Boli. Soc. Me d. Chir. Modena Anno CVI- N. 1-2- 1991

Articoli originali

MARKER IMMUNOISTOCHIMICI DEL CARCINOMA GASTRICO PRECOCE

CARMELA DI GREGORIO, CATERINA SANNICOLA, GIOVANNI FERRARI, CARMELA DE GAETANI

Università di Modena Istituto di Anatomia e Istologia Patologica (Direttore: Prof. G. P. Trentini) Cattedra di Tecnica e Diagnostica Istopatologica (Titolare: Prof. C. De Gaetani)

Riassunto

74 casi di carcinoma gastrico precoce sono stati sottoposti a studio istochimico delle mucine prodotte e a studio immunoistochimico per la ricerca dell'antigene carcina-embrionale (CEA), del lisozima (LYS), dell'alfa-1-antitripsina (AAT) e dell'alfa-1-antichimotripsina (ACT). La positività ai marker esaminati appare indipendente dalla sede di origine della neoplasia, mentre per quanto riguarda l'istotipo neoplastico sono state rilevate diverse modalità di espressione. La percentuale di positività per i marker è tendenzialmente più alta nelle forme ben differenziate: unica eccezione per il CEA, positivo nell'SO% dei carcinomi sigillocellulari. Anche nei casi con simultanea produzione dei 4 marker le forme differenziate risultano le più frequenti. La positività per CEA, L YS ed AAT sembra avere inoltre una correlazione col tipo di mucine prodotte dalle cellule neoplastiche, a differenza dell'ACT che non è risultata correlabile col tipo di mucine. Il follow-up a 5 anni non ha rilevato differenze prognostiche significative tra tumori positivi e negativi per CEA, AAT ed ACT, né tanto ineno tra i diversi istotipi e tra i diversi gradi di differenziazione neoplastica. Solo i carcinomi lisozima-positivi sembrano avere una pro gnosi peggiore rispetto ai carcinomi lisozima-negativi.

Parole chiave: Carcinoma gastrico precoce, Antigene carcina-embrionale, Lisozima, Alfa-1-antitripsina, Alfa-1-antichimotripsina.

Summwy

IMMUNOHISTOCHEMICAL MARKERS OF EARLY GASTRIC CARCINOMA

74 cases of early gastric cancer were studi ed histochemically for tumour mucin content an d immunohistochemical­ly far localization of carcinoembryonic antigen (CEA), lysozyme (L YS), alpha-1-antitrypsin (AA T) and alpha-1-antichymotrypsin (ACT). The positivity of the examined markers appears to be independent of the site of neoplasm, but its expression varies an the basis of the histotype of the neoplasm. The studied markers were more often positive in well-differentiated tumours, except far CEA which resulted positive in more than 80% of the signet ring celi carcinomas. Simultaneous production of the 4 markers was frequently found in the well-differentia­ted tumours. The positivity far CEA, L YS and AAT appears to be closely correlated with the type of mucin produced by the neoplastic cells, whereas ACT was not correlated with any type of mucin. A 5-year follow-up revealed no significant prognostic differences for the different histological types, o n the basis of neoplasm grading, or positivity or negativity to CEA, AAT and ACT. Lysozyme-positive carcinomas alone had a worse prognosis than lysozyme-negative carcinomas.

Key words: Early gastric cancer, Carcinoembryonic antigen, Lysozyme, Alpha-1-antitrypsin, Alpha-1-antichymo­trypsin.

