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RomaISS

07 marzo 2014

Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare

Schema: Sindrome dell’X-Fragile (gene FMR1)

CEQ ISS

IX turno – 2013

Valutatori:

• Dott.ssa Marina Grasso

• Dott.ssa Anna Ravani

• Dott.ssa Silvia Russo

Campione 1

Campione 2

Campione 3

Campione 4



Schema Completo Schema Pre-screening



CEQ ISS

IX turno – 2013

Schema Completo: 12 laboratori

Schema Prescreening: 3 laboratori

15 Laboratori

punteggio

1 Poor performance

2 8.4

3 11.6

4 11.6

5 11.6

6 12.3

7 12.5

8 12.8

9 13.1

10 13.2

11 13.3

12 13.4

13 13.5

14 13.9

15 14

NewNew

14 Risposto correttamente

1 Errata Genotipizzazione (1 campione)

4

Campione 4

Commento: Le analisi molecolari hanno permesso

di stabilire che Ellicine Valerio presenta un genotipo

a mosaico allele normale/mutazione completa al

locus FMR1, condizione compatibile con l’indicazione

all’indagine.

IX Turno (2013) Punteggi dei 15 laboratori partecipanti

2 Schemi : Completo e Prescreening

Blu: Lab. Schema completoAzzurro: Lab. Schema Pre-scereningRosso : Poor Performance



6/7 non partecipato

VIII Turno (2012) Punteggi dei 19 laboratori partecipanti

Schema unico

1/7

media genotip. su max 5: 4.37

0 poor


0 poor


0 poor


1 poor

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipizzazione - Pettorbi

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipizzazione - Aberuste

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipizzazione - Tappenti

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipizzazione - Ellicine

Genotipizzazione

VIII Turno 2012 IX Turno 2013

Punteggio Insuff. 8/19 lab

(+2 n.v. su 76 genotipiz.)

Performance insufficiente

1/15 lab (1 su 60 genotipizz.)

Media punteggio Genotip.:

3.9 su 5Media punteggio Genotip.:

4.31 su 5

Lab 2. Schema completo:No dato grezzo SB (problemi archiviazione)

Solo MS-PCR :MS-PCR e separazione frammenti con elettroforesi su gel di agarosio.

il metodo usato deve essere esplicitato chiaramente indicando bibliogr.(Zhou et al., J Med Genet 2004)

Marcatore: meglio usare 50bp ladder


0 poor


0 poor


0 poor


1 poor

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipizzazione - Pettorbi

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipizzazione - Aberuste

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipizzazione - Tappenti

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Genotipizzazione - Ellicine

Genotipizzazione


Performance insufficiente 8/19

lab (più 2 n.v. su 76 genotipiz.)

Performance insufficiente

1/15 lab (1 su 60 genotipizz.)

Media punteggio Genotip.:

3.9 su 5Media punteggio Genotip.:

4.31 su 5

Lab 4. Schema completo: 1-Pettorbi e 3-Tappenti

L’indagine per long-PCR ha evidenziato uno smear

nel range di normalità, attribuibile ad alleli compresi

tra le 3 +/-2 e le 26 +/-2 ripetute CGG.

All’indagine per Southern Blot, si evidenzia uno

smear > 5.2 Kb con caratteristiche di mutazione piena,

sia per quanto riguarda le dimensioni della regione di

ripetute (superiore al normale) sia per quanto riguarda

la metilazione delle isole CpG al 5’ del gene FMR1

(allele metilato).

124Campione 3 124

Lab 2. Schema completo:

Long-PCR (Enhanced Polymeras Chain Reaction Assay secondo Tassone F. et al., JMD 2005)

e separazione dei frammenti su sequenziatore ABI Prism 310

Southern Blot (digestione DNA genomico con enzimi di restrizione EcoRI/EagI e

ibridizzazine con sonda StB12.3)

smear nel range di normalità, attribuibile ad alleli compresi tra le 3 +/-2 e le 26 +/-2 ripetute CGG.

Campione 3

media interpret. su max 5: 4.67

0 poor

0 non valutati


0 poor

0 non valutati


0 poor

0 non valutati


0 poor

1 non valutato

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Interpretazione - Pettorbi

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Interpretazione - Aberuste

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Interpretazione - Tappenti

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Interpretazione - Ellicine

Interpretazione


Performance insufficiente 2 su

66 interpretaz. (10 interpr. non

valutate)

Performance insufficiente 0 su

59 interpretaz. (1 interpr. non

valutata)

Media punteggio

Interpret.: 3.77 su 4Media punteggio

Interpret.: 4.62 su 5

Lab 6. Prescreening:Metodo: analisi eseguita tramite FRAXA 1 KitFL Experteam.Efficienza diagnostica: il sistema utilizzato non identifica espansioni superiori a 100 triplette CGG, mosaicismi, mutazioni puntiformi/delezioni e non valuta lo stato di metilazione del promotore FMR1Interpretazione risultato

Analisi molecolare eseguita su soggetto con ritardo

mentale. L’analisi ha evidenziato la presenza di un allele

di 29 (+/-1) ripetizioni CGG.

Il risultato consente di escludere che il ritardo mentale

sia associato a sindrome dell’X Fragile.

