MICROBIOLOGIA DI PROCESSOè quella parte della microbiologia applicata dipendente dall’impiego di

microrganismi (o di cellule animali o vegetali) come mezzo di produzione di biomasse o metaboliti in condizioni controllate

L’equazione semplificata di un processo è così rappresentabile:

cellule metaboliti primari metaboliti secondari prodotti complessi

prodotti di biotrasformazione

PRODOTTO

SUBSTRATO

Recupero

Fermentazione

CELLULE O LORO COMPONENTI

Ingegneria di processo

+

Si definisce FERMENTAZIONE quel tipo di metabolismo con il quale un m.o.ricava energia da un substrato in assenza di ossigeno

In pratica vengono definite con FERMENTAZIONE INDUSTRIALE tutti i processi di produzione basati sulle attività metaboliche dei m.o. sia in aerobiosi

che in anaerobiosi.

Le FERMENTAZIONI TRADIZIONALI, sono quelle condotte in enologia per la produzione di bevande alcoliche, nella produzione di derivati del latte (es.

yogurt) o nella produzione tradizionale di lievito per panificazione.In queste fermentazioni gli zuccheri contenuti nella materia prima vengono

trasformati in diversi prodotti, etanolo, a. lattico, cellule di lievito.

Le PRODUZIONI MODERNE sono disegnate e condotte per garantire accumuli di cellule o di prodotti del metabolismo di degradazione (es. etanolo, metano), o del metabolismo di biosintesi (es. antibiotici) da materie prime a basso costo e

con alte rese

FERMENTAZIONI

Il metabolismo si divide in catabolismo ed anabolismo.

I microrganismi possono essere distinti e classificati sulla base del loro catabolismo e delle esigenze nutrizionali.

•Fonte di energia

•Donatore di H

•Accettore di e-

Le molecole entrano nelle cellule attraverso trasporto attivo mediato da ATPasi associate alle membrane, o attraverso trasporto passivo con un sistema di traslocazione che coinvolge zuccheri fosforilati

IL METABOLISMO MICROBICO

Radiazione

Ossidazione

Fototrofi

Chemotrofi

Prod. inorg. ridotti

Molec. org. ridotte

NH4+; NO2-; S2-; S; S2O3

2-

Zuccheri; lipidi; proteine

O2;

Mol.org.ox; NO3-; SO42-; CO2

Aerobi

Anaerobi

Lo schema generale del catabolismo è diviso in tre stadi:

STADIO 1Degradazione delle molecole complesse in monomeri più piccoli. Non viene rilasciata energia.

STADIO 2Ulteriore degradazione dei monomeri con rilascio di parte dell’energia sottoforma di ATP, potere riducente (es. NADH+) e importanti intermedi metabolici (es. piruvato):

STADIO 3Completamento della degradazione dei substrati e raccolta della maggior quantità di energia (ATP; potere riducente) con il ciclo di Krebs accoppiato alla catena di trasporto degli elettroni (respirazioni aerobiche e anaerobiche) od alle fermentazioni.

IL METABOLISMO CATABOLICO

Se si sottraggono

intermedi dal ciclo (ad

es. per le biosintesi

metaboliche, o per la

produzione industriale)

reazioni anaplerotiche

(di riempimento)

intervengono per

ripristinare l’equilibrio

ricostituendo i precursori

del ciclo

IL CATABOLISMO OSSIDATIVO

Reazioni anaplerotiche

IL CATABOLISMO FERMENTATIVOGlucosio

dalle vie degradativeprincipali si originano

tutti i pathwaysanabolici: per

aminoacidi alifatici e aromatici, lipidi,

nucleotidi purinici e pirimidinici, ecc.

