Centro di Procreazione Medicalmente Assistita

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Diagnostica e Terapia in LaboratorioDiagnostica e Terapia in Laboratorio

Dr. Giovanni Dr. Giovanni BracchittaBracchitta

Ruolo del laboratorio di Fisiopatologia Ruolo del laboratorio di Fisiopatologia della Riproduzione nella diagnosi e terapia della Riproduzione nella diagnosi e terapia

delldell’’ infertilitinfertilit àà di coppiadi coppia

Diagnostica SpecialisticaDiagnostica Specialistica

P.M.A. di I livello (slow P.M.A. di I livello (slow techtech))

I.V.F. I.V.F. II e III livello (High II e III livello (High TechTech))

DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica

L’esame seminale non è un’analisi con una lista di variabili, ma un

insieme di variabili che vanno lette in maniera assolutamente integrata.

esame chimico – fisico

concentrazione nemaspermica

motilità nemaspermica

vitalità nemaspermica

morfologia nemaspermica

longevità nemaspermica

SpermiogrammaSpermiogrammadi I livellodi I livello

Liquido seminaleLiquido seminale (fluido biologico)

Frazione corpuscolatacomponente nemaspermica

componente non nemaspermica


Frazione liquida:

plasma seminale

Plasma seminalePlasma seminale

Secreto prostatico:15% - 30% dell’eiaculato, biancastro, pH acido

Ac. citrico, Zn, γ glutamiltranspeptidasi, fosfatasi acida.


Secreto vescicolare:50 - 80% dell’eiaculato, giallastro, pH basico, vischioso

Fruttosio, prostaglandine

Secreto epididimario:Funzione di trasporto

L - Carnitina, glicerosforil colina, alfa glucosidasi neutra

ValutazioniValutazioni


Macroscopiche:caratteristiche reologiche dell’eiaculato.

Microscopiche:caratteristiche degli spermatozoi,

caratteristiche delle cellule germinali immature

caratteristiche delle cellule non nemaspermiche

CaratteristicheCaratteristiche reologichereologicheAspetto: - normale (grigio opalescente)

- acquoso (trasparente)

- ematico (rossastro)

- lattescente(biancastro)

- pioide (giallastro – pazienti con ittero – assunzione di vitamine)

Coagulazione:fisiologica, avviene ad opera di enzimi provenienti

dalle vescicole seminali ((vesciculasivesciculasi).).

Liquefazione:- regolare: se completa dopo 10’ - 60’, ad opera di enzimi prostatici.

- irregolare: se presenta zone di mancata fluidificazione.

Viscosità:- normale: il liquido si stacca goccia dopo goccia.

- aumentata:si crea continuità tra le gocce > 2 cm = filanza.

- diminuita: il liquido appare diluito, correla con l’aspetto acquoso.


pH: normale >7.27.2< 7 = si associa a patologia ostruttiva o a ipotrofie

congenite o acquisite delle vescicole seminali.

> 8 = si associa a flogosi.


Volume: normale >2 ml2 ml

Valutazione componente cellulareValutazione componente cellularenemaspermicanemaspermica

Concentrazione: normale> 20 milioni/ml> 20 milioni/mlNumero totale: normale> 40 milioni> 40 milioniMotilità: sommatoria di un movimento oscillatorio lungo l’asse ideale che passa

per il centro della testa e uno rotatorio attorno a questo asse.

A = rapida progressiva ( > 40 µm/sec )

B = lenta progressiva

C = discinetica

D = immobili

Normale:Normale: A + B > 50%> 50%A > 25%> 25%


Morfologia: il maschio umano, insieme a qualche primato è l’unico

tra i mammiferi ad avere un grado così elevato di

eterogeneità e pleiomorfismo dei suoi gameti.