Introduzione

Da tempo la ricerca è indirizzata alla identificazione di nuovi marker da utilizzare

sia per la definizione istologica ed istogene­tica delle neoplasie (2, 8, 10, 17), sia come indicatori della prognosi (11, 18, 22, 23, 25) e del monitoraggio terapeutico (7, 13). In par-

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ticolare, nei pazienti con carcinoma gastrico uno dei marker più studiati è l'antigene car­cino-embrionale (CEA), la cui presenza vie­ne documentata con metodi immunoistochi­mici nel tessuto neoplastico (6, 11, 14, 16, 21, 25) e con metodi radioimmunologici nel sangue e nel succo gastrico (1, 5, 24). Recen­temente sono stati inoltre identificati con tecnica immunoistochimica anche l'alfa-1-antitripsina (AA T), l'alfa-1-antichimotripsi­na (ACT) ed il lisozima (L YS) (3, 10, 22, 23, 25) ed è stata suggerita una possibile corre­lazione tra loro positività nel tessuto neopla­stico e prognosi del carcinoma gastrico avanzato.

Scopo di questa ricerca è di valutare la presenza di questi marker nel carcinoma gastrico precoce per stabilirne un'eventuale correlazione con la prognosi, specie in con­siderazione del fatto che circa il 20% di questi casi, nonostante la diagnosi di preco­cità, evolve in maniera infausta a 5 anni dall'intervento.

Materiali e metodi

Lo studio è stato condotto su 74 casi di carcinoma gastrico precoce diagnosticati nel nostro Istituto nel periodo 1972-1985. Quat­tro di essi erano localizzati al cardias, 18 al corpo, 10 all'angulus, 32 all'antro e 10 al piloro. La neoplasia era limitata alla mucosa in 64 casi mentre in 10 era estesa alla sotto­mucosa.

La diagnosi istopatologica, integrata an­che dallo studio istochimico delle mucine elaborate dalla neoplasia, è stata formulata in accordo con la classificazione di Mulligan (15), che distingue 4 istotipi principali: il carcinoma di tipo mucocellulare o gastrico (MC), il carcinoma di tipo intestinale (IC), il carcinoma di tipo pilocardiale (PC) ed il carcinoma di tipo misto, caratterizzato dal combinarsi dei vari aspetti istologici. La va­lutazione del grado istologico ha portato inoltre alla suddivisione di ogni istotipo in forme ben differenziate, moderatamente e scarsamente differenziate e sigillocellulari.

Il materiale, prelevato da pezzi operatori, è stato fissato in formalina calcica al 10% ed

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incluso in paraffina alla maniera convenzio­nale. Le sezioni di 4 micron sono state colo­rate con ematossilina-eosina e sottoposte inoltre alle seguenti reazioni: l) alcian blu pH 2,5-PAS (AB-PAS) per evidenziare le mucine neutre ed acide; 2) periodato boroi­druro-idrossido di potassio-PAS (PB-KOH­PAS) sec. Culling ( 4) per le sialomucine-0-acetilate; 3) high iran diamine (HID)-alcian blu pH 2,5 sec. Spicer (19) per le mucine acide solfate e non solfa te; 4) metacromasia da blu di toluidina pH 3 alcool-resistente sec. Lison (12) per le solfomucine.

La dimostrazione di CEA, L YS, AAT, ACT è stata effettuata su sezioni seriate mediante la tecnica dell'immunoperossidasi (PAP) di Sternberger (20). Dopo sparaffi­natura, le sezioni venivano poste in alcool a 90° e trattate per 30' con una soluzione al 3% di H20 2 in m etanolo assoluto per blocca­re le perossidasi endogene. In seguito erano trattate con acido periodico al 2,28%, poi con sodio boroidruro allo 0,02% ed infine con siero normale di suino 1:10 secondo Heyderman e Munroe Neville (9), al fine di ridurre la colorazione aspecifica di fondo e la cross-reattività degli antisieri specifici con altri peptidi presenti nel tessuto. Le sezioni venivano poi incubate a 4o C per 24 ore con sieri anti-CEA (1:5.000), anti-LYS (1:2.000), anti-ACT (1:1.500) e anti-AAT (1:1.500) prodotti in coniglio (DAKO­PATT, Denmark) e successivamente tratta­te con IgG di suino an ti-coniglio diluite 1:50, poi con P AP l: 100 per 30' in camera umida a temperatura ambiente. Il prodotto di rea­zione veniva evidenziato mediante tratta­mento per 5' in camera oscura con diamino­benzidina O, 075% e perossido 0,05% in PBS pH7,6.

