Consolidacion de modelos cin eticos para la degradaci on ...
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Consolidaci ´ on de modelos cin ´ eticos para la degradaci ´ on de carbohidratos y lignina que resulta del pretratamiento oxidativo con cal Juan David Pedraza Rodr´ ıguez Universidad de Los Andes Facultad de Ingenier´ ıa Departamento de Ingenier´ ıa Qu´ ımica Bogot´ a, Colombia 2011
Transcript of Consolidacion de modelos cin eticos para la degradaci on ...
Consolidacion de modelos cineticos para la degradacion
de carbohidratos y lignina que resulta del
pretratamiento oxidativo con cal
Juan David Pedraza Rodrıguez
Universidad de Los Andes
Facultad de Ingenierıa
Departamento de Ingenierıa Quımica
Bogota, Colombia
2011
Consolidacion de modelos cineticos para la degradacion
de carbohidratos y lignina que resulta del
pretratamiento oxidativo con cal
Juan David Pedraza Rodrıguez
Proyecto de grado para optar por el tıtulo de Ingeniero Quımico
Asesora
Rocıo Sierra PhD.
Universidad de Los Andes
Facultad de Ingenierıa
Departamento de Ingenierıa Quımica
Bogota, Colombia
2011
Indice general
Introduccion 1
1. Preliminares 6
1.1. Cana de azucar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2. Lignocelulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.1. Lignina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.2. Celulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.3. Hemicelulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3. Factores que afectan la digestibilidad de la biomasa . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4. Pretratamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4.1. Algunos tipos de pretratamientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5. Pretratamiento alcalino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6. Quımica de la deslignificacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2. Materiales y metodos 16
2.1. Petratamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.2. Hidrolisis enzimatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3. Hidrolisis acida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.4. Analisis de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.5. Modelo cinetico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3. Resultados y discusion 22
3.1. Composicion de la biomasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2. Degradacion de lignina y carbohidratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2.1. Estudio cinetico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.2.2. Selectividad del modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.3. Rendimiento global . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
A. Pretratamiento 31
A.1. Pretratamiento reactores Parr 5000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
A.1.1. Neutralizacion de la cal luego del pretratamiento . . . . . . . . . . . 32
3
B. Determinacion de humedad de la biomasa pretratada 33
C. Determinacion de carbohidratos estructurales y lignina 34
C.1. Hidrolisis acida concentrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
C.2. Hidrolisis acida diluida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
C.3. Analisis de lignina insoluble . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
C.4. Analisis de carbohidratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
D. Determinacion de actividad de la celulasa 36
D.1. Preparacion del reactivo DNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
E. Hidrolisis enzimatica 39
E.1. Preparacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
E.2. Procedimiento hidrolisis enzimatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
E.3. Analisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
E.4. Calculos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
F. Resultados 42
F.1. YL y YC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
F.2. Analisis estadıstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
F.3. Codigo Matlab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Lista de figuras
1.1. Esquema de la arquitectura de la planta [2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2. Representacion de la celulosa [20] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3. Representacion del xilano [20] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4. Reaccion de rompimiento de enlaces β–O–4 [6] . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.1. Esquema hidrolisis enzimatica [2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.1. Composicion bagazo de cana de azucar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2. Rendimiento de lignina y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3. Ajuste de datos para el modelo de degradacion de carbohidratos . . . . . . 25
3.4. Ajuste de datos para el modelo de degradacion de lignina . . . . . . . . . . 26
3.5. Selectividad integral para los pretratamientos . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.6. Rendimiento global del pretratamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
5
Lista de tablas
3.1. Parametros cineticos degradacion de lignina (α)=0.05) e intervalos de confianza 24
3.2. Parametros cineticos degradacion de carbohidratos (α=0.05) e intervalos deconfianza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1
Resumen
La degradacion de la lignina es una condicion indispensanble para facilitar la digestibilidad
de la biomasa y mediante la cual se le puede dar valor agregado a un residuo generado en
grandes cantidades por la industria azucarera colombiana. En este trabajo, el bagazo de
cana se sometio a un pretratamiento alcalino que uso H2O2 como agente oxidante y que se
aplico en diferentes concentraciones sobre un amplio espectro de temperaturas y tiempos
de reaccion—1 %, 2 % y 5 %; 50, 75, 100, 120, 150◦C; 0.5, 1, 2 y 4 horas. Para la cuantifi-
cacion de la degradacion de lignina, azucares estructurales y digestibilidad enzimatica de
la biomasa pretratada se llevaron a cabo los procedimientos analıticos recomendados por el
National Renewable Energy Laboratory (NREL).
Los datos obtenidos fueron usados para obtener un modelo cinetico del proceso. Adicional-
mente, con base en experimentos de hidrolisis enzimatica aplicados a la biomasa pretrata-
da, se identificaron las mejores condiciones de pretratamiento para el bagazo de cana. El
maximo rendimiento promedio de glucosa fue de 59.35 g/g biomasa sin pretratar correspon-
dientes s 52.3 g de azucares reductores/g biomasa sin pretratar y fue observado a 150◦C.
Las condiciones de pretratamiento optimas obtenidas en este estudio, establecidas medi-
ante los parametros de rendimiento global del pretratamiento fueron: 100◦C, 30 min y
[H2O2]=1 %.
1
Introduccion
El creciente impacto medioambiental de los combustibles de origen fosil y la disminucion
paulatina de estos obliga a enfocar la investigacion de nuevas energıas hacia el desarrol-
lo de combustibles cuya emision neta de gases de efecto invernadero, especialmente CO2,
sea mucho menor a la de los combustibles tradicionales. Actualmente, solo el 10 % de la
energıa consumida en el mundo proviene de biomasas; el 90 % restante lo suministran los
combustibles fosiles (80 %), hidroelectricidad (2 %), energıa nuclear (6 %) y energıa solar
(6 %) [2].
El etanol de origen lignocelulosico presenta caracterısticas muy favorables en compara-
cion con los combustibles derivados del petroleo, ya que la emision de CO2 durante su
combustion es compensada con la cantidad de CO2 que los cultivos de donde este se obtu-
vo fijan [25]. Ademas, la combustion del etanol genera un 13 % menos de gases de efecto
invernadero que la gasolina [9].
En la actualidad, el aprovechamiento energetico, distinto de procesos de gasificacion, presen-
ta grandes retos tecnico–cientıficos dada la complejidad de las materias primas necesarias
para su elaboracion.
La lignocelulosa, un conglomerado de celulosa (38-50 %), hemicelulosa (23-32 %) y lignina
(15-30 %), es la materia prima renovable mas abundante del planeta, con una produccion
anual de cerca de 200 mil millones de toneladas [30]. Se estima que en Colombia se generan
aproximadamente 1.5 millones de toneladas de bagazo, de las cuales alrededor de 500,000
son desperdiciadas[12]. Generalmente es usada en procesos de combustiion o gasificacion
para generar energıa en companıas productoras de panela o azucar.
La lignocelulosa no contiene monosacaridos que puedan ser fermentados. Por esta razon, los
carbohidratos que conforman la lignocelulosa deben ser hidrolizados para obtener monosacari-
dos fermentables.
2
LISTA DE TABLAS 3
El principal problema que se afronta en el aprovechamiento de la biomasa, es que la lignina,
encargada de darle rigidez y proteccion a la planta, limita el acceso a los carbohidratos y
por ende la digestibilidad de los mismos. Ademas, la acetilacion de la hemicelulosa y la
cristalinidad de la celulosa tambien disminuyen la digestibilidad enzimatica del material
lignocelulosico. A traves de un pretratamiento se altera la estructura de la lignocelulosa lo-
grando reducir la cristalinidad de la celulosa, degradar la lignina, incrementar la porosidad
de la biomasa y de esta manera aumentar la digestibilidad de la misma.
Un buen pretratamiento debe preservar lo maximo posible a la celulosa y hemicelulosa
de ser degradas durante la descomposicion de la lignina; ademas, debe ser economico, es
decir, utilizar quımicos de precios asequibles y procedimientos y equipos simples[30]. Ex-
isten varios tipos de pretratamientos para diferentes tipos de materiales lignocelulosicos, a
saber: explosion de vapor, extraccion por solvente y pretratamientos termicos con acidos o
bases, biologicos con hongos y algunos mecanicos. De los anteriores, el tratamiento alcali-
no presenta ventajas sustanciales sobre los demas, como por ejemplo el bajo costo de las
materias primas, mınima demanda energetica [29]. Mas aun, comparado con procesos de
uso mas extendido, como el tratamieno acido, este no produce compuestos inhibidores de
activada microbiana asociada a la fermentacion de los azucares como el furfural. [32]
Mucho se ha investigado sobre las cineticas de deslignificacion de pulpa de madera en la
industria papelera. Desde los anos 70, estas investigaciones se han venido enfocando en la
utilizacion de oxidantes como el oxıgeno para no usar productos daninos al medio ambiente.
Sin embargo, muy poca investigacion ha estado enfocada en determinar un modelo cinetico
confiable para las cineticas de deslignificacion de biomasa lignocelulosica para su posterior
fermentacion y conversion en etanol combustible. Dicha situacion hace que se desconozcan
los factores necesarios en el control de reaccion o en la estimacion de un reactor para llevar
a cabo este proceso.
En este estudio, pues, se analizo el efecto de diferentes condiciones de pretratamiento de
biomasa en la degradacion de liginia y carbohidratos y se determinaron las condiciones
optimas de pretratamiento. Ademas, se consolido un amplio banco de datos experimentales
que puede ser utilizado en estudios posteriores para otro tipo de analisis cineticos mas com-
prehensivos.
El trabajo esta dividido 4 partes. En el primer capıtulo se describen las especies quımi-
cas involucradas en el pretratamiento y se presenta el estado del arte en el campo de los
4 LISTA DE TABLAS
procesos de delignificacion. En el segundo capıtulo se describen los procedimientos experi-
mentales utilizados y se introducen los parametros y modelos asociados al estudio cinetico
del problema. En el capıtulo 3 se presentan los resultados obtenidos y su analisis, no sin una
completa discusion alrededor de estos. Finalmente, en el apendice, se detallan los protocolos
experimentales utilizados.