IL METABOLISMO ANABOLICO

LA METANOGENESI

POLIMERI

MONOMERI

ALCOLI SUCCINATOLATTATO

ACIDI GRASSI C2 C3

COMP. C1H2

ACETATO

CH4 CO2

1

1

2

3

4 5

Aci

doge

nesi

Ace

toge

nesi

Met

anaz

ione

1. Batteri fermentanti acidogeni primari

2. Batteri fermentanti secondari (sintrofici)

3. Batteri omoacetogeni4. Metanogeni idrogenotrofi5. Metanogeni acetoclasti

GLI ARCHAEA METANOGENI

ORDINE: METHANOBACTERIALESFamiglia: Methanobacteriaceae

Genere:MethanobacteriumGenere: Methanobrevibacter H2/CO2Genere: Methanosphaera formiato

Famiglia: MethanothermaceaeGenere: Methanothermus

ORDINE: METHANOCOCCALESFamiglia: Methanococcaceae

Genere: Methanococcus H2/CO2

ORDINE: METHANOMICROBIALESFamiglia: Methanomicrobiaceae

Genere: MethanomicrobiumGenere: Methanogenium H2/CO2Genere: MethanoculleusGenere: Methanospirillum

Famiglia: MethanocorpusculaceaeGenere: Methanocorpusculum H2/CO2

Famiglia: MethanoplanaceaeGenere: Methanoplanus H2/CO2

Famiglia: MethanosarcinaceaeGenere: Methanosarcina acetato H2/CO2Genere: MethanococcoidesGenere: Methanolobus methanoloGenere: MethanohalophilusGenere: Methanosaeta/Methanotrix acetato

LE REAZIONI DI METANAZIONE

4H2 + HCO3- + H+ CH4 + 3H2O

4HCOO- + H+ + H2O CH4 + 3 HCO3-

CH3COO- + H2O CH4 + HCO3-

ACETATO: AFFINITA’ E Vmax

Ks Vmax

(mM) (h-1)

Methanosarcina 5 0.032

Methanosaeta 0.7 0.002-0.003

GEN

OM

I SEQU

ENZIA

TI

METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA E’ un processo metabolico molto meno esoergonico della respirazione

aerobica o delle respirazioni anaerobiche La conversione di un esoso a CH4 rilascia solo il 15% dell’energia ottenibile

dalla degradazione aerobica

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O (ΔG°’ = -2870 kJ/mole)

C6H12O6 3CO2 + 3CH4 (ΔG°’ = -390 kJ/mole)

La bassa resa energetica della metanogenesi costringe i microrganismi coinvolti a cooperare molto efficientemente ed a stabilire relazione di

“SINTROFIA”la cooperazione tra 2 organismi che dipendono l’uno dall’altro. La mutua

dipendenza non può essere sostituita dall’aggiunta di nutrienti. Ad es. la co-coltura di Methanobacillus omelianskii degrada l’etanolo a:

Strain S2CH3CH2OH + 2H2O 2CH3COO- + 2H+ + 4H2 (ΔG°’ = +19 kJ per 2 mol of ethanol)Strain M.o.H.4H2 + CO2 CH4 + 2H2O (ΔG°’ = -131 kJ per mol of methane)

Co-Culture2CH3CH2OH + CO2 2CH3COO- + 2H+ + CH4 (ΔG°’ = -112 kJ per mol of methane)

METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA Un processo che favorisce la sintrofia è il

TRASFERIMENTO INTERSPECIE DI H2, HCOO- E CH3COO-

in cui un efficiente “scavenger” per questi substrati (es. metanogeni o solfatoriduttori) ne mantiene una bassa concentrazione, favorendone la

produzione da parte degli acetogeni sintrofici

METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA

Oltre al classico network metabolico con 3 livelli trofici (acidogenesi, acetogenesi, metanazione) è stato identificato un network metabolico a 2 livelli (acetogenesi e metanazione), in cui un gruppo batterico, le spirochete, produce direttamente acetato, H2 e CO2 da glucosio insieme a quantità variabili di lattato ed etanolo.

