Struttura delle immunoglobulinenella normalità e nella patologia

Le immunoglobuline sono anticorpi prodotti dal-le cellule B del sistema immunitario che servono al-l’organismo per difendersi da agenti estranei. In ge-nerale, ogni immunoglobulina è costituita da due ca-tene pesanti (identiche, dello stesso tipo) e da duecatene leggere (identiche, dello stesso tipo). Le im-munoglobuline sieriche vengono suddivise in 5 clas-si differenti (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) caratterizzateognuna da un tipo particolare di catena pesante (γ, α,µ, δ, ε); le catene leggere possono essere κ o λ. Ognicatena leggera ed ogni catena pesante presentanouna regione costante (Fc) ed una regione variabile(Fab); quest’ultima è quella deputata al riconosci-mento di antigeni estranei. In condizioni fisiologichele immunoglobuline sono quindi policlonali perchépresentano ciascuna una particolare regione varia-bile specifica per un determinato antigene.

La sintesi di catene pesanti e leggere avviene inmodo ordinato e nelle quantità opportune.

La cellula, infatti, assembla catene pesanti eleggere a formare l’intera molecola immunoglobu-linica senza lasciare residui apprezzabili. In real-tà, nel siero sono normalmente presenti piccolequantità di catene leggere libere, indicando che laproduzione di catene leggere è in lieve eccesso ri-spetto a quella delle catene pesanti. La concentra-zione plasmatica di catene leggere nel soggetto nor-male comunque è molto bassa; esse infatti, grazie alloro basso peso molecolare, passano rapidamentenel filtrato glomerulare renale, vengono riassorbi-te a livello tubulare e qui vengono catabolizzate. Incondizioni fisiologiche, quindi, la concentrazioneanche urinaria di catene leggere libere è molto bas-sa e le catene leggere presenti nelle urine sono di ti-po policlonale.

In alcune patologie possono essere presenti nelsiero immunoglobuline monoclonali, ossia immu-noglobuline strutturalmente identiche sia come ca-tena pesante che come catena leggera, oppure sipuò avere uno sbilanciamento nella sintesi di ca-tene leggere o pesanti.

Nefropatia da proteinuria di Bence-Jones

Elena Strada1, Luisita Battistelli2, Giorgio Savazzi1

1Dipartimento di Clinica Medica e Nefrologia, Università, Parma; 2U.O. Diagnostica Emato-Chimica, Diparti-mento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliero-Universitaria, Parma.

Pervenuto il 9 maggio 2008.

Riassunto. La proteinuria di Bence-Jones consiste nella presenza di catene leggere im-munoglobuliniche monoclonali nelle urine. Le catene leggere normalmente vengono eli-minate a livello renale ma, quando vengono prodotte in quantità eccessiva, determinanolesioni istologiche e funzionali a livello di tubuli, glomeruli e vasi sia per azione diretta,sia per rilascio di enzimi lisosomiali intracellulari, sia determinando l’ostruzione dei tu-buli renali. Trattiamo di questi danni renali in chiave morfologica e funzionale. La pro-teinuria di Bence-Jones può essere evidenziata attraverso elettroforesi, immunoelettro-foresi, immunofissazione elettroforetica, elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio-dodecil-solfato, elettroforesi bidimensionale ed elettroforesi capillare.

Parole chiave. Catene leggere, lesioni istologiche renali, proteinuria di Bence-Jones,tecniche elettroforetiche.

Summary. Bence-Jones proteinuria and kidney’s damages.Bence-Jones proteinuria consists in monoclonal light chains into the urine. Normally

kidney eliminates light chains but, when light chains are in excess, they make histologi-cal and functional lesion to tubules, glomerulus and vessels both by direct action, or ly-sosomal enzyme releasing or making tubular obstruction. We analyse these kidney’s da-mages from the morphological and functional point of view. Bence-Jones proteinuria canbe detected by urinary protein electrophoresis, immunoelectrophoresis, immunofixationelectrophoresis, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, two-dimen-sional electrophoresis and capillary electrophoresis.

Key words. Bence-Jones proteinuria, electrophoretic technique, kidney’s histological le-sions, light chains.