Objetivos
Determinar los parametros cineticos de la deslignificacion de biomasa de bagazo de cana y
su ajuste a un modelo de ley de potencia usando metodos de ajuste por minimizacion de
diferencias cuadradas.
1. Consolidacion de un banco de datos de alto espectro para la degradacion de la lignina.
2. Determinacion de las condiciones optimas para la degradacion de la lignina.
3. Cuantificar el contenido de carbohidratos en muestras pretratadas de bagazo de cana
mediante HPLC (cromatografıa lıquida de alta resolucion).
4. Reducir la incertidumbre de los datos obtenidos para obtener un modelo mas preciso
a los obtenidos en estudios anteriores.
5
Capıtulo 1
Preliminares
1.1. Cana de azucar
La cana de azucar (Saccharum officinarum L.) es una clase de pasto tropical, alto y perenne.
De sus tallos, de entre 2 y 4 m de altos y de aproximadamente 5 cm de diametro se extrae
el azucar [18]. Su cultivo se extiende por todas las regiones tropicales del mundo. Aunque
Brasil es el mayor productor de azucar del mundo, Colombia es lıder en productividad por
hectarea de tierra. En Colombia en 2010 se produjeron algo mas de 20 millones de toneladas
de cana de azucar, para una produccion de azucar total de 2 millones de toneladas [5]. Asum-
iendo que aproximadamente el 40 % de la cana producida es bagazo [10], esto es, el residuo
generado luego que ser molida la cana, se tendrıa que en 2010 se generaron 8 millones de
toneladas de bagazo. El bagazo generado es suficiente para satisfacer la demanda energetica
de la planta, a traves de su uso como combustible en calderas. La capacidad de cogeneracion
actualmente instalada en los ingenios es de 201 MW.
1.2. Lignocelulosa
La celulosa, hemicelulosa y lignina representan la mayor fuente de compuestos organicos
en la naturaleza y constituyen algo mas del 90 % de la biomasa seca. A continuacion se
describen aspectos estructurales y quımicos de los polımeros que la conforman.
1.2.1. Lignina
La prinicipal funcion de la lignina en la pared celular de la planta es ayudar en el movimiento
interno de agua debido a que forma una barrera contra la evaporacion. Es ademas clave en la
6
1.2. LIGNOCELULOSA 7
Figura 1.1: Esquema de la arquitectura de la planta [2]
rigidez propia de cada especie de planta. La lignina es un polımero de alto entrecruzamiento
conformado principalmente por tres unidades, a saber: alcohol p−cumaril, coniferil alcohol
y sinapil alcohol. Cada una de estas unidades predomina segun el tipo de madera o material
vegetal. Ası, en las maderas duras –hardwood predominan el coniferil alcohol y el sinapil
alcohol; en las maderas suaves – softwood el coniferil alcohol; y en los pastos –grasses, a
los que pertenece la cana de azucar, el alcohol p−cumaril es el mas abundante [15]. Segun
el numero de grupos aril-OCH3 los anillos aromaticos de la lignina se pueden clasificar
en: guaiacil (1 grupo aril-OCH3), derivado del coniferil alcohol; siringuil (2 grupo aril-
OCH3), derivado del sinapil alcohol; por ultimo, el p−hidroxifenil (ningun grupo aril-
OCH3), derivado del alcohol p− cumaril. Los enlaces mas abundantes entre las unidades
que conforman la lignina son del tipo carbon - carbon o eter. A su vez, los principales
grupos funcionales son el metoxi, hidroxil fenolico, bencil y carbonil [20]. A continuacion se
muestra la unidad fundamental de la compleja estructura lıgnica [15].
bb
""bb
""
bb
""
CH=CH–CH2OH
R′bb
OH
R""
donde
8 CAPITULO 1. PRELIMINARES
Substituto Nombre Ubicacion
R = R′ = H alcohol p-cumaril grasses
R = H,R′ = OCH3 coniferil alcohol softwood
R = R′ = OCH3 sinapil alcohol hardwood
1.2.2. Celulosa
Es el polımero mas abundante en la naturaleza y esta compuesta principalmente por cadenas
de β -D-glucopiranosil interconectadas por enlaces β 1,4. Estas unidades estan rotadas 180◦
con respecto a sus vecinos ,lo que le da a la celulosa una alta simetrıa [34].
Figura 1.2: Representacion de la celulosa [20]
Esta presente en la pared celular de todas las plantas en forma de fibras y es sintetizado
naturalmente a partir de la celulosa durante la fotosıntesis [37]. Los monomeros de glu-
cosil forman puentes de hidrogeno en los oxıgenos O3-O5´ y O6-O2´. Las fibras de celulosa
son menos hidrofılicas que otros polisacaridos, lo que facilita la formacion de cristales con
puentes de hidrogeno intra e intermoleculares y complejas estructuras tridimensionales. [2].
Otra estructura importante en la organizacion de la celulosa en la planta son las microfib-
rillas. Estas son conglomerados de varios paracristales -estructuras cristalinas con latices
desordenadas- de 1,4-β glucanos que forman nanofibras de 3–4 nm de grosor y diametro.
1.2.3. Hemicelulosa
La hemicelulosa es un grupo de polisacaridos presentes en la pared celular. Los princi-
pales carbohidratos en la hemicelulosa son el galactoglucomanano, glucomanano, la ara-
binoglucuronoxilanos y los xilanos. En la cana de azucar, como en otros pastos, el principal
polisacarido en la hemicelulosa es el 4-O-metil-gluocarabinoxilano junto con otros polisacari-
dos de β-glucanos, mananos y pectinas [20, 2]
Los xilanos son compuestos de polisacaridos con cadenas de unidades de β-D-xilopiranosa
1.3. FACTORES QUE AFECTAN LA DIGESTIBILIDAD DE LA BIOMASA 9
unidas por enlaces 1, 4. Dependiendo de la especie vegetal de donde provenga, la composicion
del xilano varıa considerablemente. Los principales grupos asociados a este polisacarido son
los acetil, que, como se vera, obstaculizan la deslignificacion de la biomasa. Los xilanos de la
cana de azucar presentan un alto porcentaje de acetilaciones (70–80 %) [2]. A continuacion
se muestra un esquema del xilano:
Figura 1.3: Representacion del xilano [20]
1.3. Factores que afectan la digestibilidad de la biomasa
El material lignocelulosico presenta obstaculos a la hora de aprovechar los azucares pre-
sentes para producir combustibles. Los factores que afectan el aprovechamiento enzimatico
de los polisacaridos se pueden dividir en factores estructurales y mecanismos enzimaticos.
A su vez, los factores estructurales se pueden dividir en quımicos y fısicos, siendo los quımi-
cos los relacionados con las polımeros presentes en la biomasa y sus interacciones, y los
fısicos los asociados a aspectos tales como el area superficial accesible, cristalinidad, gra-
do de polimerizacion, volumen de poro y distribucion de la ligina en la biomasa [36]. A
continuacion se presentan los mas importantes.
Contenido de lignina. La lignina es la mayor barrera para la hidrolisis enzimatica debido
a que esta vinculada con las microfribillas de la celulosa. Su efecto en el incremento
del area superficial interna y el volumen de poro aumenta la digestibilidad. Ademas,
la lignina disuelta luego de un pretratamiento puede ser un inhibidor de la celulasa,
xilanasa y glucosidasa [31]. Otro punto importante en la digestibilidad de la biomasa
es la molecula predominante en la ligniga y su ubicacion en la matriz de biomasa [31].
Hemicelulosa. La hemicelulosa bloquea el contacto de la celulasa con su substrato, por
esto algunos pretratamientos acidos buscan la remocion de la hemicelulosa para au-
mentar la digestibilidad de la celulosa. Las acetilaciones del principal constituyente
de este polımero, el xilano, son tambien obstaculo.
10 CAPITULO 1. PRELIMINARES
Acetilaciones. Las acetilaciones de los xilanos reducen la digestibilidad de la biomasa.
Por esto, la manipulacion genetica en la sıntesis de los xilanos en la planta es una
herramienta novedosa para aumentar la digestibilidad de la biomasa.
Cristalinidad de la celulosa. La alta cristalinidad de la celulosa (alrededor de dos ter-
ceras partes) hace menos accesible esta a la actividad enzimatica [36]. Se ha demostra-
do que la disminucion del area superficial disminuye la cristalinidad de la celulosa
aumentando de este modo la digestibilidad de la biomasa [36]. Sin embargo, el efecto
de la cristalinidad es tema de discusion por la variabilida de los resultados obtenidos
[31, 29], por lo tanto, se ha sugerido que el problema no radica en la cristalinidad en
sı misma sino en otros factores que nada tienen que ver, como condiciones de secado
de la materia prima, metodologıas para la medicion de la cristalinidad y residuos de
celulas y proteınas en las muestras [29].
DP de la celulosa. Aunque se puede definir de varias formas, el grado de polimerizacion
i.e. es basicamente el numero de unidades monomericas por cadena de celulosa. Su
importancia esta en que determina el numero de enlaces terminales e internos β-
glucosıdicos y de sustratos para enzimas -exo y -endo. Se sabe ademas que las exoglu-
canasas tienen preferencia por los DP bajo, por lo que es mas factible que a DP bajos
la digestibilidad aumente. [29]
Area superficial interna y volumen de poro. Las celulasas se deben adherir a la su-
perficie del sustrato para poder hidrolizarlo. Ası, al aumentar la superficie interna y
en consecuencia el volumen del poro, se facilita el acceso de la enzima a su sustrato.
1.4. Pretratamiento
El objetivo de todo pretratamiento es aumentar la digestibilidad del material lignocelulosico
mediante la alteracion fısico–quımica de sus componentes i.e. lignina, celulosa, hemicelu-
losa. Como resultado del pretratamiento se pueden producir azucares o sales carboxılicas
que son posteriormente transformadas en combustibles lıquidos.