Normalità: > 30%> 30% di forme normali


Anomalie della testa: AcefaliaAcefaliaMacrocefaliaMacrocefaliaMicrocefaliaMicrocefaliaAmorfaAmorfaA puntaA punta


Anomalie della testa: PiriformePiriformeVacuolataVacuolataA pallaA pallaDoppia Doppia NucleoNucleodecondensato decondensato AcrosomaAcrosomaridottoridotto


Anomalie del collo: AngolatoAngolatoSpessoSpessoInserzione asimmetricaInserzione asimmetricaResiduoResiduocitoplasmaticocitoplasmatico


Anomalie della coda: AngolataAngolataMozza Mozza Rigonfia Rigonfia DoppiaDoppiaAssenteAssenteArrotolataArrotolata


Cellule germinali immature: Spermatogoni (rari)Spermatociti ISpermatociti II (rari)Spermatidi

Normali: < 10% popolazione< 10% popolazionenemaspermicanemaspermica


Componente non nemaspermica:

Leucociti < 1 milione/mlLeucociti < 1 milione/mlEmazieEmazieCellule epitelialiCellule epitelialiElementoElementotetranucleatotetranucleato (linea germinale)(linea germinale)


VitalitVitalit àà: > 50% vivi: > 50% vivi

Agglutinazioni non specifiche ed aggregatiAgglutinazioni non specifiche ed aggregati


Valori normali ? Riferimento

Unità WHO 1987

WHO 1999

WHO 2001

Volume ml ≥≥≥≥ 2.0 ≥≥≥≥ 2.0 ≥≥≥≥ 2.0

pH 1-14 7.2 – 8 7.2 – 8 >>>> 7.2

Concentrazione mil/ml ≥≥≥≥ 20 ≥≥≥≥ 20 ≥≥≥≥ 20

Spz Totali mil/eiac ≥≥≥≥ 40 ≥≥≥≥ 40 ≥≥≥≥ 40

Motilità % classe a ≥≥≥≥ 25 ≥≥≥≥ 25 ≥≥≥≥ 25

Motilità % classe a+b ≥≥≥≥ 50 ≥≥≥≥ 50 ≥≥≥≥ 50

Morfologia % normali ≥≥≥≥ 50 ≥≥≥≥ 30 (?) (?) ≥≥≥≥≥≥≥≥ 1515

Vitalità % dei vivi ≥≥≥≥ 75 ≥≥≥≥ 50 ≥≥≥≥ 50

Leucociti mil/ml <<<< 1.0 <<<< 1.0 <<<< 1.0

Immunobead % spz - sfere <<<< 10 <<<< 50 <<<< 50

Mar test % spz - emz <<<< 10 <<<< 50 <<<< 50

WHO 1992

≥≥≥≥ 2.0

7.2 – 8

≥≥≥≥ 20

≥≥≥≥ 40

<<<< 1.0

≥≥≥≥ 75

≥≥≥≥ 30

≥≥≥≥ 50

≥≥≥≥ 0.0

<<<< 10

≥≥≥≥ 25

Anamnesi: Professione: Astinenza:Volume: pH: Fluidificazione:Viscosità: Filanza: Odore:Agglomerati: Agglutinazioni: Cellule epiteliali: Batteri: Tricomonas: Eritrociti:

Valutazione post liquefazione a 60Valutazione post liquefazione a 60’’

Numero di spermatozoi totali:Numero di spermatozoi totali per eiaculato:Numero spermatozoi mobili progressivi:Numero spermatozoi mobili progressivi per eiaculato:Cellule germinali immature:Leucociti:

Valutazione motilitValutazione motilitàà a 35a 35°°CC% Spermatozoi Immobili Mobili totali Mobili progressiviMotilità tipo: D A +B + C A + B1^ ora2^ ora4^ oraVitalità: eosina test - swelling testMorfologia: % normali %anormali - Anomalie testa % - collo % - coda %

Conclusioni:Conclusioni:

Terminologia delle principali alterazioni seminaliTerminologia delle principali alterazioni seminali

Normozoospermia:Normozoospermia: eiaculato normale

Oligozoospermia: concentr. Spz inferiore ai parametri di rif.

Astenozoospermia: motilità inferiore ai valori di riferimento

Teratozoospermia: morfologia inferiore ai valori di riferimento

Oligoastenoterato… alterazione di tutte le tre variabili

Azoospermia: assenza di spermatozoi nell’eiaculato

Aspermia: assenza di eiaculato


ImmunologiaImmunologia

Gli spz. sono altamente antigenici e normalmente isolati tramite la

barriera ematotesticolare. L’interruzione di questa barriera anatomica

e funzionale nei tubuli seminiferi può portare alla formazione di

anticorpi.