Vol. 99, N. 7-8, Luglio-Agosto 2008Pagg. 389-394

Queste catene leggereimmunoglobuliniche mo-noclonali sono presentinel siero (e successiva-mente nelle urine) deipazienti affetti da disor-dini proliferativi B-cellu-lari2, caratterizzati dal-l’iperproduzione di cate-ne leggere. Le patologiepiù frequentemente as-

sociate a proteinuria di Bence-Jones sono: mie-loma multiplo, macroglobulinemia di Walden-ström, linfomi maligni, leucemia linfatica croni-ca, M-GUS, amiloidosi3; in alcuni casi, la protei-nuria di Bence-Jones può essere idiopatica4 (ta-bella 1).

La proteinuriadi Bence-Jonesed i danni renali

La proteinuria di Bence-Jones è associata a lesioni alivello renale. Il 25% dei pa-zienti affetti da mielomamultiplo sviluppa insuffi-cienza renale, ma altera-zioni renali sono presen-ti in più del 50% dei pa-zienti5.

Nonostante siano molti ifattori che contribuisconoalla disfunzione renale neipazienti mielomatosi, ilprincipale è la filtrazione digrandi quantità di cateneleggere a livello glomerula-re, che determina un enor-me carico di catene che van-no incontro al riassorbimen-to tubulare. Disfunzioni tu-bulari si osservano in piùdel 98% dei pazienti chepresentano proteinuria diBence-Jones maggiore di 1g/24 ore, ma va consideratoche lesioni a livello tubula-re associate all’escrezione dicatene leggere sono, prati-camente, sempre presenti5.

A causa del loro bassopeso molecolare, le cateneleggere vengono filtrate a li-vello glomerulare, riassorbi-te e catabolizzate a livellotubulare. Quando il caricofiltrato è eccessivo, la capa-cità di riassorbimento tubu-lare viene superata e le ca-tene leggere compaiono nel-le urine5.

390 Recenti Progressi in Medicina, 99, 7-8, 2008

In alcune situazioni siverifica una produzioneeccessiva di catene leggerecon conseguente accumulodelle stesse nel plasma.Poiché, come già detto, lecatene leggere sono mole-cole piccole, esse passanoil filtro renale e, se vengo-no prodotte in una quanti-tà tale da superare la ca-pacità di riassorbimento tubulare o se il rene pre-senta una insufficienza tubulare tale da ridurre lacapacità di riassorbimento, possono essere elimina-te con le urine.

Le catene leggere urinarie possono quindi esse-re policlonali o monoclonali: in questo ultimo casocostituiscono la proteinuria di Bence-Jones.

Per proteinuria di Bence-Jones si intende lapresenza nelle urine di catene leggere im-munoglobuliniche monoclonali, ossia pro-dotte da un singolo clone di cellula B. Le ca-tene leggere monoclonali sono proteine ca-ratterizzate da una propria peculiare struttu-ra della regione variabile della molecola1.

Tabella 1.

Patologie associate ad iperproduzione di immunoglobuline monoclonali

Mieloma multiplo

Macroglobulinemia di Waldenström

Linfomi e altre neoplasie linfoproliferative

Leucemia linfatica cronica

M-GUS

Amiloidosi

Malattia delle catene pesanti

Malattia da deposito delle catene leggere

Sindrome POEMS

Crioglobulinemia di tipo I e II

Malattia cronica da crioagglutinine

Malattia di Castleman

Infezioni (osteomieliti, pielonefriti)

Neoplasie epiteliali

Patologie associate ad iperproduzione di catene leggere monoclonali

Mieloma multiplo (15-20% mieloma micromolecolare)

Macroglobulinemia di Waldenström

Leucemia linfatica cronica

M-GUS

Amiloidosi

Malattia delle catene pesanti

Malattia da deposito delle catene leggere

Patologie associate ad iperproduzione di catene leggere policlonali

Sarcoidosi

Tubercolosi polmonare

Lupus eritematoso sistemico

Artrite reumatoide

Crioglobulinemie miste

Aggiungasi che se la quantità di catene leggereriassorbite dalla cellula tubulare supera la capaci-tà catabolica della cellula stessa, le catene leggeresi accumulano nella cellula con conseguente soffe-renza cellulare, sia per effetto tossico diretto dellecatene leggere sia per il rilascio di enzimi lisoso-miali intracellulari6. In sintesi, l’eccessiva pro-duzione di catene leggere in circolo procuraun sovraccarico tubulare con conseguenteproteinuria e danno tubulare.