La variedad de maneras de conseguir este objetivo, al superar, en mayor o en menor grado,
alguno de los obstaculos de la lignocelulosa se traduce en multiples tipos de pretratamiento,
a saber: fısicos, quımicos y biologicos.
Sierra [29] enumera algunos objetivos, a parte del ideal (preservar totalmente la celulosa),
que un pretratamiento deberıa conseguir; entre estos estan:
1. Alta produccion de hemicelulosa por su efecto en la eficiencia y economıa del proceso.
1.4. PRETRATAMIENTO 11
2. Limitar la formacion de coproductos que inhiban la fermentacion.
3. Minimizar la demanda energetica (clave en la viabilidad economica de un proyecto a
gran escala).
4. Ser efectivo en multiples biomasas lignocelulosicas.
1.4.1. Algunos tipos de pretratamientos
Biologicos. En este tipo de pretratamiento se utilizan microorganismos, generalmente
hongos blancos y rojos de la prodredumbre, que degradan lignina y hemicelulosa y,
en menor medida, la celulosa. En el caso del bagazo de cana de azucar, Goncalves
[14], encontro que el avance de la deslignificacion luego de un proceso organosolv
estaba asociado a la produccion de las enzimas lignina peroxidasa (LIP), manganeso
peroxidasa (MnP) y lacasas (Lac).
Mecanicos. Consisten en reducir el tamano de partıcula y la cristalinidad de la celulosa.
Se utilizan procesos de molienda, astillado y fresado para obtener un tamano de
martıcula de entre 10–30 mm para molienda y de 0.2–2 mm para astillado y fresado.
Ademas de estos, tambien se utilizan molinos de bolas y de martillos. Presentan
sin embargo desventajas economicas frente a otros tipos de pretratamiento [1]. Otro
proceso mecanico y muy novedoso es el de extrusion, en el que, tal como en una
extrusora de plasticos, se aplican esfuerzos de cizalla y calentamiento para modificar
fısica y quımicamente la biomasa.
Alcalinos. Se ha encontrado que la adicion de hidroxidos de sodio, potasio, calcio y amonio
aumenta la digestibilidad de la biomasa al tiempo que su efeto en la degradacion de
los azucares es menor [1]. [19] reporto una reduccion del contenido de lignina original
en madera (hardwood) pasando de un 24–50 % a un 20 % al tiempo que se aumento la
digestibilidad de un 14 % a un 55 %. Los pretratamientos con cal Ca(OH)2 son tratados
en la siguiente seccion.
Acidos. Generalmente se utiliza acido sulfurico sobre otros acidos fuertes por motivos
economicos y de corrosion. La reaccion se puede llevar a cabo en reactores batch
y continuos (PFR). En los primeros se encontro que el rendimiento de glucosa au-
mentaba notablemente con la temperatura, alcanzando un maximo del 40 % [21]. Por
otro lado, el reactor continuo presenta mejores rendimientos de glucosa (50 %) [21].
No obstante la facilidad de su implementacion, este tipo de pretratamiento presenta
inconvientes en el posterior aprovechamiento de la glucosa. La generacion de furfural
como coproducto de la hidrolisis es uno de ellos. [32] encontraron que la adicion de
12 CAPITULO 1. PRELIMINARES
pulsos de furfural en la etapa de crecimiento exponencial de S. Cerevisiae reducıa
fuertemente el crecimiento celular.
AFEX. “Ammonia Fiber Explosion”. El material lignocelulosico se expone a amoniaco
lıquido a una alta presion y temperatura durante el tiempo de reaccion. La presion
es luego liberada causando una explosion del material. Tiene la ventaja de que el
amoniaco se puede recuperar y se puden altos niveles de deslignificacion. Sin embargo,
no es recomendada para su uso en biomasa de maderas [29].
Organosolv. En este se utilizan mezclas diversas de solventes organicos o acuosos como
por ejemplo metanol, etanol, acetana, etilenglicol con lo cual se puede solubilizar la
lignina. Estos pretratamientos van acompanados generalmente por un tratamiento
acido para romper enlaces hemicelulosicos [1]. Sin embargo, los costos asociados a los
procesos de separacion hacen que se deba revaluar este pretratamiento.
1.5. Pretratamiento alcalino
Los pretratamientos alcalinos han sido ampliamente utilizados especialmente en el proceso
conocido como kraft pulping, mediante el cual se reduce el contenido de lignina de virutas
de madera para dejar libre la fibra celulosa y ası obtener papel [7] Generalmente estos pre-
tratamientos utilizan grandes cantidades de hidroxido de sodio (NaOH) y sulfuro de sodio
(Na2S) como agentes deslignificantes. Sin embargo, las severas condiciones a las que se da
este proceso, i.e. una temperatura muy superior al punto de ebullıcion del agua y una alta
concentracion del alcali (1M) ocasionan, a pesar de retirar rapidamente la lignina, una alta
degradacion de carbohidratos y efectos adversos en las caracterısticas mecanicas de la fibra.
[7]
En el ambito del tratamiento de residuos agrıcolas para la produccion de combustibles,
los pretratamientos con hidroxido de sodio o amoniaco han mostrado una mejora en la
digestibilidad de la biomasa [3]. En [35] se comparan los resultados de deslignificacion de
bagazo de cana de azucar para pretratamientos con NaOH y acido peracetico, un acido
debil. Para ambos se reporta una degradacion de lignina superior al 94 %. Por otro lado,
McIntosh et.al. [22] obtuvieron un aumento de mas de 6 veces en la digestibilidad enzimatica
para un pretratamiento con NaOH a 121◦C y 30 min de paja de trigo.
Los pretratamientos con cal resultan mas favorables economicamente en comparacion con
los otros tipos de pretratamientos alcalinos por los bajos costos del reactivo, y su posible
recuperacion del agua en forma de carbonato de calcio insoluble que luego puede ser con-
vertido en cal [23]. Ademas, presenta una mayor degradacion de las acetilaciones de los
1.6. QUIMICA DE LA DESLIGNIFICACION 13
xilanos lo que conlleva a un mejor acceso de enzimatico y la degradacion de lignina es de
moderada a buena [29, 4]
En su estudio, Chang et.al [3] pretrataron con cal biomasa de Panicum Virgatum o switch-
grass con el fin de cuantificar el efecto de la cal como agente deslignificante en este pasto
tan comun en Norteamerica. Los pretratamientos, a 100 y 120◦C, durante 2 horas y una
carga de cal de 0.1 g por g de biomasa seca, lograron disminuir el contenido original de
lignina en un 29 % y de xilano en un 26 %. Ademas solo se presento una degradacion del
10 % de glucano.
Chang et.al [4] pretrataron residuos de bagazo de cana de azucar con cal a diferentes con-
centraciones, a diferentes temperaturas y durante varios tiempos de reaccion. Encontraron
que altas temperaturas (85◦C-135◦C) durante tiempos cortos de pretratamiento (1-3h) lo-
gran altos rendimientos de azucares luego de la hidrolisis enzimatica. Mas especıficamente,
se paso de 153 mg Eq de glucosa/ g biomasa en biomasa sin pretratar a 659 mg equivalentes
de glucosa/ g biomasa. Algo similar ocurrio con la paja de trigo, la otra biomasa analizada
en ese estudio.
Una forma que ha resultado existosa en la deslignificacion de biomasa ha sido la adicion de
agentes oxidantes como H2O2 [1], que es el usado en este estudio tambien.
1.6. Quımica de la deslignificacion
Durante la degradacion de la lignina se han establecido 3 etapas en las que se rompen los
enlaces entre las unidades de la molecula hasta obtener moleculas simples que carezcan de
enlaces para romper [33], sin embargo, dado que la degradacion de la lignina es en ultimas
una despolimerizacion, se pueden presentar reacciones secundarias de condensacion que
tienen un efecto negativo [26, 29, 33]. Especıficamente, la degradacion depende del ataque
a enlaces del tipo α-aril eter y β-aril eter [26]. Ademas, la formacion de grupos carboxilos
hace mas soluble la lignina degradada [13].
El proceso global de deslignificacion se puede caracterizar mediante tres etapas, a saber:
inicial, de masa (bulk) y una residual. Las estructuras fenolicas y carbonil reaccionan en
la primera etapa, conllevando a aproximadamente un 20 % de degradacion de la lignina.
En la etapa bulk se remueve la mayor parte de la lignina y las estructuras no fenolicas son
atacadas; esta etapa, a diferencia de la primera es lenta. Por ultimo, en la etapa residual
14 CAPITULO 1. PRELIMINARES
se presenta la degradacion de carbohidratos [6]. La lentitud de esta etapa esta asociada a
la presencia de un grupo hidroxilo en los carbonos α– y γ– en la unidades de fenilpropano.
Es conocido que el rompimientos de los enlaces β-aril eter de las unidades no fenolicas
durante la etapa bulk, produce estructuras fenolicas que seran claves en el desarrollo de las
reacciones de la primera etapa, esto es, en el rompimiento de enlaces α-aril eter y β-aril
eter en unidades fenolicas. A continuacion se muestra la principal reaccion, i.e. la de ataque
a los enlaces β–O–4 en las estructuras no fenolicas:
Figura 1.4: Reaccion de rompimiento de enlaces β–O–4 [6]
Se sabe [26] que la etapa inicial tiene una energıa de activacion baja en comparacion con
la de las otras etapas; por ello, las reacciones de fragmentacion de la lignina ocurren a una
velocidad mayor o igual a la de difusion.
