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UNIVERSITA' CAMPUS BIO-MEDICO DI ROMAVia Álvaro del Portillo, 21 - 00128 Roma - Italiawww.unicampus.it

Baobab fruit as a novel superfoods from Africa

Marina RussoRicercatore di Chimica degli Alimenti

[email protected]

Laura De Gara

Consiglio Nazionale delle Ricerche, Dipartimento di Scienze Bio-Agroalimentari

Bari, 06-07 Dicembre 2018

UNIVERSITA' CAMPUS BIO-MEDICO DI ROMAwww.unicampus.it


Il Baobab appartiene alla famiglia delle Bombacaceae, genere Adansonia

Albero longevo, cresce spontaneamente



Repellente per insettiAnalgesicoFebricidaUtile al trattamento di anemiaAntinfezioni microbicheAnti-tubercolosiAnti-diarrheaEcc…..

Usi tradizionali come farmaco

Antidoto a pozioni



Ceneri

Ca. 35% AECa. 10% AGE



Ca ~ 1200 mg/100 gK ~ 1700 mg/100 g

K ~ 1400 mg/100 g



-80°C



shell

kernel2 h

100°C



1 g

1. Estrazione Vitamina C

+ 10 mL acqua (0.5% acido formico) a 4°C

HPLC/PDA

Determinazionespettrofotometrica



1. Determinazione Vitamina C

Colonna: Luna C18 (250 × 3 mm × 5 μm) (Phenomenex, PA, USA);Volume d’iniezione: 2 μL;Mobile phase: acqua/acido formico (99.5:0.5, v/v) (solv. A), acetonitrile/acido formico (99.5:0.5, v/v) (solv. B);Gradiente: 0 min, 0% B, 5 min, 0% B, 15 min, 22% B, 20 min, 100% B, 25 min, 100% B;Flusso: 0.3 mL/min;Rivelatore: range 190-400 nm, cromatogrammi estratti a 245 nm.

Shimadzu Prominence LC-20A system

Shimadzu UV-1800

Ascorbato totale determinato dopo riduzione di DHA ad ascorbicocon DTT.

Gli estratti vengono addizionati con tampone fosfato 150 mM (pH7.4), lasciati a temp. ambiente per 10 minuti.La reazione colorimetrica avviene aggiungendo i seguentireagenti: acido ortofosforico, FeCl3, TCA, α,α’-dipyridyl in 70%etanolo, e lasciando a 40°C per 40 minuti.

Assorbanza letta a 525 nm.




Cromatogramma RP-HPLC/UV dell’ acido ascorbico contenuto nel campione di polpa

Campione Acido*ascorbico

mg/100g ± SDHPLC

Acido*ascorbico

mg/100g ± SDcolorimetrico

Frutto 49.5 ± 0.52 48.0 ± 1.65Seme 1.0 ± 0.03 -Polpa 135.6 ± 1.01 167.1 ± 6.72Kernel < LOD -Shell < LOD -

*[Chadare et al. 2009; Komatou et al. 2011]




135 mg/100 g

85 mg/100 g110 mg/100 g

50 mg/100 g

160 mg/100 g

200 mg/100 g



10 mL acqua (0.1% acido

formico)

10 mLacqua/acetonitrile

(1:1 v/v, 0.1% acido formico)

10 mL acetonitrile(0.1% acido

formico)1 g

2. Estrazione delle molecole bioattive

HPLC/PDA/MS/MS

TEACDPPHFolin



Determinazione dei fenoli totali

- Metodo Folin-CiocalteuL’estratto in metanolo/acqua di ciascun campione addizionato del reattivo,viene incubato per 8 minuti a temperature ambiente. Si addizionacarbonato di sodio e si lascia a reagire al buio per 2 ore. Si legge quindil’assorbanza a 765 nm.

- Saggio DPPHL’estratto in metanolo/acqua di ciascun campione viene addizionato diDPPH e lasciato al buio per 20 minuti a temperatura ambiente. Si leggequindi l’assorbanza a 518 nm.

Determinazione dell’attività “free radical scavenging” delle molecolebiologicamente attive

- Saggio TEACL’estratto in metanolo/acqua di ciascun campione viene addizionato ditampone fostato 5 mM e addizionato della soluzione radical cationicaABTS•+ . Si legge quindi l’assorbanza a 734 nm.



2. Determinazione delle molecole bioattive

Colonna: Ascentis® Express C18, 150 × 4.6 mm I.D. × 2.7 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Germany);Volume d’iniezione: 2 μL;Fase mobile: acqua/acido formico (99.9:0.1, v/v) (solv. A), acetonitrile/acido formico (99.9:0.1, v/v) (solv. B);Gradiente: 0 min, 0% B, 5 min, 0% B, 40 min, 40% B, 50 min, 100% B;Flusso: 1.0 mL/min;PDA: range 190-400 nm, chromatogrammi estratti a 280 e 325 nm.MS: interfaccia ESI, ionizzazione negative e positive; range di massa spettrale m/z 100-1200; velocità discansione, 2000 amu/s; flusso di N2, 3.0 L/min; temperatura ESI, 300°C; heat block, 300°C; DL (desolvationline), 250°C; interface voltage of 3.5 kV and detector voltage of 1.8 kV.