Non c’è differenza tra la nefrotossicità determi-nata dalle catene leggere di tipo kappa o lambda12,anche se non tutte le catene leggere danneggiano inefroni allo stesso modo13. Ci sono infatti pazienticon proteinuria di Bence-Jones minima che svi-luppano una rapida e irreversibile compromissionerenale, mentre altri pazienti con proteinuria diBence-Jones importante non presentano, per anni,danni renali. Allo stato attuale delle conoscenze, siritiene che a modificare l’affinità delle proteine peril rene siano la differente glicosilazione13 ed il di-verso grado di aggregazione14 delle proteine diBence-Jones.

Le lesioni istologiche e le anomalie funzionalidella proteinuria di Bence-Jones

Nella maggior parte dei casi, il coinvolgimentoglomerulare si manifesta con un quadro di glome-rulosclerosi nodulare, il danno tubulare determi-na la comparsa di sindrome di Fanconi o di tubu-lopatia ostruttiva, mentre il danno vasale è tipica-mente di tipo amiloidosico.

La diagnosi di malattia da deposito di cateneleggere viene posta con la dimostrazione all’im-munoflurescenza di depositi di catene κ o λ mono-clonali, in assenza di altre immunoglobuline o com-ponenti del complemento7 a livello delle succitatestrutture.

Ma le lesioni renali più frequenti riguardano itubuli, soprattutto quelli distali e l’ansa di Henle,dove – a livello del versante interstiziale dellemembrane basali tubulari – si osservano depositinastriformi di materiale refrattile, eosinofilo, PASpositivo, non congofilo8. L’epitelio tubulare appareappiattito ed atrofico e le cellule epiteliali tubula-ri contengono gocciole di sostanza ialina6. Neglistadi più avanzati compare marcata fibrosi inter-stiziale con depositi refrattili e lesioni tubulari se-vere. A livello intratubulare sono presenti cilindriialini costituiti dalla proteina di Bence-Jones8;queste lesioni precedono anche di anni la compar-sa di lesioni glomerulari e la ridotta filtrazione glo-merulare8.

La tubulotossicità delle catene leggere parzial-mente metabolizzate dall’epitelio tubulare è re-

La proteinuria di Bence Jones può determinarela comparsa di diversi tipi di lesioni a livello re-nale essendo le catene leggere in grado di dan-neggiare glomeruli, tubuli e vasi renali.

sponsabile delle disfunzioni renali presenti nei pa-zienti con proteinuria di Bence-Jones ed istologi-camente appare quindi con atrofia tubulare, fibro-si interstiziale e reazione macrofagica che circondai tubuli contenenti i cristalli9. Il quadro clinico,raro ma caratteristico, della tubulopatia daparaproteine è rappresentato dalla sindromedi Fanconi: acidosi tubulare, glicosuria, ammi-noaciduria, ipokaliemia, ipofosfatemia, ipourice-mia, proteinuria; è comune un difetto nell’acidifi-cazione renale6.

La proteinuria di Bence-Jones, sebbene più ra-ramente, può determinare alterazioni morfologi-che anche a livello glomerulare. In circa il 60% deicasi è presente un quadro di glomerulosclerosinodulare6. I glomeruli appaiono ingranditi conespansione della matrice mangiale diffusa e no-dulare, spesso accompagnata da ipercellularitàmesangiale. Tipicamente, la membrana basaleglomerulare appare normale o lievemente ispes-sita10. Negli altri casi i glomeruli possono mante-nersi intatti o presentare espansione dell’asse me-sangiale con ipercellularità intercapillare edaspetti di tipo membrano-proliferativo con o sen-za noduli centrolobulari. La proliferazione e lasclerosi possono talvolta assumere aspetti di tipoglobulare6. Può essere presente proliferazione ex-tracapillare8.