Al adicionar un agente oxidante como el peroxido de hidrogeno, el ataque a las unidades
fenolicas de la lignina, por medio de la generacion de iones hidroxilo, se da en tres etapas,
a saber: adicion al anillo aromatico en unidades no fenolicas, abstraccion de electrones
por iones fenolato, abstraccion de hidrogeno de las cadenas laterales [13]. Durante el
pretratamiento con H2O2 los radicales hidroxilo reaccionan con la lignina a una tasa de
reaccion mas alta que la de la reaccion entre los radicales y la celulosa, por lo que el
efecto de degradacion de carbohidratos durante el pretratamiento, aunque es menor, siempre
esta presente [15]. La ecuacion 1.1 muestra la reaccion de descomposicion del peroxido de
hidrogeno:
HO• + H2O2 −→ HO2• + H2O k = 3× 107M−1s−1
HO• + HO2 −→ O2
• + H2O k = 8× 108M−1s−1
(1.1)
Asimismo, se ha encontrado que durante el proceso de deslignificacion las estructuras fenoli-
cas asociadas a la lignina son degradadas a tasa de reaccion moderadas. Por otro lado, se
1.6. QUIMICA DE LA DESLIGNIFICACION 15
sabe [29] que en las reacciones que involucran la formacion de radicales hidroxilo (HO−)
pueden oxidar los grupos hidroxilo de la celulosa, y en consecuencia producir cetonas. Mas
aun, dadas las severas condiciones alcalinas de este tipo de pretratamientos se pueden dar
reacciones que degraden la cadena celulosica [29].
Capıtulo 2
Materiales y metodos
En este capıtulo se presenta la metodologıa llevada a cabo durante el pretratamiento
de la biomasa y su posterior caracterizacion. Se introducen los conceptos y parametros
involucrados en el desarrollo del modelo cinetico.
2.1. Petratamiento
Los pretratamientos se realizaron variando las condiciones de temperatura, tiempo de reac-
cion y concentracion del agente oxidante, H2O, de acuerdo al siguiente diseno factorial de
tres factores y multiples niveles (5×4×3) ası: 50, 75, 100, 120, 150◦C; 30, 60, 120, 240 min;
1, 2, 5 % H2O.
El pretratamiento de la biomasa se hizo en dos sistemas de reaccion diferentes. En el primero
se utilizaron vasos con control de temperatura y agitacion; en el segundo se uso el banco
de reactores Parr 5000 de la Universidad que cuenta con control de temperatura, presion y
agitacion. Este banco de reactores tiene un sistema de calentamiento de 250 W que provee
una rata de calentamiento de 15◦C por minuto.
Para ambos sistemas de reaccion se trabajo con una dosis de cal en exceso de 0.5 g/g
de biomasa y una agitacion constante de 800 rpm que aseguro una mezcla homogenea.
En los experimentos de la primera fase se incorporaron 15 gr de biomasa con 7.5 gr de
Ca(OH)2 en 300 ml de H2O2, mientras que en el segundo sistema, debido a lımites de volu-
men (52.5 ml aprox.),se redujo esta cantidad a 1.5 gr de biomasa y 0.75 gr de hidroxido de
calcio en 30 ml de H2O2. En la primera fase se utilizaron concentraciones de H2O2 de 1 %,
2 % y 5 %, las temperaturas del sistema fueron 50◦C y 75◦C y los tiempos de reaccion de
16
2.2. HIDROLISIS ENZIMATICA 17
30, 60, 120 y 240 min. El resto de experimentos fueron realizados en el banco de reactores.
Finalizados los pretratamientos, la mezcla reactiva fue neutralizada con HCl 5N para de-
terminar el consumo de cal, luego se filtro y de los solidos obtenidos se tomaron 2 muestras
para la hidrolisis acida y enzimatica de la biomasa pretratada.
Para la determinacion de la humedad se tomo una tercera muestra que se llevo al horno
durante 24 horas a 105◦C.
De la cuantificacion de los solidos luego del pretratamiento, se define el concepto de rendimien-
to global YT ası:
Definicion 2.1. El rendimiento global del pretratamiento, YT , es la razon entre la cantidad
en gr de biomasa que entra al pretratamiento y la que sale.
2.2. Hidrolisis enzimatica
Durante esta etapa se determina la digestibilidad de la biomasa pretratada al cuantificar la
cantidad de azucares monomericos luego de la reaccion enzimatica. Aunque no esta clara-
mente establecido los mecanismos de reaccion de la celulasa sobre la celulosa (ref), se ha
sugerido, a raız del trabajo de Reese [27], que dichos mecanismos involucran cambios fısicos
en la celulosa en conjunto con la accion de enzimas exo y endo. En [34] se proponen 3
procesos que ocurren simultaneamente en los sistemas celulasa-celulosa.
Cambios fısicos y quımicos en la celulosa sin solubilizar.
Hidrolisis primaria en la que se producen probablemente polımeros de glucosa (celodex-
trinas) con DP mayor a 4 aprox.
Hidrolisis secundaria de intermediarios solubles a otros de menor peso molecular y
finalmente a glucosa.
Dada la menor velocidad de reaccion de la hidrolisis primaria en comparacion con la secun-
daria [27, 34] los productos solubilizados que son dectectables son glucosa y otros polımeros
de bajo peso molecular [27, 34].
Para la hidrolisis de las muestras se tomaron 0.05 gr de biomasa pretratada a los que se
les agregaron 2.5 ml de buffer citrato 0.1M, 1 ml de azida de sodio al 5 % para mantener
el pH constante y evitar contaminacion microbiana, respectivamente y 1.5 ml de agua
desionizada. La carga de enzima se determino de acuerdo a la actividad obtenida y fue de
17 microlitros. Las muestras se mantuvieron por 48 horas en una incubadora a 50◦C con
agitacion constante de 150 rpm. Finalizada las 48 horas de hidrolisis, las muestras fueron
18 CAPITULO 2. MATERIALES Y METODOS
Figura 2.1: Esquema hidrolisis enzimatica [2]
calentadas hasta desnaturalizar la enzima. Luego de filtrar las muestras, la cuantificacion de
glucosa y xilosa se determino mediante cromatografıa lıquida de alto rendimiento (HPLC)
con una columna Agilent 1290 Infinity.
2.3. Hidrolisis acida
Para la hidrolisis de la biomasa pretratada se anadieron 3 ml de acido sulfurico 72 % a 0.3
gr de biomasa en tubos de ensayo. A continuacion se incubaron durante 1 hora a 30◦C
con agitacion constante. El contenido de los tubos de ensayo fue luego trasvasado a un
frasco de tapa rosca donde la concentracion original de 72 % del acido fue reducida a 4 %
al diluir el contenido en 84 ml de agua desionizada. Los frascos se metieron al autoclave
por 1 h a 121◦C. Las muestras hidrolizadas fueron luego lavadas y filtradas y el licor del
filtrado neutralizado hasta un pH de 4 con carbonato de calcio para su posterior analisis
de azucares. Usando el reactivo DNS (acido 3,5-dinitrosalicılico) se pudo cuantificar la
presencia de azucares reductores en el licor antes obtenido medido como equivalentes de
glucosa, ya que se utilizo un estandar de glucosa.
2.4. ANALISIS DE DATOS 19
2.4. Analisis de datos
En general, para los pretratamientos, el rendimiento esta determinado por la cantidad de
lignina o carbohidratos degradados durante la reaccion. Se pueden determinar mendiante
la ecuacion 2.1[29]:
Yi =CiYTCi0
(2.1)
donde:
i: lignina L, carbohidratos C
Yi: rendimiento del pretratamiento para el componente i en el tiempo t (kg de componente
residual/kg de componente i en la materia prima)
Ci0: contenido del componente i en el tiempo cero (kg componente i en materia prima/kg
materia prima)
Ci: contenido del componente i en el tiempo t (kg componente i en materia prima/kg
materia prima)
YT : solidos totales despues del pretratamiento (kg de biomasa residual/kg de materia
prima)
Un concepto util para definir la cantidad de carbohidratos recuperados despues del pre-
tratamiento y la hidrolisis enzimatica es el rendimiento global, YOi. Mas especıficamente,
se cuantifica la cantidad de glucano y xilano despues del pretratamiento.
YOi = YcYei (2.2)
donde:
i: carbohidrato (glucano o xilano)
YOi: rendimiento global del componente i (kg de componente i hidrolizado/kg de compo-
nente i en la materia prima)
Yei: rendimiento durante pretratamiento del componente i en (kg componente residuali/kg
componente i en la materia prima)
Yi: rendimiento enzimatico del componente i(kg componente i hidrolizado /kg componente
i despues del pretratamiento (lavada y neutralizada))
20 CAPITULO 2. MATERIALES Y METODOS
2.5. Modelo cinetico
A partir de los conceptos planteados en la seccion anterior se pueden generar modelos
cineticos a traves de los cuales se pueda estimar el proceso de delignificacion del material y
de la degradacion de los carbohidratos presentes en la biomasa. Los parametros del modelo
energıa de activacion y factor preexponencial tambien se determinaran y se compararan
con los obtenidos en otros estudios.
La cinetica de degradacion de la lignina mediante pretratamiento oxidativo con un alcali ha
sido estudiada en el proceso de blanqueamiento de pulpa en industria papelera para sustituir
otros tratamientos que utilizan compuestos que generan desechos toxicos. El modelo cinetico
mas utilizado relaciona la degradacion de la lignina, expresada como el numero Kappa, con
una expresion que sigue la ley de potencia [8].
−dKdt
= kqKq (2.3)
siendo kq el termino que relaciona las variables temperatura, concentracion de iones hidrox-
ilo y la presion parcial de oxıgeno mediante una expresion tipo Arrhenius:
kq = Aexp
[−ERT
][OH]p
[PO2
]m(2.4)
Se ha encontrado que generalmente el orden q de la reaccion de deslignificacion esta en el
rango de 1 a 2. En cuanto a la cinetica de degradacion de los carbohidratos en los procesos
de blanqueamiento de pulpa, esta se modela de igual manera que la de la lignina con la
diferencia de que para ese proceso se asume un orden cero de reaccion.
