Clonaggio del DNAa che cosa serve avere dei frammenti di DNA specifici:

-per poterlo analizzare piu’ facilmente isolatamente e non insieme a tutto il resto del DNA genomico della specie su cui si vuole lavorare -per avere delle sonde con cui andare ad isolare altri frammenti di DNA

limitrofo non ancora noto-per poter poi fare delle mappe di restrizione, ossia delle mappe

genetiche fisiche in cui c’e’ corrispondenza tra lunghezza dei frammenti e mappa, diversamente dalle mappe genetiche basate sulle frequenze di ricombinazione ottenute con gli incroci

Dalle mappe genetiche in centimorgan alle mappe fisiche, i marcatori genetici comunque sono stati prima mappati e poi siè giunti ad una analisi sempre piu’ fine. La trasduzione è un sistema naturale con cui sono stati isolati frammenti di DNA batterico come in un clonaggio naturale. Negli organismi eucariotici e’ stata trovata presto l’omologia tra geni di specie diverse e cosi’ clonati geni delle specie anche lontane.

Clonaggio del DNAper poter clonare un frammento di DNA se ne devono conoscere alcune caratteristiche-si possono clonare frammenti che sfruttano l’omologia con dei

frammenti gia’ clonati-oppure che hanno delle parti in comune con altre regioni di DNA note-il metodo piu’ingenuo e’ quello di partire da frammenti ignoti e da

mappe cromosomiche trovarne la corrispondenza per poter avere dei marcatori molecolari.

Nei procarioti e’ stato molto piu’ semplice andare ad identificare le regioni genetiche a cui corrispondono dei frammenti di DNA. La coniugazione batterica permette di avere dei merozigoti con cui si possono ottenere facilmente dei ricombinanti con i marcatori voluti, con l’aiuto anche di mappe di delezione si riescono ad individuare le regioni corrispondenti ai marcatori. Il fenomeno della trasduzione e’ il metodo naturale fisiologico del clonaggio di frammenti di DNA.L’uso di enzimi di restrizione e’ stato il passo successivo per arrivare alle mappe fisiche del DNA ed al clonaggio di frammenti di DNA.

Materiale necessario per clonareEnzimi di restrizione e ligasi (eventualmente DNAsi, terminal transferasiDNA polimerasi)Vettori per il clonaggio: plasmidi, fagiTecniche di purificazione ed estrazione del DNA (inizialmente dopo la lisi cellulare si usava centrifugazione su gradienti di Cesio o altro) -ricordarsi l’esp. della semiconservativita’ della duplicaz. del DNA

di Meselson e Stahl-Cosa significa clonare, da dove deriva la parola clone: in Microbiologia alla parola clone corrisponde una colonia batterica o un placca virale o fagica. Una colonia isolata su piastra Petri su terreno solido (agarizzato) deriva da una singola cellula e quindi omogenea dal punto di vista genetico, ogni cellula e’ geneticamente uguale alle altre.In una cultura liquida ci possono essere dei mutanti che si mescolano tra le altre cellule e quindi non essere perfettamente omogenea. - ricordarsi del test di fluttuazione di S.Luria e Max Delbrück -L’eccezione e’ data dal mosaicismo, evento raro.

Vettori: Plasmidi, Virus, Batteriofagi, Cromosomi artificiali

plasmidi, sono i vettori piu’ semplici ed i primi ad esser stati utilizzati perche’ si replicano nei batteri e si purificano facilmente, sono presenti in molte copie nei batteri, la maggior parte deriva da colEI (plasmide di E.coli)- Inizialmente si usavano per il clonaggio i siti di restrizione naturali del plasmide, fino a quando sono state inserite delle mutazioni artificiali in una regione del plasmide che non provocava danni dal punto di vista funzionale del plasmide, i plasmidi possono portare la resistenza ad antibiotici (data da un enzima che li metabolizza come la -lactamasi) che risultano utili per la selezione delle cellule trasformate col plasmide.- Introdurre i plasmidi in cellule batteriche si dice trasformare e cio’ avviene in cellule che hanno la capacita’ di assorbire DNA attraverso la membrana, impropriamente dette competenti,dopo trattamento con CaCl2 oppure con altri metodi come l’elettroporazione o shock termico.Nei plasmidi per utilita’ sono state introdotte varie modifiche: piu’ resistenze ad antibiotici, un sito multiplo di clonaggio e altre funzioni.