All’immunofluorescenza si rilevano depositi dicatene leggere nel contesto del mesangio e nellepareti capillari, in assenza di componenti del com-plemento6; la tecnica permette di distinguere i va-ri tipi di catene che vanno a comporre i depositi. Incirca l’80% dei casi si tratta di catene leggere mo-noclonali di tipo κ10. Queste catene si trovano prin-cipalmente a livello delle membrane basali tubu-lari e dei capillari che circondano le lesioni nodu-lari, più che nei noduli stessi8.

Quando le lesioni glomerulari sono minime, sipuò utilizzare la microscopia elettronica per evi-denziare depositi lineari elettrodensi sul versantesottoendoteliale delle membrane basali e del me-sangio. Depositi si possono ritrovare anche a livel-lo di arterie, arteriole e capillari peritubulari.8

Le catene leggere monoclonali possono deposi-tarsi a livello dei vasi renali determinando la com-parsa di un quadro di amiloidosi caratterizzata dadeposizione perivascolare di proteine fibrillari pa-tologiche. Tale materiale deriva dalla deposizione emetabolismo locale da parte di monocito-macrofagidi frammenti di gammaglobuline, complessate adaltre componenti proteiche. A livello renale si puòosservare deposizione mesangiale e, nelle anse ca-pillari, deposizione di materiale amorfo, ialino, po-sitivo alla colorazione con rosso Congo. Il coinvolgi-mento è principalmente a livello delle piccole arte-rie, arteriole e delle membrane basali tubulari6 .

L’immunofluorescenza permette di identifi-care la presenza di catene leggere monoclonali ti-po κ o λ, che, generalmente, appaiono mutate nel-la composizione amminoacidica e nella strutturaterziaria e quaternaria6. Sembra che un’anomalaglicosilazione delle catene leggere possa facilitarela deposizione di tali catene nei tessuti8.

E. Strada, L. Battistelli, G. Savazzi: Nefropatia da proteinuria di Bence-Jones 391

In pratica, quindi, la biopsia renale mostraispessimento della membrana basale e cristallielettrodensi nelle cellule epiteliali dei tubuli pros-simali renali; l’immunofluorescenza rivela deposi-zione di catene leggere nelle cellule epiteliali deitubuli prossimali renali22.

Alla microscopia immunoelettronica è presenteun significativo accumulo intracellulare di proteinedi Bence-Jones neutre, deficit di acidificazione deipre-lisosomi/lisosomi e ritenzione del recettoreman-noso-6-fosfato catione-indipendente23. Alcune cate-ne leggere determinano inizialmente la perdita deimicrovilli a livello delle cellule dei tubuli prossimalirenali e, successivamente, l’esfoliazione e la fram-mentazione cellulare16. Si può osservare, inoltre,espansione nodulare del mesangio con deposizionedelle catene leggere (kappa o lambda) nello spaziomesangiale19. Le catene leggere si depositano a for-mare strutture fibrillari di materiale amorfo PAS po-sitivo a livello delle pareti vasali, nei glomeruli e nelmesangio e possono essere evidenziate con il rossoCongo20. E’ presente notevole fibrosi interstiziale21.

Ma quali sono i meccanismi patogeneticiche portano a questi tipi di lesioni istologiche?

Innanzitutto alcune catene leggere tendono adaggregarsi tra loro diventando incapaci di passarela membrana glomerulare e di conseguenza tendo-no a precipitare nel mesangio11.

Inoltre, come già accennato, le catene leggere cheraggiungono i tubuli renali si legano ad una proteinadi trasporto, la cubilina (una grossa glicoproteina ana-tomicamente e funzionalmente associata allamegali-na), che ne permette l’endocitosi nelle cellule tubula-ri. Le catene leggere penetrate all’interno delle cellu-le tubulari vengono quindi catabolizzate da enzimiidrolitici intra-lisosomiali. In presenza di gammapa-tiemonoclonali questo sistema di endocitosi-cataboli-smo viene saturato, con conseguente accumulo di ca-tene leggere intratubulari e congestione dei processicatabolici lisosomiali dei tubuli prossimali11.

Le catene leggere determinano danno allecellule tubulari sia attraverso un’azione di-retta tossica sia indirettamente tramite il ri-lascio degli enzimi lisosomiali intracellulari5.