• Mar test (IgG)• Spermar test screening ( IgG )• IBT diretto ( IgA – IgG)


Biochimica del plasma seminale Biochimica del plasma seminale ( presenza, assenza, disfunzione e infezione delle ghiandole accessorie)

Markers prostaticiFosfatasi acidaAcido citricoZinco

Markers epididimarialfa glucosidasi neutracarnitina

Markers vescicolariFruttosio


NormaleAssente o

Ridotto

NormalePresentiGiallastroAlcalinoRidotto

Ostruzione dei dotti prostatici

(rara)

Normale (testa)

Ridotti (coda)NormaleNormaleAssenteTrasparenteNormaleNormale

Ostruzione bilaterale

epididimaria

RidottiAumentati

Ridotti o

AssentiAssentiLattescenteAcidoRidotto

Ostruzione o agenesia

bilaterale dei dotti

eiaculatori

Ridotti

(di origine prostatica)

NormaleNormaleAssentiTrasparenteNormaleNormale

Ostruzione bilaterale dei dotti deferenti

NormaleNormaleNormaleAssentiTrasparenteNormaleNormale

Azoospermia secretoria

Marker Epididimari

(Carnitina)

Marker

Prostatici

(Acido Citrico)

Marker

Vescicolare

(Fruttosio)

SpzAspettopHVolume


Interazione muco Interazione muco -- semeseme

Studio del muco cervicale

Quantità, viscosità, cellularità, filanza, cristallizzazione, ph

indicazioni circa la capacità di favorire la penetrazione degli spz

Post coital test (test di Sims-Huhnner) (in vivo)

- n° di spz attivi nel muco, motilità, sopravvivenza

Slide test (test di Kurzrok e Miller) (in vitro)


Studio di funzione Studio di funzione nemaspermicanemaspermica

Test di decondensazione cromatinica

Test di condensazione nucleare (blu di anilina)

Test di eterogeneita cromatinica (arancio di acridina)

Test di capacitazione e R.A.

Studio dell’integrità di membrana LPO-p

Status metabolico (dosaggio dell’ATP)

correlano con la fertilizzazione

SpermiogrammiSpermiogrammi I Livello I Livello Pazienti esaminati: nPazienti esaminati: n°° 380380

2000 - 2002

Normali21%

Anormali79%

NormalitNormalit àà inin SeminologiaSeminologia

-- 2DS N 2DS N +2DS+2DS

50%50%

100%100%

I I parametri WHO sono stati ottenuti mediante ampia rilevazione epiparametri WHO sono stati ottenuti mediante ampia rilevazione epidemiologica, essi demiologica, essi indicano, non una normalitindicano, non una normalitàà, ma il limite inferiore probabilistico, al di sopra del quale u, ma il limite inferiore probabilistico, al di sopra del quale un n individuo cade nella popolazione dei fertili.individuo cade nella popolazione dei fertili.

Le caratteristiche seminali, definibili come normali in sensoLe caratteristiche seminali, definibili come normali in sensogaussianogaussiano, si discostano di , si discostano di molto dal minimo necessario per fecondaremolto dal minimo necessario per fecondare..

EtEtàà pazientipazienti

2000-2002

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

22 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 50 54 60

Età

%

EtEtàà pazientipazienti

2000-2002

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

22 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 50 54 60

Età

%

50%

Spermiogrammi I Livello range età 32-38

24%

76%

Normali Anormali

Pazienti che non hanno eseguito mai un esame seminale Pazienti che non hanno eseguito mai un esame seminale range range 32 32 –– 38 anni38 anni

33%

67%

Si No

Si deduce:Si deduce:

Alta incidenza del fattore maschile

Innalzamento dell’età in cui si decide di volere il primo figlio

Ritardo nell’acquisizione di informazioni circa la propria condizione di

capacità riproduttiva

Si Si concludeconclude::

Un corretto iter diagnostico riduce alle coppie i tempi di attesa per una risposta concreta

Metodiche slow Metodiche slow techtech

Inseminazione Inseminazione intrauterina intrauterina (IUI)(IUI)(selezione nemaspermica e pre-capacitazione)

Valutazione Basale del seme:Almeno 10 milioni Spz totali

50% dotati di motilità rapida progressiva

30% dotati di morfologia normale

Valutazione Post-Trattamento

Volume: 0,1 – 0,5 ml

2-5 milioni di Spz con motilità rapida progressiva.