El modelo de Schoon [28] usa tambien el modelo general de la cinetica de deslignificacion
pero asume que la deslignificacion ocurre en infinitas reacciones paralelas de primer or-
den cuyas constantes pueden ser representadas por una funcion de distribucion f(k). La
expresion que relaciona esta funcion con el orden de reaccion y otro parametro p es:
f(k) =p
1q−1k
2−qq−1
Γ[
1q−1
] exp(−pk) (2.5)
En este trabajo, el desarrollo del modelo cinetico esta basado en [29] y sigue el modelo de
2.5. MODELO CINETICO 21
ley de potencias por ser el mas estudiado. Para ello se definen los siguientes parametros:
Yi =∑j
Yij (2.6)
donde
i : L lignina, C carbohidratos
j : rapida o lenta segun la velocidad de degradacion
Yij : rendimiento del componente i en el tiempo t (g residuales de componente i/g iniciales
del componente i)
en el tiemo cero,
Yio =∑j
Yij0 = 1 (2.7)
La degradacion del componente i se define ası:
−dYidt
=∑j
kijYij (2.8)
donde,
kij = a exp
(−ERT
)(2.9)
y los parametros de la ecuacion 2.9
kij : constante (min−1)
aij : factor preexponencial (min−1)
Eij : energıa de activacion (kJ/mol)
la ecuacion 2.9 integrada da:
Yi =∑i
Yij0 exp(−kijt) (2.10)
donde
Yij0 : rendimiento del componente i (lignina o carbohidratos) (kg de componente i/kg de
componente i iniciales)
Capıtulo 3
Resultados y discusion
3.1. Composicion de la biomasa
La composicion de la biomasa se determino mediante los resultados obtenidos en la hidrolisis
acida. Los valores obtenidos se encuentran dentro de los reportados en otros textos [16, 29]
23.0%
66.5%
10.5%
Lignina
Carbohidratos
Otros
Figura 3.1: Composicion bagazo de cana de azucar
3.2. Degradacion de lignina y carbohidratos
La Figura 3.2 muestra la degradacion de lignina para las temperaturas y [H2O2] utilizadas.
Para la muestra sin pretratar el rendimiento, por definicion, es 1. Se puede observar que
la mayor degradacion de lignina ocurre a 150◦C y que alcanza un nivel estable a los 30
min de pretratamiento. En promedio, el mınimo rendimiento de lignina fue de 0.15 y se
observo a 150◦C. El rendimiento para los carbohidratos presenta un comportamiento sim-
ilar de dacaimiento con un promedio mınimo de 0.52 tambien a 150◦C. Como se muestra
mas adelante, el efecto de la concentracion de peroxido sı es un factor significativo en la
degradacion del glucano con un mınimo de rendimiento de 0.56 para [H2O2] = 5 %. De esto
resulta que los factores de pretratamiento tienen un efecto considerable sobre la preservacion
22
3.2. DEGRADACION DE LIGNINA Y CARBOHIDRATOS 23
(a) Rendimiento lignina variando concen-tracion de peroxido
(b) Rendimiento lignina variando tem-peraturas
(c) Rendimiento carbohidratos variando con-centracion de peroxido
(d) Rendimiento carbohidratos variandotemperaturas
Figura 3.2: Rendimiento de lignina y
de la celulosa en la biomasa.
Al hacer una analisis de varianza a los valores obtenidos, se encontro que los factores con
mayor influencia en el rendimiento de lignina (YL) son, independientemente, la temper-
atura y el tiempo, ambos con p–value menores a 0.05. La Figura 3.2(a) muestra el efecto
despreciable de la concentracion de peroxido en el rendimiento de lignina. Por otro lado, el
rendimiento de carbohidratos (YC) sı se ve afectado por los factores de temperatura, tiempo
y concentracion de peroxido y sus interacciones binarias y ternarias.
3.2.1. Estudio cinetico
Como se ve en las Figuras 3.3, 3.4, son facilmente identificables las dos etapas de la reaccion
para la degradacion de lignina y carbohidratos. En el caso de la lignina la transicion de la
fase lenta a la rapida, identificada por un cambio de pendiente en la curva, ocurre entre los
≈60 min y ≈120 min a 150◦C y 50◦C, respectivamente. Esto como efecto de la dependencia
positiva de la constante de Arrhenius de la temperatura. La energıa de activacion de la
reaccion de degradacion de lignina es similar a la obtenida en otros estudios [24, 17, 11] y
es menor en la etapa lenta; por lo tanto, la mayor degradacion de lignina ocurre durante
24 CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSION
Cuadro 3.1: Parametros cineticos degradacion de lignina (α)=0.05) e intervalos de confianza
Parametro Unidades Lımite inferior Valor estimado Lımite superior
YLf0 g lignina/g lignina en biomasa 0.33 0.38 0.44aLf min−1 -1.90E+06 3.24E+05 2.54E+06nLf Adimensional 0.44 0.94 1.45aLs min−1 -3.49E+04 9.57E+03 5.40E+04ELs kJ/mol 22.2 34.8 47.4nLs Adimensional 0.25 0.61 0.96
Cuadro 3.2: Parametros cineticos degradacion de carbohidratos (α=0.05) e intervalos deconfianza
Parametro Unidades Lımite inferior Valor estimado Lımite superior
YCf0 g carb./g carb. en biomasa 0.56 0.63 0.70aCf min−1 -6.64 1.82E+00 10.2ECf kJ/mol 6.63 22.6 38.6nCf Adimensional 0.17 0.80 1.42aCs min−1 -3.19E+03 4.94E+02 4.18E+03ECs kJ/mol 7.02 27.6 48.31nCs Adimensional -1.28E+07 2.53E-14 1.28E+07
esta etapa. El orden de reaccion con respecto al H2O2 baja de ≈0.94 a ≈0.61 para la etapa
rapida y lenta, respectivamente. Esto sugiere una mayor dependencia de la degradacion de
lignina a la concentracion de H2O2 para la etapa rapida, si bien en ambas es importante. El
rendimiento de carbohidratos presenta, al igual que el de la lignina, una transicion de la fase
rapida a la lenta entre los mismos valores observados para la lignina. Para la degradacion
de los carbohidratos la energıa de activacion de la etapa lenta de la reaccion es algo mayor
(22 %) que la de la etapa rapida. Este hecho, observado tambien en [29] indica que la mayor
degradacion de carbohidratos sucede durante la etapa rapida por lo que la temperatura
de transicion es de vital importancia en este caso para la preservacion de la celulosa. A
su vez, el orden de reaccion con respecto al H2O2 es cercano a 1 (≈0.80) en la primera
etapa mientras que resulta despreciable en la etapa lenta. De esto se puede concluir que la
degradacion de carbohidratos es indiferente a la concentracion de H2O2 a partir del punto
de transicion entre las fases de reaccion.
3.2. DEGRADACION DE LIGNINA Y CARBOHIDRATOS 25
(a) 50◦C (b) 75◦C (c) 100◦C
(d) 120◦C (e) 150◦C
Figura 3.3: Ajuste de datos para el modelo de degradacion de carbohidratos
26 CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSION
(a) 50◦C (b) 75◦C (c) 100◦C
(d) 120◦C (e) 150◦C
Figura 3.4: Ajuste de datos para el modelo de degradacion de lignina
3.3. RENDIMIENTO GLOBAL 27
3.2.2. Selectividad del modelo
Para este trabajo se definio la selectividad integral como la razon entre la lignina removida
y la cantidad de carbohidratos removida a cada tiempo de pretratamiento:
SG =1− YL1− YC
=1−
∑i YiL0 exp(−kiLMniLt)
1−∑
i YiC0 exp(−kiCMniC t)(3.1)
donde i hace referencia las etapas de la reaccion. Como lo muestra la Figura 3.5, para
todos los pretratamientos a 5 % de [H2O2] la selectividad tiene una tendencia decreciente,
con una pendiente mas pronunciada para los temperaturas mayores a 100◦C lo cual puede
indicar que para estas condiciones la degradacion de la lignina ocurre rapidamente dejando
a los carbohidratos, en particular al glucano, libres. Para temperaturas bajas (50◦C–75◦C)
la selectividad tiende a aumentar, por lo que se puede pensar que para estas temperaturas
es donde ocurre la mayor degradacion de lignina.
3.3. Rendimiento global
Las condiciones optimas de pretratamiento se encontraron de acuerdo con la ecuacion 2.2
dado que esta combina informacion del rendimiento del pretratamiento y de la hidrolisis en-
zimatica, cuyo incremento es el objetivo de todo pretratamiento. La Figura 3.6 presenta los
resultados obtenidos de rendimiento global YO. Las condiciones optimas de pretratamien-
to se dieron a 100◦C, 30 min y [H2O2]=1 %. Las condiciones halladas corresponden a un
rendimiento de 0.06. Aunque el valor obtenido es considerablemente bajo, debido a un
problema en la actividad enzimatica reportada por el fabricante, se observa claramente
que a las condiciones reportadas el rendimiento es maximo. Por lo tanto, al utilizar una
enzima adecuada, con actividad alta, se deberıa observar el optimo cerca a las condiciones
mencionadas.
28 CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSION
*(a) 50◦C (b) 75◦C
(c) 100◦C
(d) 120◦C (e) 150◦C
Figura 3.5: Selectividad integral para los pretratamientos
3.3. RENDIMIENTO GLOBAL 29
Figura 3.6: Rendimiento global del pretratamiento
Conclusiones
Este trabajo mostro la eficacia del pretratamiento con cal y H2O2 para incrementar la
digestibilidad enzimatica del bagazo de cana. Las condiciones optimas de pretratamiento
fueron 100◦C, 30 min y [H2O2]=1 %. Aunque el rendimiento de los pretratamientos a 50◦C
y 75◦C no se evaluo, se espera que los resultados no cambien, dada la poca degradacion
de lignina a estas temperaturas. En cuanto a la degradacion de lignina y carbohidratos se
identificaron como significativos los parametros de temperatura y tiempo y de temperatura,
tiempo y concentracion de peroxido, respectivamente.