Strutture necessarie ed utili per un plasmide- origine di replicazione- resistenza ad un antibiotico o due (ampicillina, tetraciclina,

canamicina, eritromicina, gentamicina, cloramfenicolo)- resistenza ad un secondo antibiotico eucariootico di mammifero- sito multiplo di clonaggio (multiple cloning site MCS) con la sequenza

taglio unica per gli enzimi di rstrizione piu’ comuni (non ve ne sono altri in tutto il plasmide)

- gene reporter (-gal) nel MCS indicatore dell’efficienza di clonaggio per evidenziare colonie bianche e bleu (X-gal, IPTG)

Tipi di vettori: per clonaggio e sottoclonaggi, per librerie genomiche,per cDNA, per espressione

Analisi con enzimi di restrizione:Gli enzimi di rewstrizione tagliano qualunque DNA in corrispondenza di sequenze specifiche. Per esempio: BamHI G’GATCC

Bgl II A’GATCT Eco RI G’AATTC Hind III A’AGCTT Kpn I GGTAC’C Pst I CTGCA’G Sma I GGG’CCC Hae IIII GG’CC Ecor RV GAT’ATC

alcuni tagliano al centro della sequenza palindromica del sito di restrizione (EcoRV, Hae,Sma) altri al 5’(Bam,Bgl,EcoRI,Hind) ed altri al 3’(Kpn, Pst)Come conseguenza di questo le estremita’ del taglio sono pareggiate quando il taglio e’ centrale, altrimenti sporgono al 5’ o al 3’.

Clonaggio costituito di varie fasi:

Estrazione del DNA (sia plasmidico che genomico da clonare) digestione o amplificazione (per PCR)Ligasi tra i DNA dell’ inserto

e del plasmide

Trasformazione batterica o di cellule eucariotiche o impacchettamento dei fagi o M13 (per estrusione) con helper

Selezione dei batteri per la resistenza all’antibiotico (ampicillina)o altri per cellule eucariotiche, per i fagi selez. per vitalita’

Individuazione (screening) dei batteri con plasmide ricombinantecon gene indicatore (lac z: blue/binaco)

Estrazione del DNA plasmidico trasformante (mini-midi-maxi prep)

Tipi di clonaggioLa elica del DNA e’ doppia, ognuna orientata col verso 5’ 3’ (con la numerazione degli atomi di carbonio del desossiribosio) che e’ il verso della sintesi per opera delle polimerasi sia del DNA che dell’ RNA

5’ protruding (sporgenti) Hind III

NNNA AGCTTNNN NNNT TCGA ANNN

3’ 5’

5’ 3’

NNNA 3’ 5’ AGCTTNNNNNNT TCGA 5’ 3’ ANNN

3’ protruding Kpn I

NNNGGTAC CNNN NNNGGTAC 3’ 5’CNNN NNNC CATGGNNN NNNC 5’ 3’CATGNNN

5’ 3’

3’ 5’

blunt ends (lisce, piatte) SmaI NNNCCC 3’ 5’GGGNNN NNNGGG 5’ 3’CCCNNN

Gli estremi dei frammenti di DNA ottenuti con degli enzimi di restrizione possono quindi essere utilizzati per clonare ;la digestione del DNA deve essere controllata, alcuni enzimi sono sensibili e quindi inattivi se trovano delle basi metilate nella sequenza specifica di taglio.Si possono scegliere strategie diverse di clonaggio: lo stesso sito di restrizione, uso di enzimi “isoschizomeri” che hanno lo stesso sito di taglio o parte di esso come BamHI e Sau3A

nnnG GATCC nnn nnn GATCnnnnnnn CCTAG Gnnn nnn CTAG nnnn

oppure siti di taglio ad estremita’ lisce (piatte) come SmaI, alle quali si possono attaccare altre estremita’ lisce senza ricreare il sito di restrizione oppure conservandoloUn sito di restrizione “protruding” puo’ essere reso liscio con una exonucleasi o con una polimerasi togliendo o aggiungendo le basi mancanti. Per clonare freammenti prodotti da PCR a seconda delle polimerasi si possono avere estremita’ lisce o “protruding”

I vettori :Vettori di clonaggio: plasmidi, cosmidi e fagi

- per sequenziamento: con elementi per avere singolo filamento di DNA per clonare sonde ottenendo l’inserto a singolo filamento a DNAo RNA

- i vettori di espressione in procarioti ed eucarioti (shuttle) recentemente con possibilita’ di espressione controllata

- per studiare l’attivita’di promotori ed enhancers con geni reporter: lac-z ( gal), CAT assay, luciferasi, GFP,

Con promotore costitutivo o inducibile (SV-40, CMV, HS Tk ecc.)In fusione con un gene reporter al 5’ o al 3’

poly istidine (Invitrogen)glutatione trasferasi (GST) pGEX

Sistema per studiare interazione tra proteine: il doppio ibrido, sorta di complementazione, Two hybrid vectors system(se ne parla a parte)

CORSO DI BIOLOGIA APPLICATA E PRINCIPI DI GENOMICA A.A. 2007 BU

Prof. Domenico Frezza Lezione N.2

A COSA SERVE il CLONAGGIO del DNA??A COSA SERVE il CLONAGGIO del DNA??

a creare ‘copie identiche’ (= CLONI) di un frammento di DNA

DIFFERENZE con la PCR:

• è una reazione in vivo

sfrutta l’apparato di replicazione del DNA delle cellule batteriche

si fanno duplicare le cellule

• non necessita nessuna conoscenza a priori della sequenza del frammento di DNA da clonare

non si usano primers

• è un processo più accurato

le copie di DNA ottenute sono esattamente identiche l’una all’altra

sistemi di ‘correzione degli errori’ cellulari

-per analizzarlo più facilmente isolatamente e non con tutto il resto del DNA genomico della specie su cui si vuole lavorare; -per avere delle sonde con cui andare ad isolare altri frammenti di DNA limitrofo non ancora noto;

-per fare delle mappe di restrizione, ossia delle mappe genetiche fisiche in cui c’è corrispondenza tra lunghezza dei frammenti e mappa.