Metodiche High Metodiche High TechTech

I.V.F. classicaI.V.F. classicaRiproduce in vitro le condizioni fisiologiche della fecondazionee dello sviluppo embrionale

Parametri Seminali Minimi richiesti per I.V.F. (dopo trattamento)

• > 1,5 milioni di spermatozoi mobili

• > 30 % normoconformati

I.C.S.I.I.C.S.I. (intra cytoplasmatic sperm injection)


Questa tecnica permette di iniettare un solo spz all’interno dell’ovocita.

% di fertilizzazione ovocitaria 50 – 70%

Il rischio di danneggiare irrimediabilmente l’ovocità è del 5%

INDICAZIONI ALLE DIFFERENTI TECNICHE DI PMAIN FUNZIONE DELLA QUALITA’ SEMINALE

NORMOZOOSPERMIA

MODERATA DISPERMIA

SEVERA OAT < 500.000

ASSENZA FERTIL. FIVETAZOOSPERMIE VARIEACINESIASTERILITA’ IMMUN.SPZ CRIOCONSERVATIANOMAL. ULTRASTRUTTURALI

IUI

GIFT

IVF

ICSI

Valutazione Trattamento

Inseminazione (FIVET – ICSI)

Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 0Day 0

Recupero ovocitario

Preincubazione

Produzione seme

Preincubazione

InseminationInsemination mediummedium

No GlucosioNo GlucosioFosfatiFosfatiAA non essenzialiAA non essenzialiGlutamminaGlutammina


Osservazione avvenuta fecondazione 16-18 ore dall’inseminazione

CrioconservazioneCrioconservazione Sviluppo embrionaleSviluppo embrionale

Transfer Transfer


EMBRIONE A 4 CELLULE


Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 5Day 5--66

EMBRIONE A 8 CELLULE

BLASTOCISTI

Cleavage Cleavage mediummedium

GlucosioGlucosioAA essenzialiAA essenzialiAA non essenzialiAA non essenzialiPiruvato Piruvato vitaminevitamineEDTAEDTA

Microchirurgia embrionaleMicrochirurgia embrionale

Biopsia per diagnosi preimpianto


Pitting


Microchirurgia embrionaleMicrochirurgia embrionale


Assisted HatchingAssisted Hatching

Eccessivo spessore della zona pellucida (> 15 micron)

Mancato impianto a seguito di transfer ripetuti

Alto grado di frammentazione degli embrioniLento timing di segmentazione

Età della paziente > 38 anni

Transfer da scongelamento


M.E.S.A.M.E.S.A. (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration)

Azoospermia ostruttiva

Te.S.E.Te.S.E.(Testicolar Sperm Extration)

Ridotta produzione di spz da parte del testicolo

Te.S.A.Te.S.A. (Testicolar Sperm Aspiration)

CrioconservazioneCrioconservazione

Nostra casisticaNostra casistica

%%NN°°Anno 2002Anno 2002

212144Gravidanze on Gravidanze on -- goinggoing

262655Gravidanze clinicheGravidanze cliniche

1001001919Cicli PMA completatiCicli PMA completati

Nostra casisticaNostra casistica

DayDay + 3+ 3

DayDay +1+1

Day Day 00

TimingTiming %%NN°°Anno 2002Anno 2002

93938181Embryo Embryo (6(6--8 8 cellcell))

72,572,58787Zigoti 2 Zigoti 2 pnpn

100100120120Ovociti Ovociti prelevatiprelevati

Grazie per lGrazie per l’’ attenzioneattenzione

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