In presenza di efficienti “scavenger” per l’H2 come i metanogeni la maggior parte del flusso elettronico del metabolismo delle spirochete va nella direzione di acetato, H2 e CO2 a spese di lattato ed etanolo. In questa situazione metabolica gli acetogeni sintroficihanno un ruolo insignificante ed il processo di metanogenesi viene completato in due livelli trofici.

METANOGENESI: PATHWAYS ALTERNATIVI

MONOMERI (glucosio)

COMP. C1H2

ACETATO

CH4 CO2

1

2

1 Spirochete; 2 Metanogeni H-trofi; 3 Metanogeni acetoclasti

Met

anaz

ione

Ace

toge

nesi

3

COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALEQuale è la stabilità dei processi metabolici metanogenici esposti a stress?La risposta di reattori con i 2 tipi di pathway metanogenici (a 2 o 3 livelli) a shock da sovraccarico di substrato indica che la miglior reazione metabolica si ha dove il flusso elettronico di degradazione del substrato a CH4 avviene per vie metaboliche parallele piuttosto che sequenziali.

FLUSSI METABOLICI PARALLELINel caso di reattori ad alto contenuto di spirochete la formazione dei substrati di metanazione(acetato ed H2) da glucosio avviene attraverso 2 vie indipendenti, quella diretta catalizzata dalle spirochete a quella con l’intervento di acetogeni sintrofici

FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALINel pathway metanogenico a tre livelli la produzione di acetato e H2 avviene attraverso step metabolici sequenziali catalizzati da diversi gruppi trofici.

COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALEPer verificare la risposta a stress di sovraccarico organico di comunità microbiche metanogeniche che si differenziano per flussi metabolici paralleli piuttosto che sequenziali, sono stati comparati due tipi di reattori derivanti dal medesimo inoculo e condotti nelle medesime condizioni operative, ma selezionati sulla base di differenze per il tempo medio di residenza cellulare (17,5 contro 5,8 giorni) .

FLUSSI METABOLICI PARALLELIFLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI

COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE

L’analisi d’immaginecomputerizzata dei morfotipi microbici e l’analisi ARDRA dei cloni in librerie di 16Sottenute dai due set di reattori indicavano una distinta composi-zione in m.o.:REATTORI HS (high-spirochete) dominati da spirocheTe, bastoncini corti e Methanosarcina.REATTORI LS (lowspirochete) dominati

da cocchi e Methanosaeta. Il sovraccarico di substrato (glucosio) determinava una maggior variazione delle popolazioni nelle comunità HS che ritornavano alla composizione iniziale dopo 24 giorni dall’inizio della perturbazione. Mentre le popolazioni nel reattore LS rimanevano relativamente stabili.

COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE

Dal punto di vista metabolico, la co-munità LS reagiva più prontamente: ripristinando in un tempo più breve gli equilibri iniziali di concentrazione dei metaboliti del processo di metanogenesi.

Le caratteristiche del processo HS erano:

i) Più lenta utilizzazione del substrato glucosio.

ii) Mantenimento di un livello più basso dei metaboliti intermedi.

iii) Inizio simultaneo dei diversi processi fermentativi (produzione dei diversi acidi).

METANOGENESI: DIVERSITA’ MICROBICA E STABILITA’ FUNZIONALE

Comunità microbiche con i principali flussi metabolici paralleli sono funzionalmente più stabili in risposta a

perturbazioni esterne come shock da sovraccarico organico rispetto a comunità con flussi metabolici seriali.

Comunità microbiche più complesse (con maggiore biodiversità) possono rispondere meno prontamente agli

stress di comunità microbiche più semplici ma organizzate in maniera funzionalmente diversa.

Per un’efficiente risposta agli stress alla biodiversità genetica e fenotipica deve accompagnarsi una biodiversità

funzionale.

METANOGENESI: I REATTORI

Per la digestione anaerobica dei

reflui si distinguono diversi tipi di reattori che si differenziano

per:

•Schema idraulico dei sistemi

•Forma della biomassa (libera,

adesa)

METANOGENESI: I REATTORI PER REFLUI

Reattori a letto fisso espanso fluidizzato

Le cellule sono immobilizzate in un biofilm adeso ad un supporto inerte

(plastica, legno,ecc.)