Attribuzione identità

molecolare

Elaborazione dato

Indagine preliminare

Analisi in SIM

Molecole isobare

PIS

(865, 577, 289 m/z)

Neutral loss

(289 m/z)

Utilizzo standard commerciali

Utilizzo

Rt




Cromatogramma RP-HPLC/PDA dei polifenoli presenti nella polpa di baobab. 1. Procyanidin B isomer 1; 2. Catechinglucoronide; 3. Procyanidin B2; 4. Procyanidin C tetramer isomer 1; 5. Procyanidin tetramer isomer 2; 6. (-)-Epicatechin; 7. Procyanidin C isomer 1; 8. Procyanidin tetramer isomer 3; 9. Procyanidin C isomer 2; 10. Gallocatechinhexoside; 11. Procyanidin B isomer 3.




Composti λmax m/z RtRt

RSD %

Area

RSD %Regression line R2

LOD

(mg/Kg)

LOQ

(mg/Kg)

Recovery

%Procyanidin B2 279 578 19.06 0.75 3.12 y = 15125x + 236133 0.990 0.045 0.096 87.8(-) Epicatechin 279 290 20.05 0.78 3.24 y = 16383x + 56568 0.994 0.037 0.083 90.3Procyanidin A2 280 576 22.52 0.86 3.09 y = 14755x - 11353 0.990 0.028 0.050 85.2

Recovery % = [(Conc. Sample Fortified – Conc. Sample Unfortified)/Fortification]*100



Composti m/zMS/MS ions

[M-H]-

MS/MS ions

[M+H]+

Seme Polpa Shell Kernel

Polifenoli

Quercetin-3-O-b-D-glucoside a 463 Low abundance ions Low abundance ions 1.9 ± 0.04 < LOD < LOD 1.9 ± 0.03

Procyanidin B isomer 1b 578 577, 413, 407, 289 579, 386 < LOD 5.2 ± 0.20 < LOD < LOD

Catechin glucoronidea 564 563, 517 536 1.0 ± 0.04 5.7 ± 0.02 < LOD 1.4 ± 0.06

Procyanidin B2 578 577, 413, 407, 289 579, 386 10.5 ± 0.28 100.1 ± 1.75 1.5 ± 0.01 23.5 ± 0.08

Procyanidin tetramer isomer 1c 1154 1153, 1001, 865, 863, 576, 289 - < LOD 42.8 ± 0.69 < LOD < LOD

Procyanidin tetramer isomer 2c 1154 1153, 865, 576, 427 400 0.9 ± 0.02 23.3 ± 1.10 < LOD 8.0 ± 0.14

Epicatechin 290 289 291 7.2 ± 0.03 104.8 ± 2.34 1.8 ± 0.02 < LOD

Procyanidin C isomer 1c 866 865, 576, 289 867, 579 2.5 ± 0.03 7.2 ± 0.16 1.1 ± 0.03 < LOD

Procyanidin tetramer isomer 3c 1154 1153, 1001, 865, 863, 576, 289 867, 579 < LOD 11.3 ± 0.28 < LOD < LOD

Procyanidin C isomer 2c 866 865, 576, 289 867, 579 2.0 ± 0.01 4.6 ± 0.13 0.8 ± 0.02 < LOD

Procyanidin A2 576 475 448 1.0 ± 0.03 8.6 ± 0.12 0.7 ± 0.03 < LOD

Gallocatechin hexosidea 488 487 465 < LOD 2.2 ± 0.03 < LOD < LOD

Procyanidin B isomer 2b 578 577, 413, 289 579, 386 < LOD 12.2 ± 0.67 < LOD < LOD

Tot. polifenoli 27.0 ± 0.34 328.2 ± 7.26 5.9 ± 0.08 34.8 ± 0.08

Acido Ascorbico 1.0 ± 0.03 135.6 ± 1.01 < LOD < LOD

Totale di molecule bioattive 28.0 463.8 5.9 34.8

Molecole determinate quantitativamente utilizzando le rette di calibrazione dei seguenti standard: aepicatechin, bprocyanidin B2, cprocyanidin A2.



ISOLAMENTO DELLE PROCIANIDINE MEDIANTE HPLC PREPARATIVO

2 g di polpa

Estratti con 50 mL di

H2O/MeOH(1:1)

Estrattoconcentrato

a 1 mL

HPLCpreparativo

Colonna C18 (250×10mm×

5 µm)

H2O/ACN (1:1), flusso 3

mL/min

200 uLvolume

d’iniezione

5 iniezioni ripetute

Raccoltadi 3

frazioni



0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2750mAU

Detector A Ch2:245nm Detector A Ch1:280nm A B C

0 10 20 30 40 50 min0

50100150200250300350400450500550600650700750

mAU

Detector A Ch2:280nm Detector A Ch1:245nm

0 10 20 30 40 50 min0255075100125150175200225250275300

mAU


0 10 20 30 40 50 min0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300mAU




mg GAE/g

umol TE/g umol TE/g



Conclusioni

RICCA FONTE DI VITAMINA C E PROCIANIDINE

ELEVATA LA CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE (SINERGIA TRA ACIDO

ASCORBICO E POLIFENOLI)

OPINIONE DELL’EFSA 100 mg al giorno di polifenoli

FDA ~ 15% nelle preparazioni alimentari

Aggiungere tra gli ingredienti il 6% di polpa di baobab in un integratore alimentare

(100 g) garantisce il 20% (19 mg) della quantità giornaliera raccomandata.

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