Per quanto riguarda l’azione tossica diretta,si è visto che le catene leggere di tipo lambda ridu-cono notevolmente l’attività della pompa Na-K-ATPasi, di GADPH, di beta-actina, di S 28 RNA el’incorporazione di timidina nelle cellule dei tubulirenali prossimali con modalità dose-dipendente15.

Alcune catene leggere danneggiano le cellule tu-bulari renali andando ad alterare il trasporto in-tracellulare di amminoacidi, glucosio ed elettroliti16.

Alcune proteine di Bence-Jones, inoltre, pene-trano all’interno dei nuclei delle cellule dei tubuliprossimali renali e determinano frammentazionedel DNA con morte cellulare17. Le proteine di Ben-ce-Jones con attività amidasica relativamente ele-vata sono citotossiche, alcune delle proteine diBence-Jones con attività DNasica hanno effetto ci-tocida, le proteine di Bence-Jones con attività

DNasica relativamente elevata ma con attivitàamidasica molto bassa non penetrano invece nellecellule e non hanno effetto citotossico17.

La tossicità cellulare indiretta delle protei-ne di Bence-Jones si concreta col riassorbimentodelle catene leggere, che va ad attivare i lisosomiintracellulari con conseguente aumento degli enzi-mi citotossici a livello cellulare18. Gli enzimi liso-somiali vengono rilasciati all’interno del citosoldelle cellule tubulari determinandone vacuolizza-zione, frammentazione e desquamazione11.

A causa della saturazione del meccanismo diendocitosi, alcune catene leggere raggiungono i tu-buli distali dove vanno a formare cilindri11. La pre-senza di catene leggere nei tubuli renali determinaun aumento della pressione intratubulare e l’ostru-zione dei tubuli distali16. Cilindri tubulari si for-mano per l’aggregazione delle catene leggere conla proteina di Tamm-Horsfall che viene sintetizza-ta dalle cellule dell’ansa di Henle16. Le catene leg-gere, inoltre, riducono il riassorbimento di cloronell’ansa di Henle, aumentandone la concentra-zione a livello dei tubuli distali, fatto che facilitaulteriormente la formazione di cilindri16.

L’ostruzione tubulare causata dai cilindri de-termina una spiccata risposta infiammatoria16,amplificata dal fatto che le proteine riassorbite dal-le cellule tubulari vengono in parte metabolizzatedeterminando un aumento dell’ammonio, il qualeattiva il complemento18.

Modalità di rilevamentodella proteinuria di Bence-Jones

La proteinuria viene generalmente valutata at-traverso elettroforesi, immunoelettroforesi, immu-nofissazione elettroforetica, elettroforesi su gel dipoliacrilammide con sodio-dodecil-solfato, elettro-foresi bidimensionale o elettroforesi capillare24.

I metodi elettroforetici vengono utilizzati routi-nariamente per l’analisi delle proteine urinarie sul-la base della carica e della dimensione cellulare25.Questi metodi richiedono, innanzitutto, che le urinevengano concentrate, generalmente attraverso l’ul-trafiltrazione25; tuttavia le procedure per concen-trare le urine determinano problemi come perdita,aggregazione e degradazione delle proteine3. In al-cuni casi, inoltre, i risultati sono di particolare dif-ficoltà interpretativa poiché le proteine di Bence-Jones possono comigrare insieme ad immunoglobu-line intatte ed a proteine di altro genere quali, adesempio, la transferrina25. L’elettroforesi, infatti, se-para le proteine in base al loro punto isoelettrico,ma non fornisce indicazioni sicure e dirette sulleproteine che compongono la banda elettroforetica.

392 Recenti Progressi in Medicina, 99, 7-8, 2008

Considerata l’entità delle lesioni renaliprovocate dalla proteinuria di Bence-Jo-nes, è importante evidenziare la presenza di ca-tene leggere nelle urine.