El modelo cinetico desarrollado describe bastante bien los valores observados y logra ex-
plicar los procesos reactivos que se dan durante el pretratamiento. Al igual que en estudios
anteriores [16, 29], la degradacion de lignina y carbohidratos se ve favorecida por altas
temperaturas y concentraciones de H2O2. Con respecto a la degradacion de carbohidratos
se observo que la concentracion de H2O2 tiene efecto, especialmente durante la primera
etapa de reaccion. Se establecio que la temperatura de transicion durante la degradacion
de carbohidratos es un factor muy importante en la preservacion de la celulosa.
Del analisis de selectividad del modelo se puede inferir que a temperaturas mayores a 75◦C,
la degradacion de lignina tiende a aumentar. Para la maxima concentracion de H2O2, la
selectividad tiende a disminuir sustancialmente en todas las temperaturas; este compor-
tamiento da a entender que dada la alta alcalinidad de este factor, la degradacion de car-
bohidratos se ve muy favorecida, lo que redunda en efectos adversos para la conservacion
de la celulosa.
30
Apendice A
Pretratamiento
En estos apendices se describen los procedimientos experimentales llevados a cabo. A excepcion
del pretratamiento, todos estan basados en los protocolos de la NREL (National Renewable
Energy Laboratory)
A.1. Pretratamiento reactores Parr 5000
1. Cargar el reactor con la masa de material lignocelulosico necesaria y la masa de
hidroxido de calcio requerida (en el desarrollo de las experimentaciones previas se
pretende obtener la cantidad adecuada de material lignocelulosico, pues es indispens-
able determinar el porcentaje adecuado de solidos suspendidos), ocupando ası el 70 %
de la capacidad del reactor.
2. Iniciar el bano de refrigeracion de sellos a una temperatura de 10◦C
3. Sellar los reactores usando el procedimiento y las herramientas indicadas para ello.
4. Iniciar el calentamiento y agitacion del reactor utilizando el programa de control
computarizado. La temperatura de pretratamiento se determinara de acuerdo a los
niveles indicados en el diseno experimental.
5. La velocidad de agitacion se determinara de forma adecuada en el desarrollo de ex-
perimentaciones previas, pues dependiendo del porcentaje de solidos suspendidos y
el tamano de partıcula del material lignocelulosico, la velocidad de agitacion debe
encontrarse acorde con las variables de experimentacion, manteniendo las condiciones
de operacion del reactor.
6. El tiempo de reaccion variara en cada corrida del pretratamiento de acuerdo al diseno
experimental desarrollado.
31
32 APENDICE A. PRETRATAMIENTO
7. Una vez que el tiempo de pretratamiento se haya completado, se apagara el manto de
calentamiento del reactor y se esperara a que se encuentre a temperatura ambiente
(y por consiguiente despresurizado) antes de abrirlo.
8. El contenido del reactor se vaciara en un envase apropiado y posteriormente el reac-
tor se lavara hasta retirar completamente todos los residuos del pretratamiento y se
secara.
A.1.1. Neutralizacion de la cal luego del pretratamiento
1. Deje enfriar el reactor hasta temperatura ambiente.
2. Prepare el montaje de titulacion (plancha agitadora, potenciometro y bureta).
3. Llene la bureta con con acido HCl 5N.
4. Anote el volumen inicial de la bureta. Titule con HCl el contenido del reactor hasta
lograr un pH de 4.
5. Anote el volumen final.
6. Asegurese de que el pH es estable.
Apendice B
Determinacion de humedad de la
biomasa pretratada
1. Pese un recipiente de aluminio limpio con una precision de 0.1 mg y registrar el dato
como W1.
2. Pese entre 1-5 g de muestra de biomasa en el recipiente anterior y registre este dato
como W2.
3. Ponga la muestra en un horno a 105 ± 3 oC y mantengala lo suficiente hasta que se
registre un peso constante.
4. Saque la muestra del horno y ubicarla en un desecador, allı se deja enfriar hasta
alcanzar temperatura ambiente.
5. Pese el plato con la muestra y registre el dato como W3.
6. El porcentaje de humedad se calcula ası (ST corresponde “solidos totales” y CM a
“contenido de humedad”):
ST =W3 −W1
W2 −W1× 100 (B.1a)
CM = 100− ST (B.1b)
33
Apendice C
Determinacion de carbohidratos
estructurales y lignina
C.1. Hidrolisis acida concentrada
1. Pese 300.0 ± 10,0 mg de la muestra de biomasa en un tubo de ensayo. Anotar
el peso con una precision de 0,1 mg.
2. Anada 3.00 ± 0.01 ml de de acido sulfurico 72 %a cada tubo. Agite con una
barra de vidrio durante un minuto, o hasta que la muestra este bien mezclada.
3. Coloque el tubo en un bano marıa a 30 ± 3◦C e incube la muestra durante 60 ±5 minutos. Revuelva el contenido de cada tubo con un agitador de vidrio cada
10 o 5 minutos durante una hora. Hacer esto es esencial para garantizar que las
partıculas se encuentren en contacto con el acido y la hidrolisis sea uniforme.
C.2. Hidrolisis acida diluida
1. Al termino de la hidrolisis, retire los tubos del bano de agua. Anada 84.00 ±0.04 ml de agua desionizada para diluir el acido a un 4 % de concentracion en
un frasco de tapa rosca de 300 ml.
2. Coloque los frascos en el autoclave durante una hora a 121◦C. Asegurese de
dejarlos enfriar antes de manipularlos.
34
C.3. ANALISIS DE LIGNINA INSOLUBLE 35
C.3. Analisis de lignina insoluble
1. Filte al vacıo la solucion que autoclavada. Asegurese de obtener una alicuota del
lıquido para su analisis.
2. Lave por completo los frascos hasta que no dejar solidos y haber transferido
todos su contenido al embudo de filtracion.
3. Seque el papel filtro y el filtrado temperatura ambiente hasta lograr un peso
constante, por lo general este se logra a las 72 horas.
4. Registre el peso del residuo seco con una aproximacion de 0.1 mg.
5. El licor del filtrado debe ser neutralizado con carbonato de calcio hasta lograr
un pH de 4.
6. En el espectrofotometro UV visible, ejecute un blanco de agua desionizada.
7. Use una alıcuota del licor obtenido anteriormente para medir la absorbancia
de la muestra en el espectrofotometro UV visible. Diluir la muestra, segun sea
necesario para lograr la absorbancia en el rango de 0.7 a 1.0. Para diluir la
muestra se puede emplear agua desionizada o acido sulfurico al 4 %, pero el
mismo disolvente debe utilizarse como un blanco. Registre la absorbancia a tres
decimales. Analice cada muestra por duplicado, como mınimo. (Este paso debe
hacerse en un plazo de seis horas despues de la hidrolisis.)
C.4. Analisis de carbohidratos
1. Neutralice el licor del filtrado anterior con carbonato de calcio (CaCO3) hasta
lograr un pH de 4.
2. En el espectrofotometro UV visible, ejecute un blanco de agua desionizada.
3. Use una alıcuota del licor obtenido anteriormente para medir la absorbancia
de la muestra en el espectrofotometro UV visible. Diluir la muestra, segun sea
necesario para lograr la absorbancia en el rango de 0.7 a 1.0. Para diluir la
muestra se puede emplear agua desionizada o acido sulfurico al 4 %, pero el
mismo disolvente debe utilizarse como un blanco. Registre la absorbancia a tres
decimales. Analice cada muestra por duplicado, como mınimo. (Este paso debe
hacerse en un plazo de seis horas despues de la hidrolisis.)
Apendice D
Determinacion de actividad de la
celulasa
D.1. Preparacion del reactivo DNS
1. Mezclar 1416 ml de agua destilada, 10.6 gr de acido 3,5 dinitrosalicilico y 19.8 gr
de hidroxido de sodio. Disolver la mezcla y adicionar 306 g de sales de Rochelle,
7.6 ml de fenol fundido a 50◦C y 8.3 gr de metabisulfito de sodio.
2. Se titulan 3 ml de esta mezcla con HCl 0.1 N hasta el punto final de la fenolf-
taleına (aproximadamente 5-6 ml de HCl). Preparacion del buffer citrato
3. Mezclar 210 gr de acido cıtrico monohidratado, 750 ml de agua desionizada y
50-60 gr de NaOH.
4. Se lleva a un volumen final de 1L y se toma el pH el cual debe estar a 4.8 y si
no es ası se debe ajustar a este valor con el uso de NaOH. Procedimiento para
el ensayo de papel filtro para la sacarificacion de celulosa
5. La deteccion del rompimiento del enlace glucosıdico por este metodo consta
de un tratamiento de tres categorıas de tubos experimentales (mezclas ensayo,
blanco y control, y estandar de glucosa), los cuales se preparan como se muestra
a continuacion. El sustrato utilizado es un papel filtro Whatman No. 5
6. Tubos de ensayo de la enzima:
i. Poner una tira de papel filtro enrollado en cada tubo 13×100 mm, logrando
un peso de 0.05 g.
ii. Adicionar 1.0 ml de Citrato de sodio 0.05 M (verificar que el pH sea 4.8), el
papel filtro debe estar saturado por el buffer.
36
D.1. PREPARACION DEL REACTIVO DNS 37
iii. Equilibrar los tubos con buffer y sustrato a 50◦C.
iv. Adicionar 0.5 ml de enzima diluida en buffer citrato. Se deben realizar al
menos dos diluciones por cada muestra de enzima.
v. Incubar a 50◦C por 60 minutos.
vi. Luego del periodo de incubacion, se debe parar la reaccion adicionando 3.0
ml de reactivo DNS con intervalos de 1 minuto entre cada tubo y se agita.
7. Blanco y Control:
i. Reactivo blanco: 1.5 ml de buffer citrato.
ii. Enzima control: 1.0 ml de buffer citrato + 0.5 ml de dilucion enzimatica.
iii. Sustrato control: 1.5 ml de buffer citrato + tira de papel filtro.