•Reattori a biomassa libera•Reattori a biomassa adesa

Migliore contatto tra le cellule e migliore sintrofia(es. la rimozione dell’H2 prodotto dagli acetogeni sintrofici, Sintrophomonas e Sintrophobacter, da parte dei metanogeni idrogenotrofi che agiscono da “scavenger” dell’H2 tossico per gli acetogeni)Stabilità della biomassa nel reattore(basso “washout” cellulare)

Reattori UASB (upflow anaerobic sludge bed)

La biomassa è organizzata in biofilm autoimmobilizzato in granuli compatti (diam. 0.1-1 cm) ad alta sedimentabilità

Strati di microrganismi

Materiale di supporto

METANOGENESI: I REATTORI UASB

Influente

Effluente

Biogas

MESOFILI TERMOFILI

Ric

ircol

o

METANOGENESI: I REATTORI UASB

Nei reattori UASB (Upflow anaerobicsludge Blanket) si sviluppano granuli con biomassa strati-ficata in cui sono particolarmente effi-cienti gli scambi tro-fici tra i diversi m.o. (es. metanogeni e acetogeni sintrofici).L’ibridazione in situ con sonde specifiche per Archaea (rosse) e per Bacteria (verdi) mostra che gli strati superficiali sono prevalentemente colonizzati da batteri, mentre gli strati profondi dei granuli sono colonizzati da archaea, sia in granuli mesofiliche termofili. La parte centrale dei granuli non da segnale di ibridazione e sembra costituita da residui cellulari e materiale inorganico.

META

NO

GEN

ESI: I REA

TTOR

I UA

SBM.saeta (rosso) Eubacteria

(verde)M.saeta (rosso) Eubacteria

(verde)

M.bacteriaceae (rosso) Eubacteria (verde)M.bacteriaceae (rosso) Eubacteria (verde)

M.microbiaceae (rosso) Eubacteria (verde) M.sarcinaceae (rosso) Eubacteria (verde)

ME

SOFI

LI

TE

RM

OFIL

I

META

NO

GEN

ESI: I REA

TTOR

I UA

SB

ARC915: sonda universale per Archaea ( fluorescina)

SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina)

ARC915 SYN-7 ARC915+SYN-7

ARC915: sonda universale per Archaea (fluorescina)EU338: sonda universale per Bacteria (rodamina) MX825: sonda spec. per Methanosaeta sp. (rodamina)

MG1200: sonda spec. per M.microbiaceae (fluorescina) SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina)

ARC915+EU338+MX825 MG1200+SYN-7

Sekiguki et al. 2001 Appl. Environ. Microbiol., 67:5740-5749

INTERAZIONE METANOGENI-SOLFATORIDUTTORI IN UASBL’interazione spaziale tra solfatoriduttori e metanogeni, 2 gruppi microbici che competono per i donatori di elettroni diretti (acetato e H2) ed indiretti (es. lattato, etanolo, ecc.) è stata studiata attraverso impiego di microsensori per CH4 e H2S, per misurare negli strati di granuli UASB metanogenici e sulfidogenici-metanogenici, la concentrazione dei 2 gas e l’attività metanogenica e sulfidogenica.

Le analisi di attività e di microprofili dei gas indicano che i solfatoriduttori si posizionano negli strati più esterni del biofilm, mentre gli archaeametanogenicolonizzano il centrodel granulo. Questi risultati venivano confermati da esperimenti di ibridazione “in situ”.