A CHE COSA SERVE AVERE DEI FRAMMENTI DI DNA SPECIFICI?

???

??

?

• individuare nuovi geni da sequenziare

librerie geniche

• stabilire quali geni sono espressi in ogni tipo cellulare

librerie di cDNA

• produzione di molecole ricombinanti

vettori di espressione (es. insulina umana)

TRAMITE il CLONAGGIO

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?

PREMESSE:

1) I BATTERI CELLULE PROCARIOTICHE:

assenza nucleo

singola molecola circolare di DNA (3-4 M bp) nel citoplasma

possono acquisire facilmente piccole molecole di DNA esogeno

2) I PLASMIDI

piccole molecole circolari di DNA (3000-4000 bp) che portano pochi geni

possono facilmente essere acquisiti dalle cellule batteriche

PREMESSE:3) GLI ENZIMI DI

RESTRIZIONE

Estremità piatte o blunt

Estremità coesive o sticky

ENDONUCLEASI che tagliano il DNA in corrispondenza di specifiche sequenze di basi

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?

COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?

1. Il DNA da clonare viene tagliato con un enzima di restrizione

4. Il PLASMIDE RICOMBINATE viene inserito in una cellula batterica e al suo interno si duplica

2. inserito in un plasmide tagliato con lo stesso enzima

3. ad opera della LIGASI o della TOPOISOMERASI

ENZIMA di RESTRIZIONE

PLASMIDE

LIGASI - TOPOISOMERASI

PLASMIDE RICOMBINANTE

CELLULA BATTERICA

PUO’ SUCCEDERE CHE…

1) La cellula non acquisisce il plasmide e quindi neanche il DNA da clonare

2) Il plasmide si richiude su se stesso senza acquisire il DNA da clonare

la cellula acquisisce il plasmide ma NON il DNA da clonare

STRATEGIE per VERIFICARE che il CLONAGGIO è AVVENUTO:

1) Il plasmide contiene un gene che conferisce alla cellula la resistenza ad un antibiotico

le cellule vengono fatte crescere (e duplicare) in un terreno selettivo contente quell’antibiotico: SOLO le CELLULE CONTENENTI il PLASMIDE POSSONO DUPLICARSI nel terreno contenete l’antibiotico

2) Il DNA da clonare viene inserito all’interno di un gene che codifica per un enzima (che compie una determinata reazione metabolica) impedendo la sintesi di tale enzima

le CELLULE CONTENENTI il PRODOTTO della REAZIONE CATALIZZATA dall’ENZIMA NON CONTENGONO il DNA CLONATO

UN ESEMPIO: il TOPO-TA CloningUN ESEMPIO: il TOPO-TA Cloning

• il plasmide è tagliato in un sito che lascia delle estremità coesive di Timina mentre al frammento da clonare sono aggiunte delle estremità coesive di Adenina

• il legame tra plasimde e DNA da clonare è fatto dall’enzima Topoisomerasi

• il plasmide porta i geni per la resistenza agli antibiotici ampicillina e kanamicina

• il sito di inserzione del DNA da clonare spezza la sequenza del gene lacZ (-galattosidasi)

La La -GALATTOSIDASI e l’X-gal-GALATTOSIDASI e l’X-galL’ X-gal è un omologo del

galattosio che viene scisso dalla -galattosidasi in due prodotti uno

dei quali è di colore blu

intenso

La -galattosidasi è un enzima coivolto nella prima tappa del metabolismo del galattosio

le cellule in cui viene sintetizzata la -galattosidasi (il frammento da clonare non si è inserito) appaiono di colore BLU

le cellule senza -galattosidasi (il frammento da clonare si è inserito) appaiono di colore BIANCO

IN PRATICA:

Le FASI deL CLONAGGIOLe FASI deL CLONAGGIO

1. Preparazione del terreno di coltura e delle piastre di crescita

2. Preparazione del DNA da clonare

purificazione

creazione delle estremità coesive o “blunt”

3. Inserzione del DNA da clonare nel plasmide

4. Inserzione del plasmide nelle cellule batteriche trasformazione

5. Piastramento delle cellule e crescita

6. Recupero degli inserti o ampliconi se si usa PCR