8. Estandares de glucosa:
i. De un stock de solucion de glucosa anhidro (10 mg/ml), se toman alıcuotas
que deben ser selladas y almacenadas en un refrigerador. El estandar se debe
vortecear despues de la descongelacion para asegurar una mezcla homogenea.
ii. Las diluciones se hacen a partir del stock anterior de la siguiente forma:
1.0ml + 0.5ml buffer= 1:1.5= 6.7mg/ml (3.35mg/0.5ml)
1.0ml + 0.5ml buffer= 1:2= 5mg/ml (2.5mg/0.5ml)
1.0ml + 2.0ml buffer= 1:3= 3.3mg/ml (1.65mg/0.5ml)
1.0ml + 4.0ml buffer= 1:5= 2mg/ml (1.0mg/0.5ml)
iii. Los tubos de estandar de glucosa se deben preparar adicionando 0.5 ml de
cada una de las anteriores diluciones a 1.0 ml de buffer citrato en un tubo
de ensayo de 13×100mm.
iv. Los blanco, los controles y los estandares de glucosa deben ser incubados a
50◦C junto con los tubos de la enzima, y luego de 60 minutos se debe detener
la reaccion adicionando 3.0 ml de reactivo DNS.
9. Desarrollo de color:
i. Ponga los tubos en un recipiente con agua hirviendo vigorosamente durante
5 minutos.
ii. Luego de este tiempo se ponen en un bano de agua con hielo durante 15
minutos.
iii. Vortecear nuevamente los tubos.
iv. Se diluyen todos los tubos en agua (0.2 ml de reaccion con color + 2.5 ml
de agua).
v. La solucion diluida se lleva a una celda para espectrofometro que se encuen-
tre limpia y libre de impurezas.
38 APENDICE D. DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE LA CELULASA
vi. Medir la absorbancia del blanco que es buffer citrato a una longitud de onda
de 540 nm.
vii. Medir la absorbancia de todas las muestras y registrar este dato.
10. Calculos
i. Construir una curva lineal de la glucosa estandar usando las cantidades
absolutas de glucosa (concentraciones) en contra de la absorbancia.
ii. Use la curva estandar para determinar la cantidad de glucosa liberada para
cada muestra despues de retirar el blanco de enzima.
iii. Estime la concentracion de la enzima que habrıa liberado 2.0 mg de glucosa
por medio de un grafico liberada glucosa contra del logaritmo de la concen-
tracion de la enzima. Para encontrar la concentracion de enzima requerida
tome dos puntos cercanos a 2.0 mg y trace una recta entre los dos, use esta
lınea para interpolar entre los dos puntos y hallar la dilucion de enzima que
producirıa 2.0 mg de glucosa de azucar reductora.
iv. Calculo de FPU:
Actividad de Papel Filtro =0,37
[enzima] que libera 2.0 mg de glucosa
Apendice E
Hidrolisis enzimatica
Este procedimiento esta basado en el protocolo del NREL “Enzymatic Saccharification of
Lignocellulosic Biomass” y en [29]. Sirve para determinar la digestibilidad enzimatica de
la materia prima con o sin pretratamiento
E.1. Preparacion
1. Determine el contenido de humedad de las muestras usando el protocolo dado
en B.
2. Mida el contenido de glucano de acuerdo a C
3. Tener en cuenta el rendimiento de masa del pretratamiento.
4. Medir la actividad enzimatica.
5. Calcule la cantidad de biomasa equivalente a 0.1 g de glucano en la biomasa sin
pretratar ası:
B =0,1
G× STdonde B es la biomasa a ser pesada, G la fraccion de glucano en la biomasa
pretratada y ST la fraccion de solidos en la muestra Calcule la cantidad de
enzima a usar ası:
E1 =
(0,1YG
)E
EA
donde E1 es la cantidad de enzima a aplicar, E la carga de enzima = 15 FPU/g
glucano en biomasa cruda, EA es la actividad de la enzima y YG es el rendimiento
de glucano del pretratamiento.
39
40 APENDICE E. HIDROLISIS ENZIMATICA
E.2. Procedimiento hidrolisis enzimatica
1. Prepare una solucion de acido cıtrico disolviendo 210 g de acido cıtrico mono-
hidrato en 1000 ml de agua destilada y luego ajuste el pH a 4.5 anadiendo NaOH.
Esta solucion es 1 M, diluyala a 0.1 M antes de la hidrolisis.
2. Pese B g de biomasa.
3. Agregue 5 ml la solucion amortiguadora de citrato de sodio (0.1 M, pH 4.8),
tetraciclina (40 µ, 10 mg/ml en etanol 70 %), cicloheximida (30 µ, 10 mg/ml
en agua destilada) (como antibioticos), agua destilada grado HPLC (W = 5 −B −E1 −E2) donde B y E1 se definieron antes y E2 es la cantidad de celobiosa
requerida para tener 60 CBU/g.
4. Mida el pH y ajustelo a 4.8 con NaOH
5. Precaliente los viales donde se tienen las muestras y coloquelos en una incubadora
a 50◦C durante 1 hora. Asegurese de que haya buen mezclado.
6. Retire los viales, anada la enzima y vuelva a ponerlos dentro.
E.3. Analisis
1. Una vez completado el tiempo de hidrolisis saque las muestras en el orden en
que la enzima les fue aplicada.
2. Ponga las muestras en agua hirviendo para desnaturalizar la enzima por 15 min.
3. Transfiera el contenido a tubos de 15 ml y centrifugue por 10 min a 4000 rpm.
4. Filtre las muestras a traves de membranas de 0.2 µm y ponga el lıquido en los
viales del HPLC.
5. Analice los estandares de calibracion y las muestras en la columna HPLC Agilent
bajo las siguientes condiciones:
i. Volumen de inyeccion de 20 µl
ii. Fase movil: agua grado HPLC filtrada y desgasificada
iii. Flujo: 0.55 ml/min
iv. Temperatura de la columna: 85◦C.
v. Detector de temperatura: temperatura ambiente.
vi. Detector: ındice refractivo.
vii. Tiempo de corrida: 35 min.
E.4. CALCULOS 41
E.4. Calculos
% de digestion =CHPLC × 10×AC
0,1
donde:
i. CHPLC es la concentracion del azucar como la da el HPLC en g/ml
ii. AC correccion anhidro para calcular la concentracion de azucares polimericos de
la concentracion correspondiente de azucares monomericos. 0.88 para glucosa y
manosa.
Apendice F
Resultados
F.1. YL y YC
g peroxido/g biomasa Temperatura (K) Tiempo (min) YL YC
0.288 323.15 0 1 1
0.288 323.15 30 0.806487963 0.791438532
0.288 323.15 60 0.692458651 0.665617009
0.288 323.15 120 0.677202941 0.609536528
0.288 323.15 240 0.616420269 0.677801941
0.576 323.15 0 1 1
0.576 323.15 30 0.627240108 0.749810945
0.576 323.15 60 0.534093695 0.772846925
0.576 323.15 120 0.413465158 0.768290479
0.576 323.15 240 0.388418269 0.504262316
1.44 323.15 0 1 1
1.44 323.15 30 0.626106506 0.807798753
1.44 323.15 60 0.520245609 0.876304651
1.44 323.15 120 0.492948755 0.72785876
1.44 323.15 240 0.430510245 0.575036524
0.288 348.15 0 1 1
0.288 348.15 30 0.66664264 0.756511692
0.288 348.15 60 0.430907571 0.733495146
0.288 348.15 120 0.46873137 0.630849645
0.288 348.15 240 0.324247395 0.518248108
0.576 348.15 0 1 1
42
F.1. YL Y YC 43
0.576 348.15 30 0.649246655 0.636069399
0.576 348.15 60 0.436758072 0.586909399
0.576 348.15 120 0.368512309 0.701727821
0.576 348.15 240 0.312268248 0.451598917
1.44 348.15 0 1 1
1.44 348.15 30 0.536622567 0.917878844
1.44 348.15 60 0.388655511 0.695863733
1.44 348.15 120 0.33955761 0.703074607
1.44 348.15 240 0.312053001 0.520065659
0.288 373.15 0 1 1
0.288 373.15 30 0.414359429 0.730119028
0.288 373.15 60 0.500993345 0.780734396
0.288 373.15 120 0.425040744 0.674576124
0.288 373.15 240 0.429249872 0.667870153
0.576 373.15 0 1 1
0.576 373.15 30 0.309392741 0.676240556
0.576 373.15 60 0.313082295 0.70271504
0.576 373.15 120 0.270239714 0.566977549
0.576 373.15 240 0.193811154 0.479734768
1.44 373.15 0 1 1
1.44 373.15 30 0.456794519 0.589719268
1.44 373.15 60 0.298069657 0.457178854
1.44 373.15 120 0.288022829 0.375117036
1.44 373.15 240 0.094902838 0.417898247
0.288 393.15 0 1 1
0.288 393.15 30 0.428342871 0.69623172
0.288 393.15 60 0.410076478 0.667870153
0.288 393.15 120 0.222276443 0.589025144
0.288 393.15 240 0.317816168 0.597975035
0.576 393.15 0 1 1
0.576 393.15 30 0.288986882 0.475696077
0.576 393.15 60 0.292747322 0.419495607
0.576 393.15 120 0.259747016 0.546663723
0.576 393.15 240 0.271761118 0.503032116
1.44 393.15 0 1 1
1.44 393.15 30 0.143290049 0.535580454
1.44 393.15 60 0.141777896 0.410270377
44 APENDICE F. RESULTADOS
1.44 393.15 120 0.164856163 0.455423732
1.44 393.15 240 0.215574493 0.462722829
0.288 423.15 0 1 1
0.288 423.15 30 0.353399043 0.824910048
0.288 423.15 60 0.064568694 0.563409468
0.288 423.15 120 0.118681724 0.462722829
0.288 423.15 240 0.168636894 0.428532094
0.576 423.15 0 1 1
0.576 423.15 30 0.167117289 0.798414465
0.576 423.15 60 0.215636156 0.432168617
0.576 423.15 120 0.08900343 0.493471106
0.576 423.15 240 0.188703704 0.515006977
1.44 423.15 0 1 1
1.44 423.15 30 0.109186224 0.702041463
1.44 423.15 60 0.134441741 0.373850825
1.44 423.15 120 0.119887945 0.304121594
1.44 423.15 240 0.152222222 0.368866107
F.2. Analisis estadıstico
Multilevel Factorial Design
Factors: 3 Replicates: 2
Base runs: 75 Total runs: 150
Base blocks: 1 Total blocks: 1
Number of levels: 5. 5. 3
General Linear Model: YL. YA versus Temperatura. Tiempo. H_2O_2
Factor Type Levels Values
Temperatura fixed 5 1. 2. 3. 4. 5
Tiempo fixed 5 1. 2. 3. 4. 5
H_2O_2 fixed 3 1. 2. 3
F.2. ANALISIS ESTADISTICO 45
Analysis of Variance for YL, using Adjusted SS for Tests
Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P
Temperatura 4 1,92779 1,92779 0,48195 13,34 0,000
Tiempo 4 10,96553 10,96553 2,74138 75,87 0,000
H_2O_2 2 0,50196 0,50196 0,25098 6,95 0,052
Temperatura*Tiempo 16 0,74882 0,74882 0,04680 1,30 0,223
Temperatura*H_2O_2 8 0,23185 0,23185 0,02898 0,80 0,603
Tiempo*H_2O_2 8 0,21075 0,21075 0,02634 0,73 0,665
Temperatura*Tiempo*H_2O_2 32 0,43645 0,43645 0,01364 0,38 0,998
Error 75 2,71007 2,71007 0,03613
Total 149 17,73322
S = 0,190090 R-Sq = 84,72% R-Sq(adj) = 69,64%
Unusual Observations for YL
Obs YL Fit SE Fit Residual St Resid
43 -0,24147 0,05597 0,13441 -0,29743 -2,21 R
44 0,35340 0,05597 0,13441 0,29743 2,21 R
53 0,26233 0,62724 0,13441 -0,36491 -2,71 R
54 0,99215 0,62724 0,13441 0,36491 2,71 R
55 0,06529 0,53407 0,13441 -0,46878 -3,49 R
56 1,00285 0,53407 0,13441 0,46878 3,49 R
63 0,11899 0,64907 0,13441 -0,53008 -3,94 R
64 1,17915 0,64907 0,13441 0,53008 3,94 R
67 0,22781 0,50263 0,13441 -0,27482 -2,04 R
68 0,77744 0,50263 0,13441 0,27482 2,04 R
69 0,03804 0,31227 0,13441 -0,27423 -2,04 R
70 0,58650 0,31227 0,13441 0,27423 2,04 R
123 0,18076 0,45679 0,13441 -0,27603 -2,05 R
124 0,73283 0,45679 0,13441 0,27603 2,05 R
R denotes an observation with a large standardized residual.
