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Strutture cellulari, loro funzioni e confronto fra organismi procarioti ed eucarioti

Colture di cellule e di tessuti animali

• Gli esperimenti biologici si possono condurre sia su organismi interi che su organi e tessuti animali isolati. Lavorando su tessuti e organi gli esperimenti in genere sono a breve termine, poichè è necessario mantenere il tessuto il più possibile in uno stato simile a quello fisiologico.

Perfusione

• Le colture cellulari durano più a lungo e permettono una varietà di studi che con i tessuti non è possibile. In ogni caso sia i tessuti che le colture si possono utilizzare per diversi scopi che riguardano:

• -lo studio del differenziamento cellulare (ciclo cellulare)

• -studi patologici;• -modelli sperimentali in biochimica,

farmacologia, fisiologia;• -manipolazione genetica;• -applicazioni biotecnologiche

Colture primarie e secondarie

• Per colture primarie si intendono quelle colture ottenute da cellule provenienti direttamente dal tessuto, da embrioni, da cellule adulte in sospensione o da tumori. In genere contengono una miscela relativamente eterogenea di cellule in differenti stati fisiologici. Vi sono cellule che possono crescere in sospensione o adese ad un matrice artificiale tipo la plastica ma anche al collagene.

• Le colture secondarie sono subcoltivazioni di colture primarie che si rendono necessarie quando le cellule giungono a confluenza ovvero coprono completamente la matrice a cui sono adese.

Curva di crescita• -la fase lag• - la fase log• = 3.3(log Nx - log No) / (tx - to)

– No numero cellule iniziali al tempo to– Nx numero cellule al tempo tx ; è espresso in ore h-1

• E’ noto che i procarioti crescono con scissione binaria, mentre gli eucarioti per divisione mitotica. In entrambi i casi la cellula si divide per dare origine ad altre due cellule. Pertanto, il tempo di raddoppiamento o di generazione sarà dato da:

• g = 0.301 (tx – to) / log Nx – log No

• -la fase stazionaria• -la fase di declino

lag

log

stazionaria

declino

tempo

Log numero di cellule vive

Conservazione delle cellule: la crioconservazione

• Il congelamento in azoto liquido è il metodo preferito per la maggior parte delle cellule eucariotiche, in queste condizioni a -196°C

• la vitalità cellulare sia mantenuta per il periodo durante il quale il campione è conservato in azoto liquido.

• La velocità con cui il campione viene congelato è molto importante

• lenta diminuzione della temperatura • Uso di agenti crioprotettivi (DMSO, PEG)

Conta delle cellule al microscopio

• aspirare il terreno liquido• lavagio con 5 ml di 1x PBS sterile (Phosphate Buffer Saline :

KH2PO4 0.017M, Na2HPO4 0.05M, NaCl 1.5M);• trattare le cellule con tripsina (precedentemente riscaldata a 37°C);• aggiungere 4-5 ml di terreno• trasferire la sospensione cellulare in un tubo batteriologico;• 10l di cellule di questa sospensione con 10 l di soluzione Trypan

Blue (diluizione 1/2). (Il colorante entra nelle cellule morte che risulteranno colorate di blu e quindi potranno essere riconosciute ed escluse dal conteggio)

• 10l di miscela ed un vetrino reticolato al microscopio ottico (quadrato grande = 0.1 l)

• contare le cellule vive (non colorata il blue) presenti in un quadrato. Per avere una misura statisticamente attendibile è necessario fare una media tra più quadrati;

• aliquotare le cellule in base al numero di cellule che servono

Cellula morta

• 100 cellule media di più quadrati

• 100 x 10 = 1.000

• 1.000 x 2 =2.000 (diluizione)

• 2.000 x 1000 = 2.000.000 cellule

• 2.000.000 x ml totale delle cellule