Granuli metanogenici-sulfidogenici Granuli metanogenici

STABILITA’ DELLA BIOMASSA

Influente

Effluente

Biogas

WashoutWashout

FAVORIRE:Bassa idrofobicità superficiale biofilm

Batteri a superficie idrofilica sulla superficie del biofilm

1 cm

WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALELa stabilità dei granuli è determinata dall’interazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale all’interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i ΔG di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali:

Ad alti carichi organici ed alte produzioni di biogas la biomassa granulare inizia a flottare ed è trasportata fuori dal reattore con il fenomeno del wash-out della biomassa

WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALELa maggior parte degli acidogeni sono IDROFILICI, mentre la maggior parte dei metanogeni e degli acetogeni sono IDROFOBICI

WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALELa stabilità dei granuli è determinata dall’interazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale all’interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i ΔG di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali:

C’è quindi una finestra ottimale di tensione superficiale del liquido che aumenta l’esposizione di batteri idrofilici sulla superficie dei granuli e abbassa i valori di ΔG di adesione per i microganismi idrofilici

La configurazione 1 risponde anche al flusso trofico che deve essere stabilito tra l’esterno e l’interno del granulo. All’esterno del granulo è abbondante il glucosio e gli zuccheri substrati del primo gruppo trofico della metanogenesi, gli ACIDOGENI che sono idrofilici

WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALELa configurazione dei granuli UASB in relazione alla tensione superficiale del reflo e in accordo a considerazioni termodinamiche può essere così schematizzata:

Olive Olive MillMill WastewaterWastewater

Southern Europe Countries world major producers of olive oiland hence major producers of OMW

OMW characteristsicsVery high COD (up to 200 g l-1)High content of polyphenols (up to 6 g l-1)Relatively low pH (4-5)

OMW anaerobic digestionCH4 productionSpontaneous separation of CH4Low sludge production

[Bertin et al. 2004 FEMS Microbiol. Ecol. 48:413-423]

Polyphenols can strongly decrease the process efficiency being toxic for methanogenic Archaea, a key component of the reactor microflora

[Field & Lettinga 1987 Water Res. 21:367-371]

How methanogen community respond to increasing OMW organic loads?

OMW Effluent

Biogas

Gas Counter

GC

OMW Influent

Fixed bed filter

Contact reactor

AnaerobicAnaerobic DigesterDigester forfor OMW TreatmentOMW Treatment

Anaerobic digester (11 L)Up-flow fixed bed digester (7.5 L)Contact reactor (3.5 L)Packing with wood chipsHRT = 48 hTemperature = 37 °CVol. Org. Load = 1-15 g COD l-1d-1

OMW-InfluentDiluted OMWInfluent pH = 6.1-6.4N correction with NH4ClInfluent COD = 5.9-31 g l-1

ProcessProcess PerformancesPerformancesTABLE 1. Process parameters of OMW anaerobic digestion at different VOL. For each process phase average values SD of the parameters were calculated for a number of samples n reported in brackets. Parameter VOL (g COD l-1

react d-1) 2.7±0.47 (28) 5.7±0.5 (13) 6.6±0.9 (10) 10.1±2.4 (11) 15.2±3.7 (8) Treatment time (d) 70 28 22 18 34 HRT (d) 2.2±0.3 (61) 2±0.1 (26) 2±0.1 (20) 2.2±0.3 (18) 2±0.1 (23) Influent pH 6.17±0.12 (50) 6.38±0.09 (23) 6.4±0.07 (19) 6.42±0.14 (16) 6.4±0.1 (23) Effluent pH 7.77±0.21 (43) 7.82±0.3 (17) 7.8±0.28 (18) 7.98±0.35 (14) 7.76±0.26 (24) Infl. COD (g l-1) 5.9±0.8 (30) 11.9±0.8 (13) 13.2±1.3 (10) 21.8±2.7 (11) 31.3±7.8 (8) Effl. Sol. COD(g l-1) 0.96±0.3 (23) 1.4±0.4 (11) 1.4±0.4 (7) 1.61±0.48 (8) 2.92±48 (6) Sol COD removal (%) 84.1±5.1 (23) 88.5±3.6 (11) 88.7±3.9 (7) 92.4±1.6 (8) 89.2±1.9 (6) Spec. CH4 prod. (l g-1CODrem) 0.33±0.08 (22) 0.26±0.06 (11) 0.27±0.04 (7) 0.23±0.06 (8) 0.16±0.04 (6) CH4 in the biogas (%) 74.2±2.5 (29) 71.9±1.6 (15) 71.6±1.4 (11) 69.6±1.8 (13) 69.5±3.4 (17)

