tropine aKvano altre ghiandole endocrine (8roide, surrene, pancreas, gonadi) s8molandole a produrre ormoni specifica8 e appropria8 alla situazione.
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Il feedback, o meccanismo di retroregolazione, è un sistema mediante il quale gli ormoni controllano gli effeK biologici che essi stessi determinano; tali effeK, a loro volta, regolano la secrezione dell'ormone. Il sistema consiste in un flusso bidirezionale con8nuo di informazioni tra la sede di produzione dell'ormone e il tessuto bersaglio In base alla composizione chimica gli ormoni sono classifica8: • ormoni di natura pro8dica a. Deriva8 da aminoacidi: catecolamine (adrenalina, noradrenalina), ormoni 8roidei, melatonina. b. Pep8dici e proteici: ipofisari, pancrea8ci, para8roidei, gastrointes8nali, calcitonina, fa5ori di crescita
• ormoni steroidei (deriva8 dal colesterolo): ormoni sessuali maschili e femminili, ormoni cor8cosurrenalici • ormoni deriva8 da acidi grassi: prostaglandine • ormoni re8noidi: vitamina A In base alla solubilità e alla localizzazione dei rece5ori: • ormoni idrofilici con rece5ori localizza8 sulla superficie cellulare es: ormoni pep8dici, molecole con carica: istamina • ormoni lipofilici con rece5ori intracellulari (es: ormoni steroidi) • ormoni lipofilici con rece5ori localizza8 sulla superficie cellulare es: prostaglandine Le azioni ormonali sono fondamentalmente qua5ro: Sviluppo e crescita -‐ Produzione di energia e u8lizzazione di substra8 metabolici -‐ Mantenimento dell'omeostasi -‐ Riproduzione.
Ricombinazione geneAca: processo a5raverso il quale due elemen8 gene8ci provenien8 da fon8 diverse si vengono a trovare nella stessa unità gene8ca. A livello molecolare la ricombinazione è definita come il passaggio di informazione gene8ca (sequenza di acidi nucleici) da una molecola di DNA ad un’altra. La ricombinazione è un importante processo evolu8vo e la cellula possiede meccanismi specifici che assicurano che si verifichi. Negli eucario8 la ricombinazione gene8ca è una conseguenza della riproduzione sessuale: • ricombinazione intercromosomica: riguarda la diversa redistribuzione di interi cromosomi. Il processo meio8co alla
base è la segregazione in uguali proporzioni dei cromosomi omologhi, come previsto dalla seconda legge di Mendel • ricombinazione intracromosomica: si fonda sul processo di crossing-‐over che avviene nel corso della profase
I meio8ca ma anche della mitosi; comporta una ro5ura del doppio filamento di due molecole di DNA che cos8tuiscono due cromosomi omologhi e lo scambio di porzioni di materiale gene8co; il processo è stre5amente collegato a quello di riparazione del DNA che comporta sempre una ro5ura del DNA ma per correggere errori nella sequenza.
I procario8, pur riproducendosi per via asessuata, dispongono di svaria8 modi per ricombinare i loro geni: processi di trasformazione, trasduzione e coniugazione: • trasformazione: la cellula receKva è in grado di introdurre nel proprio interno i segmen8 di DNA libero presen8
nell'ambiente in cui si trova a vivere. Ques8 segmen8, estrusi da altre cellule o residui di cellule distru5e, possono essere inseri8 nel cromosoma ba5erico in corrispondenza di porzioni omologhe,che vengono poi eliminate.
• trasduzione: il DNA del ba5erio viene veicolato da par8celle speciali, i virus ba5erici chiama8 anche fagi. I fagi infe5ano una cellula e in condizioni opportune vi si mol8plicano; le par8celle neoformate distruggono quindi la cellula e si liberano, portando eventualmente con sè frammen8 del genoma ba5erico: quando penetrano in una nuova cellula possono cosi trasferire questo materiale alla cellula infe5ata.