46 APENDICE F. RESULTADOS
Analysis of Variance for YA, using Adjusted SS for Tests
Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P
Temperatura 4 0,66940 0,66940 0,16735 104,71 0,000
Tiempo 4 5,06692 5,06692 1,26673 792,61 0,000
H_2O_2 2 0,36571 0,36571 0,18285 114,41 0,000
Temperatura*Tiempo 16 1,06402 1,06402 0,06650 41,61 0,000
Temperatura*H_2O_2 8 0,74393 0,74393 0,09299 58,19 0,000
Tiempo*H_2O_2 8 0,25489 0,25489 0,03186 19,94 0,000
Temperatura*Tiempo*H_2O_2 32 0,97193 0,97193 0,03037 19,00 0,000
Error 75 0,11986 0,11986 0,00160
Total 149 9,25666
S = 0,0399773 R-Sq = 98,71% R-Sq(adj) = 97,43%
Unusual Observations for YA
Obs YA Fit SE Fit Residual St Resid
5 0,73436 0,66562 0,02827 0,06875 2,43 R
6 0,59687 0,66562 0,02827 -0,06875 -2,43 R
9 0,73658 0,67780 0,02827 0,05878 2,08 R
10 0,61902 0,67780 0,02827 -0,05878 -2,08 R
13 0,69778 0,75651 0,02827 -0,05873 -2,08 R
14 0,81524 0,75651 0,02827 0,05873 2,08 R
15 0,62393 0,73350 0,02827 -0,10957 -3,88 R
16 0,84306 0,73350 0,02827 0,10957 3,88 R
17 0,55172 0,63085 0,02827 -0,07913 -2,80 R
18 0,70998 0,63085 0,02827 0,07913 2,80 R
63 0,57096 0,63607 0,02827 -0,06511 -2,30 R
64 0,70118 0,63607 0,02827 0,06511 2,30 R
113 0,97746 0,91788 0,02827 0,05958 2,11 R
114 0,85830 0,91788 0,02827 -0,05958 -2,11 R
F.3. CODIGO MATLAB 47
F.3. Codigo Matlab
clc;
clear all;
’MaxIter’,100000000;
’TolX’,1e-3; %default: 1e-4
’LevenbergMarquardt’,’on’; %default: on
’LargeScale’,’on’; %default: on
’MaxFunEvals’,1E1000050;
global data
time=xlsread(’FinalVF.xlsx’, ’Consolidado’, ’C73:C147’);
glucano=xlsread(’FinalVF.xlsx’, ’Consolidado’, ’E73:E147’);
temp=xlsread(’FinalVF.xlsx’, ’Consolidado’, ’B73:B147’);
o2=xlsread(’FinalVF.xlsx’, ’Consolidado’, ’A73:A147’);
data=[time glucano temp o2];
data1=[glucano];
t=data(:,1);
Rexp=data(:,2);
T=data(:,3);
Po2=data(:,4);
R=8.3144/1000;
b0=[ %start values for parameters
%0.109821137
%5130145.284
%75.03220825
%0.248816109
%59496.82993
48 APENDICE F. RESULTADOS
%77.62200197
%1.107457862
0.63802
1.8181
22.627
0.80038
494.44
27.664
2.5347e-014
%0.65363
% 203.5
% 36.656
% 0.99362
% 609.55
% 27.81
%1.5937e-011
];
%LB=[0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0];
%UB=[1,Inf,Inf,Inf,1,Inf,Inf,Inf,Inf,Inf,Inf];
LB=[0,0,0,0,0,0,0];
UB=[1,Inf,Inf,Inf,Inf,Inf,Inf];
plot(t,Rexp,’ro’); % plot the experimental data
hold on
% Two possible algoritms
[b,resnorm]=lsqnonlin(’recfun2’,b0,LB,UB)
% run the lsqnonlin with start value b0,
returned parameter values stored in b
F.3. CODIGO MATLAB 49
[b,r,J,SIGMA]=nlinfit(data,data1,’recfun’,b0)
bci=nlparci(b,r,J)
newX = data(:,:);
[YPRED, DELTA] = NLPREDCI(’recfun’,newX,b,r,’jacobian’,J)
% Several possible "best" models
% Non-linear lignin
%Rcal=((1/100.^(b(4)-1))+b(1)*exp(-b(2)/(8.314*T))*Po2.
^b(3)*(b(4)-1)*t).^(-1/(b(4)-1));
% Linear lignin - 2 stages - oxygen potential
Rcal=b(1)*exp(-b(2).*exp(-b(3)./(R*T)).*Po2.^b(4).*t)+(1-b(1)).
*exp(-b(5).*exp(-b(6)./(R*T)).
*Po2.^b(7).*t);
% Linear lignin - 2 stages - oxygen ratio
%Rcal=b(1)*exp(-b(2).*exp(-b(3)./(R*T)).*(Po2./(1+b(4).*Po2)).
*t)+(1-b(1)).*exp(-b(5).
*exp(-b(6)./(R*T)).*(Po2./(1+b(7).*Po2)).*t);
%Linear lignin - 3 stages - oxygen potential
%Rcal=b(1)*exp(-b(2).*exp(-b(3)./(R*T)).*Po2.^b(4).*t)+(b(5)).
*exp(-b(6).*exp(-b(7)./(R*T)).
*Po2.^b(8).*t)+(1-b(5)-b(1)).*exp(-b(9).*exp(-b(10)./(R*T)).
*Po2.^b(11).*t);
%calculate the fitted value with parameter b and plot all
plot(t,Rexp,’ro’);
hold on;
plot(t,Rcal,’b’); % plot the fitted value on the same graph
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
function Rcal=recfun(b,b0)
global data;
t=data(:,1);
Rexp=data(:,2);
50 APENDICE F. RESULTADOS
T=data(:,3);
Po2=data(:,4);
R=8.3144/1000;
% Several possible "best" models
% Non-linear lignin
%Rcal=((1/100.^(b(4)-1))+b(1)*exp(-b(2)/(8.314*T))*Po2.
^b(3)*(b(4)-1)*t).^(-1/(b(4)-1));
% Linear lignin - 2 stages - oxygen potential
Rcal=b(1)*exp(-b(2).*exp(-b(3)./(R*T)).*Po2.^b(4).*t)+(1-b(1)).
*exp(-b(5).*exp(-b(6)./(R*T)).
*Po2.^b(7).*t);
% Linear lignin - 2 stages - oxygen ratio
%Rcal=b(1)*exp(-b(2).*exp(-b(3)./(R*T)).*(Po2./(1+b(4).*Po2)).
*t)+(1-b(1)).*exp(-b(5).
*exp(-b(6)./(R*T)).*(Po2./(1+b(7).*Po2)).*t);
%Linear lignin - 3 stages - oxygen potential
%Rcal=b(1)*exp(-b(2).*exp(-b(3)./(R*T)).*Po2.^b(4).*t)+(b(5)).
*exp(-b(6).*exp(-b(7)./(R*T)).
*Po2.^b(8).*t)+(1-b(5)-b(1)).*exp(-b(9).*exp(-b(10)./(R*T)).
*Po2.^b(11).*t);
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