0

20

40

60

80

100

120

1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 97 105 113 121 129 137 145 153 161 169

0

5

10

15

20

25

COD removal

VO

L (g

CO

D l-

1 d-1

) C

H4

(l/10

g C

OD

rem

)

VOLCH4

CO

D R

emov

al(%

)

Time (d)

ProcessProcess PerformancesPerformances

- VFA: below 800 mg l-1- Acetic acid (C2): 70-

80% of VFA

Low VFA and C2 indicate efficient acetogenic and

methanogenic phases0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

1 7 13 19 25 31 37 43 49 55 61 67 73 79 85 91 97 103

109

115

121

127

133

139

145

151

157

163

169

175

g

0

5

10

15

20

25

VFA

C2VOL

Time (d)

VO

L (g

CO

D l-

1 d-1

)

VFA

and

C2

(mg

l-1)

- At VOL 10 g COD l-1d-1 the effluent COD is 1.6 g l-1- Since 1g C2 gives 1g COD, more than 50% of effluent COD was due to VFA- Hence low residual polyphenols

A decrease of specific CH4 production at VOL of 10 g COD l-1d-1!!

acetone (50 ml) sample (25 ml) discarded centrifugation flocculated solids concentration under N2 stream acetone eliminated n-hexane (50ml) water solution discarded (extraction repeated lipid fraction 4 times) freeze drying H2O (1ml) CH3CN (10 ml) n-hexane (20 ml) (extraction repeated 6 times) sonication n-hexane discarded lipid fraction polyphenolic extract in CH3CN concentration under N2 flux, 30 °C CH3CN eliminated MeOH (3ml) methanolic polyphenolic extract

Fig. 1. Scheme of the procedure used for the extraction of polyphenols from olive mill waste waters andfrom the plant effluents.

The average recovery of polyphenols on the basis of addition of known

concentrations of gallic acid was 59%.

The average percent removal of polyphenols in the ractor was 89.5%

[100% for 2-(p-hydroxy)phenilethanol].

Removal of 2-(p-hydroxy)phenilethanol was calculated on the basis of the

response factor of the corresponding standard while the content of the remain

polyphenols was calculated using the responce factor of caffeic acid.

MethanogenicMethanogenic ArchaealArchaeal CommunityCommunity

No apparent changes in the methanogenassemblage in the

effluent as shown by MPN counts and coenzyme F420

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101

111

121

131

141

151

161

- 5

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

VO

L (g

CO

D l-

1 d-1

)

F 420

Coe

nzym

e(n

mol

esg-

1V

SS

)

Time (d)

F420

VOL

VOL (g COD l-1d-1)

Met

hano

gen

coun

ts(L

og M

PN

g-1

VS

S)

2.7 5.7 6.6 10.1 15.2 2.7 5.7 6.6 10.1 15.20

2

4

6

8

10

12H2 Acetate

AnalysisAnalysis of of MethanogenicMethanogenic ArchaealArchaeal CommunityCommunity

Preparazione delle singole eliche

A- con la temperatura

B- con primer fosforilati e digestione con λ-esonucleasi

λexon.

C- con primer biotinilati e catturamagnetica

biotin

Streptavidin+magnetic

beads

mag

net

Double str.