• coniugazione: due cellule venute a conta5o, formano un canale citoplasma8co a5raverso il quale la cellula donatrice, cede all'altra, un filamento di DNA di nuova formazione; questa lo integra nel proprio cromosoma in corrispondenza del sito omologo che viene così sos8tuito. Va precisato che la cellula donatrice è cara5erizzata dal possesso di un plasmidio F, cioè di un piccolo cromosoma anulare che si riproduce in modo autonomo e conferisce alla cellula la capacità di produrre alcuni soKli filamen8 superficiali, le fimbrie. Grazie alle fimbrie la cellula donatrice stabilisce il conta5o con l’altra cellula con la quale si coniugherà
La cos8tuzione gene8ca di un organismo oltre ad essere modificata in modo casuale e "naturale", può esserlo ar8ficialmente in modo mirato: si parla di biotecnologia. Propriamente, le tecniche che consentono di alterare il patrimonio gene8co degli organismi vanno so5o il nome di ingegneria gene8ca. A differenza della ricombinazione naturale, l'ingegneria gene8ca altera in modo mirato il genoma di un organismo, isolando alcuni suoi geni (eventualmente modifica8) e inserendoli in cellule di un'altra specie, dove si mol8plicano e sinte8zzano le loro proteine. La cellula ospite (nella quale introdurre i geni) è normalmente un ba5erio e la metodologia più importante u8lizzata ricorre al DNA ricombinante. A5ualmente le biotecnologie trovano impiego nella cura della salute (produzione di sostanze che sono alla base di farmaci), nell'agricoltura (inserimento di par8colari geni u8li nel genoma delle piante), nell'alimentazione (lavorazione dei prodoK, controllo della qualità e dello stato di conservazione degli alimen8) e nella difesa dell'ambiente (tra5amento dei rifiu8, depurazione delle acque).
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Tossina: si intende sostanza prodo5a da un organismo animale, vegetale o microbico che è dannosa per alcune specie. Una biotossina è un veleno prodo5o dall'aKvità metabolica di alcuni esseri viven8, come i ba5eri. Le tossine prodo5e dai funghi sono chiamate micotossine I vegetali tossici producono tossine per mezzo dei loro metaboli8 secondari: sono molecole che vengono prodo5e al di fuori delle vie metaboliche che assicurano la sopravvivenza della pianta (e quindi considerate primarie). Queste molecole sono alquanto diffuse nel regno vegetale e vengono divise in qua5ro gruppi, ossia: • i fenoli: come i tannini, lignine, flavonoidi e catecol-‐melanine. • gli azota8: gli alcaloidi, le betalaine, eteroside e glucosinola8. • i terpeni, che sono elemen8 della resina delle conifere. • i nitra8, generalmente alte concentrazioni vengono accumulate in alcune piante a causa dell'uso eccessivo
di fer8lizzan8. La presenza nel sangue umano di tossine prende il nome di tossinemia o tossiemia e dà quadri clinici e prognos8ci differen8. Ricordiamo alcune delle tossine più pericolose per l'organismo: Micotossine, Tossina ofidica, Tossina ba5erica, Tossina colerica, Tossina botulinica, Tossina tetanica, Tossina streptococcica, Tossina stafilococcica Le tossine agiscono con meccanismi diversi: • neurotossico (neurotossina) quando agiscono dire5amente sul neurone o sulle sinapsi in senso inibente e quindi
determinante paralisi o s8molante con effeK convulsivi, come accade per il tetano. • emotossico quando agiscono sul sangue determinando la distruzione di alcuni elemen8 figura8 come i globuli
rossi o alterando i sistemi di coagulazione del sangue. • citotossico quando l'azione è rivolta dire5amente alla cellula
Supervisione di: Paolo Plevani, Giovanna Viale, Cinzia Grazioli e Livia Pirovano
A cura di
Prof. Luciano Bacillieri ITI Oberdan di Treviglio Bg Pro f.ssa Maria Pia Cantoni ITI Righi di Corsico, Prof.ssa Emanuela Coen ITI P. Levi di Bollate, Prof.ssa Maria Grazia Fiorin Prof.ssa Angela Porto liceo Galilei Catania, Do5.ssa Elisabe5a Tacconi
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