Mosaici Norm /Full (1 % dei pz con s. X Fragile)

media refertaz. su max 4: 3.52

1 non valutato


0 non valutati


0 non valutati


0 non valutati

0

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Referazione - Pettorbi

0

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Refertazione - Aberuste

0

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Refertazione - Tappenti

0

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Refertazione - Ellicine

Refertazione


12 Non valutate 1 Non valutata

Media punteggio

Refertaz.: 3.16 su 4Media punteggio

Refertaz.: 3.55 su 4

Lab 2. Schema completo:SB (no dati grezzi) / MS-PCR

RISULTATO: l’analisi molecolare, ha evidenziato la presenza di un allele espanso maggiore di 200 ripetizioni CGG.CONCLUSIONI: Il risultato depone per una diagnosi di portatore della mutazione del gene FMR-1 responsabile della Sindrome dell'X Fragile. Si consiglia una consulenza genetica.

mutazione completa : 2 eventi mutazionali:- espansione >200 CGG- metilazione promotore gene FMR1

N.B. >200 CGG ma promotore NON metilato>>> High Functioning males

>200 CGG È necessario riportare lo stato di metilazionedel promotore FMR1 per definire se il genotipo si associa alla s. X Fragile

Dati grezzi di qualità non ottimale 10 (3 laboratori)

sensibilità e specificità analitica

non riportate12 (3 laboratori)

Sensibilità diagnostica

non riportata24 (6 laboratori)

Raccomandazioni sul Referto:

• Occorre esplicitare l’indicazione clinica all’indagine

• Si consiglia inserire i numeri di pagina anche quando il referto è redatto in una pagina (1/1)

• Nell’anonimizzazione del referto per la partecipazione al CEQ, si consiglia di lasciare “le voci” riguardanti l’intestazione per

farne capire la struttura.

• Le categorie alleliche sono: il limite di accuratezza delle triplette varia a seconda della categoria allelica

Normale <45 CGG (±1) <45 CGG

Intermedio 45-54 CGG (±2) 45-54 CGG

Premutazione 55-200 GG (±3) tra 55-80 (±4) tra 81-200 CGG

Mutazione completa >200 CGG

Carenze riscontrate ancora frequentemente

Terminologia

Pettorbi MarioTappenti Giulio

L’indicazione all’estensione dell’analisi ai genitori è inappropriata; il paziente è maschio e la sindrome è legata all'X è sufficiente indicare l’analisi alla madre(0,5)

Ellicine Valerio

“I risultati ottenuti sono compatibili con un maschio selvatico (sano) al locus FMR-1”;

anche il termine Sano è poco appropriato, in questo caso sarebbe opportuno indicare:

"genotipo maschile con un numero di triplette CGG nel range della normalità"

Aberuste Maria

Linguaggio inadeguato:

Non si può parlare di "femmina emizigote", ma di "femmina eterozigote" per la premutazione(0,5)

Note :

� E' Importante indicare invece :

� Sensibilità diagnostica probabilità che un Test genetico sia Positivo in un

soggetto affetto/portatore. (detection rate) (permette di valutare i «falsi negativi»)

Specificità diagnostica del test : probabilità che un Test genetico sia

Negativo in un soggetto normale. (permette di valutare i «falsi positivi»)

Si ritiene, pertanto, non opportuno inserire questa nota nel referto.

� Contaminazione in reazioni PCR : deve essere esclusa inserendo gli opportuni controlli negativi (Bianco)

� Contaminazione Materna in Diagnosi Prenatale : deve essere SEMPRE esclusa con opportuna analisi di microsatelliti.

� Rare varianti genetiche : scelta accurata di coppie di primers può scongiurare l’allele ‘drop out’

� Erronee identificazioni di paternità : argomento da trattare in sede di colloquio per la raccolta del consenso informato

� Scambi di campioni : deve essere escluso assicurando

• tracciabilità del campione mediante per es. Codice a Barre;

• identificazione paziente con ameno 2 elementi (Cognome-Nome e codice laboratorio-ID)

• buona pratica: per es. confermare una mutazione mediante ripetizione dell’analisi a partire dal campione originale (sangue

periferico. ecc )

ACCURATEZZA del SizingDistribuzione del n. CGG riportati su referto

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5 622 25 26 27 28 29

allele normale di Ellicine

allele normale di Aberuste

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5 615 18 19 20 21 230

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1180 81 84 85 86 90 92 93 94 96 97

allele Premutato di Aberuste

Metodi N. di Lab

Southern blot 7

Amplidex TM FMR1 PCR Kit, asuragen (TP PCR) 6

PCR convenzionale (Fu et al 1991) 5

Amplidex TM FMR1 mPCR Kit, asuragen (mPCR) 3

MLPA ME029-B2, MRC Holland 2

FRAXA PCR kit, Experteam 2

Methyl sensitive PCR 1

Long PCR 1

Lab 4

Long

PCR

Agaroso

Lab 3

TP-PCR

Lab 4

Long

PCR

Agaroso

Lab 9

PCR

convenz.

ABI 3730

Lab 9

PCR

convenz.

ABI 3730

Southern blotLong PCR

Elettroforesi Agarosio

bp 289,68 – 230= bp 59,68:3= 19,89 >> 20 CGG

bp 289,68 – 221= bp 68,68:3= 22,89 >> 23 CGG

TP-PCR

Usare Macro introducendo

Fattore di correzione

e Fattore Mobilità (settato su strumento)

CGG bp

18 283,35

30 318,66

32 324,45

56 395,25

85 478,81

116 569,33

X Y

y=m0X + C0

m0= fattore di mobilità

C0 = fattore di correzione

m0 e C0 vanno inseriti nella macro

y = 2,916007x + 231,192614R² = 0,999987

0

100

200

300

400

500

600

0 50 100 150

bp

CGG Repeats

Obbiettivo >> Accuratezza e Standardizzazione del sizing CGG

RINGRAZIAMENTI

Anna Ravani - Laboratorio di Genetica Molecolare, U.O. Genetica Medica,

AO Universitaria Ferrara

Silvia Russo - Laboratorio Genetica

Istituto Auxologico Italiano - Cusano Milanino, Milano

Federica Censi

Fabrizio Tosto

Giovanna Floridia

Domenica Taruscio


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