A B C

single strands

Analysis by SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) can resolve the diversity of bacteria and Archaea by separation of single

strand fragments with different conformations

MethanogenicMethanogenic ArchaealArchaeal Community: Community: DiversityDiversity

- PCR with a P-labelled primer- λ-nuclease digestion of the P-labelled strand- PCR on a collection of 30 methanogen species- PCR on biofilm collected at 5.7 and 10 g COD l-1d-1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

No apparent qualitative differences in the Archaea community pattern. The methanogen community was apparently dominated by

M.bacterium M.sarcina/M.saetaH2 consuming Acetate consuming

5’ end phosphorilated primer

SSCP analysis of 16S rRNA gene

P798 915Methanogen-specific primer Archaea-universal primer

MethanogenicMethanogenic ArchaealArchaeal Community: Community: AbundanceAbundanceQuantification of the different phylogenetic groups of methanogens based on

extinction of PCR signals amplified from biofilm sludge DNA[Wang et al., 1996 Appl. Environ. Microbiol. 62:1242-1247]

PCR sensitivity(the minimal n° of cells giving

amplification)

PCR titer(The maximum sludge DNA dilutions for positive PCR)

+++- -

PCR sensitivity

DNA extr.

Microscopic cell counts

Culture

Culture dilutions PCR

Sample

Sample dilutions

DNA extr.

+++- -PCR

PCR Titer

MethanogenicMethanogenic ArchaealArchaeal Community: Community: AbundanceAbundanceSpecific PCR for the different phylogenetic groups of methanogens were set

up basing on 16S rRNA gene signatures [Raskin et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:1232-1240]

5’ end bitinilated probe Magnetic Capturehybridization

B798 915Methanogen-specific primer Archaea-universal primer

Fwd 300 800 1100 1200

M.bact.

M.sarc.

M.coc.

M.micr

Specific PCR

Species (strains) Primer sets PCR sensitivity Mb Mc Mm Ms1 Ms2 Mb. formicicum 1535, 3637, 3636, 2639, 3722, 6299; Mb. ulginosum

2956; Mb. ivanovii 2611; Mb. bryantii 863; Mb. palustre 3108; Mb. thermoalcaliphilum 3267; Mb. thermoautotrophicum 1053, 3720; Mb. thermoaggregans 3266; Mb. wolfei 2970; Mb. thermophilum 6529; Mbrev. arboriphilicus 1125; Msph. stadtmanae 3091

+ - - - - 104

Mc. maripaludis 2067; Mc. voltae 1537; Mc. vannieli 1224 - + - - - 103 Mg. cariaci 1497; Mcull. marisnigri 1498; Mspirillum hungatei 864;

Mcorp. parvum 3823; Mcorp. sinense 4274; Mp. limicola 2279 - - + - - 102

Msar. barkeri 800; Msar. mazei 2053; Msar. vacuolata 1232; Msar. acetivorans 2834

- - - + - 102

Mtrix thermophila 6194; Msaeta concilii 3671 - - - + + 104

MethanogenicMethanogenic ArchaealArchaeal Community: Community: AbundanceAbundance

Following VOL increase methanogencommunity responded by changing the

relative abundance of different phylogenetic/physiological groups

VOL = 5.7(5.7 g COD l-1d-1)

VOL = 10.1(g COD l-1d-1)

PCR TITER IN THE BIOFILM

H2consuming

Acetate consuming

M.bacteriaceae 1011 108

M.microbiaceae 104 106

M.coccaceae n.d. n.d.

M.sarcina/M.saeta 108 109

H 2 H 2

12

10

8

6

4

2

0Met

hano

gen

coun

ts(L

og M

PN

g-1

VS

S)

Acet

ate

Acet

ate

ConclusionsConclusions

In the adopted reactor OMW were efficiently treated (COD removal around 90%) up to VOL of 15 g COD l-1 d-1

A decrease of CH4 specific production occurred at VOL of 10 g COD l-1 d-1

The overall diversity of methanogen was not affected as shown by SSCP and sequencing

Methanogen community reacted by re-balancing the H2trophic/acetotrophic methanogen ratio

TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLAGli scarti delle cantine vinicole sono costituiti dalle acque di lavaggio degli impianti di vinificazione e contengono parti dei raspi e le bucce degli acini

I reflui di cantina contengono concentrazioni residue di zuccheri e acido tartarico(dall’uva), etanolo, acido acetico e acido lattico (residui delle fermentazioni)

I reflui che derivano dalla vinificazione del vino rosso contengono anche considerevoli quantità di composti fenolici (antociani e tannini) che possono avere effetto tossico sui microrganismi coinvolti nella degradazione anaerobica, in particolare i metanogeni.