La tecnica elettroforetica più frequentementeutilizzata per la quantificazione della proteinu-ria di Bence-Jones è l’elettroforesi su gel di aga-rosio di urine concentrate, seguita da densito-metria; la concentrazione della proteinuria diBence-Jones viene calcolata moltiplicando la fra-zione delle proteine urinarie totali nella banda diBence-Jones per la concentrazione totale delleproteine urinarie27. Questo metodo presenta peròdue inconvenienti: il primo, come già spiegato, èche alcune proteine possono essere perse duran-te le procedure di concentrazione, ed il secondo èche non tutti i laboratori utilizzano gli stessi me-todi per quantificare la concentrazione totale del-le proteine urinarie27. Per eliminare questi in-convenienti, si è visto che l’elettroforesi su gel diagarosio di urine non concentrate, insieme a se-rie di calibratori di albumina, seguita da colora-zione con acido violetto e densitometria, è abba-stanza sensibile per quantificare la proteinuriadi Bence-Jones27; tuttavia questa tecnica non vie-ne utilizzata di routine. Un’altra tecnica che puòessere adottata per evidenziare le catene leggere(mono- o policlonali) è l’elettroforesi su gel di po-liacrilammide con sodio-dodecil-solfato, che se-para le proteine in base alla loro dimensione; dif-ferenzia inoltre la proteinuria di origine glome-rulare da quella tubulare o mista25. Anche que-sta tecnica, tuttavia, non viene comunementeadoperata.

Le tecniche elettroforetiche routinariamenteimpiegate sono di scarsa utilità nell’individua-zione di proteinuria di Bence-Jones in quantonon permettono di individuare con certezza né lamonoclonalità del picco né l’entità della protei-nuria.

Il metodo più sensibile per evidenziare protei-nuria di Bence-Jones è l’immunofissazione elettro-foretica di urine concentrate che si realizza combi-nando una tecnica separativa (l’elettroforesi) conuna tecnica immunologica (l’immunoprecipitazio-ne). Le tecniche immunoelettroforetiche (immuno-fissazione) permettono di evidenziare le due carat-teristiche patognomoniche delle catene leggere: lamonoclonalità e l’assenza di catene pesanti26. Tut-tavia questo esame permette solo una valutazionequalitativa27 della proteinuria.

I metodi immunochimici, come la nefelometria ela turbidimetria che sono tecniche di immunopre-cipitazione in fase liquida, permettono una valuta-zione quantitativa della proteinuria di Bence-Jonesnon sufficientemente accurata, a causa delle diver-se forme molecolari (frammenti e polimeri) con cuisi possono presentare le catene leggere nelle uri-ne26. Le tecniche di immunoprecipitazione in faseliquida possono essere indirette, con antisieri anticatene leggere totali; oppure dirette, con antisierianti catene leggere libere.

� Nel primo caso si determinano alcune protei-ne con l’immunoprecipitazione che permettono dicalcolare la presenza di catene leggere libere, ma irisultati così ottenuti sono imprecisi sia qualitati-vamente sia quantitativamente.

� Nel secondo caso si possono utilizzare cam-pioni non concentrati che vengono fatti reagire conantisieri specifici anti catene leggere, ottenendo ri-sultati buoni qualitativamente, ma quantitativa-mente non accurati, per la presenza di diverse for-me di aggregazione delle proteine di Bence-Jones eper la mancanza di parallelismo tra calibratore ecampione28.

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1. Il miglior metodo per evidenziare proteinu-ria di Bence-Jones risulta essere la combina-zione di immunofissazione, elettroforesi edimmunoprecipitazione in gel29.

2. Nella maggior parte dei casi, la determina-zione quantitativa delle catene leggere nelleurine si effettua con la nefelometria e la mo-noclonalità della proteinuria di Bence-Jonesviene confermata con l’immunofissazione sugel di agarosio30.

3. Si pone – tuttavia – la questione di quantoeffettivamente gli studi immunoforetici pos-sano evidenziare la reale monoclonalità del-le catene leggere e quantificarla. Infatti, l’im-munoreattività antigenica delle catene leg-gere deve essere identica all’immunoreatti-vità antigenica del calibratore ed inoltre lecatene leggere possono presentarsi come mo-nomeri, dimeri o in frammenti, rendendo dif-ficile il dosaggio quantitativo1.

Conclusioni: i punti chiave

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Indirizzo per la corrispondenza:Prof. Giorgio SavazziAzienda Ospedaliero-UniversitariaDipartimento di Clinica Medica e NefrologiaVia Gramsci, 1443100 ParmaE-mail: giorgio-savazzi@unipr.it