Trattamento dei reflui di cantina:• trattamento aerobico elevato consumo di energia richiesto dall’aerazione, e

necessità di aggiungere nutrienti• digestione anaerobica abbattimento del carico organico, con recupero di energia

(produzione di metano)

TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA

Un processo di digestione anaerobica degli effluenti di cantina vinicola è stato messo a punto in un impianto in scala di laboratorio

IMPIANTO:digestore cilindrico, h= 130 cm, riempito con materiale inerte di riempimento (truciolato di legno) come matrice di supporto. Caricamento in fase ascendente.

Il digestore conteneva una microflora selezionata nei trattamenti dei precedenti anni (depurazione degli effluenti di pirolisi, dell’acqua di vegetazione delle olive, degli impasti di cartiera)

TRATTAMENTO:le acque di cantina erano diluite fino ad avere un carico organico di COD=7-7,5 g/l, ed addizionate di NaHCO3 e NH4Cl.

Dopo un periodo di adattamento, il reattore ha raggiunto una fase di equilibrio “steady state” con una rimozione del COD del 90%. Il carico organico è stato quindi aumentato a 10,5-12,5 gCOD/ld, diminuendo il tempo di ritenzione a 16-17h

TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA

La digestione anaerobica delle acque provenienti dalla vinificazione in rosso è risultata meno efficiente rispetto a quella in bianco:

• minore rimozione di COD • inferiore produzione di metano• maggior contenuto di AGV nell’effluente (segnale di un’inibizione dei processi di acetogenesi e

metanogenesi)• le cariche dei metanogeni presenti nella fase circolante sono inferiori, mentre i batteri eterotrofi e

glucosio-fermentanti sono superiori

TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA

Il reattore è in grado di recuperare rapidamente (circa 10 giorni) shocks da carico organico pari ad un aumento improvviso di tre volte del carico organico specifico volumetrico

METANOGENESI A BASSA TEMPERATURAStart-up and operation of an anaerobic high-rate staged expanded granular sludgebed (EGSB) system for the treatment of cold (3 to 8°C), dilute wastewater (0.5 to

0.9 g of COD liter-1), containing 12 mg of O2 liter-1

METANOGENESI A BASSA TEMPERATURA

POTENZIALITA’ DELLA PRODUZIONE DI METANO- Trattamento termofilo reflui acidificati- Reattori UASB multipli- Carico organico fino a 100 kg COD m-3 day-1

POTENZIALITA’ DELLA PRODUZIONE DI METANO- Rimozione del COD > 90%- Tempo di ritenzione idraulico = 2-2.5 h- Produzione di biogas 40-50 m3 m-3

reattore day-1

LA METANOGENESI

POLIMERI

MONOMERI

ALCOLI SUCCINATOLATTATO

ACIDI GRASSI C2 C3

COMP. C1H2

ACETATO

CH4 CO2

1

1

2

3

4 5

Aci

doge

nesi

Ace

toge

nesi

Met

anaz

ione

Produzione di idrogeno scorporando le fasi di acidogenesi da quella di metanazione per favorire la produzione fermentativa di idrogeno

PRODUZIONE DI IDROGENO

PRODUZIONE DI IDROGENO

Produzione di idrogeno da reflui solidi scorporando acidogenesi da metanazionein due reattori con diverso tempo di ritenzione

PRODUZIONE DI IDROGENO Aumento

dell’accumulo di idrogeno

attraverso “sparging” di gas

nel reattore

Aumento delle rese di metano

nel rattoremetanogenico