La specificità delle reazioni è stata deter­minata come descritto da Wittekind et al. (25).

Risultati

La distribuzione per localizzazione, istoti­po e grado istologico dei 74 casi di carcino­ma gastrico precoce, oggetto del nostro stu­dio, è riprodotta nella tab. I. Da essa risulta

Anno CVI- N. 1-2- 1991 Carcinoma gascrico precoce

T ab. I. Sede, istotipo e grado istologico di 74 casi di carcinoma gastrico precoce.

Istotipo N°casi

cardias MC 15 l IC 26 l PC 18 3

MISTO 15 l

TOTALE 74 4

MC: carcinoma di tipo mucocellulare IC: carcinoma di tipo intestinale PC: carcinoma di tipo pilorocardiale

Sede

corpo angulus 3 3 5 5 3 l 7 2

18 lO

che la localizzazione prevalente, tranne che per gli istotipi misti, è quella antro-pilorica e che la sede meno colpita è quella cardiale, dove la maggioranza dei tumori (3 su 4) è rappresentata dall'istotipo pilorocardiale.

Relativamente al grado di differenziazio­ne, appaiono prevalenti le forme ben diffe­renziate, ad eccezione del tipo misto, nel quale prevalgono quelle sigillocellulari. Queste ultime sono state ricondotte ai di­versi istotipi per mezzo della valutazione istochimica del contenuto mucinico, che ri­sultava ora di un solo tipo (neutro o acido), ora di più tipi combinati, come nelle forme miste.

La positività per i 4 marker esaminati, pur non presentando correlazioni significative, appare tendenzialmente più alta nelle forme ben differenziate, con l'unica eccezione del CEA che risulta positivo in oltre 1'80% dei carcinomi sigillocellulari.

Nella tab. II è riportata la distribuzione dei 4 marker in rapporto alla localizzazione della neoplasia. Il CEA, positivo in 51 casi, non presenta alcun apparente rapporto con la sede della neoplasia, mentre chiara predi­lezione per la regione antropilorica è dimo­strata dalle neoplasie positive per L YS, AATeACT.

In rapporto all'istotipo, il CEA è presente in tutti i carcinomi di tipo misto e nella larga maggioranza di quelli di tipo intestinale. Il L YS, a sua volta, appare più frequente nei carcinomi di tipo mucocellulare e di tipo misto, mentre l'ACT prevale nettamente in

Differenziazione

antro p i loro ben dit'f. scars. diff. sigillocell. 6 3 7 3 5

13 2 12 6 8 lO 2 8 7 3 3 3 l 2 12

32 lO 28 18 28

Tab. II. Positività immunoistochimica per CEA, L YS, AA T, ACT in rapporto alla localizzazione del carcino-ma.

Sede del Totale Numero dei casi positivi tumore casi CEA LYS AAT ACT

Cardias 4 4 l Corpo 18 14 l 2 6 Angulus 10 6 5 l 2 Antro 32 20 15 11 17 Piloro 10 7 4 3 6

Totale 74 51 26 17 32

quelli di tipo misto e di tipo pilorocardiale. L'AAT presenta in assoluto le percentuali più basse di positività e non ha significative correlazioni con l'istotipo neoplastico (tab . III).

I 4 marker si presentano variamente com-

Tab. III. Positività immunoistochimica per CEA, L YS, AA T , ACT in rapporto all'istotipo del carcinoma.

Istotipo Totale Numero dei casi positivi casi CEA LYS AAT ACT

MC 15 4 (27%) 8(53%) 3(30%) 3(20%) re 26 22(85%) 7 (27%) 5 (19%)10 (38%) PC 18 lO (56%) 4(22%) 6(33%)10(56%) MISTO 15 15(100%) 7(47%) 3(20%) 9 (60%)

Totale 74 51 (69%) 26 (35 %) 17 (23 % )32 ( 43%)

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binati nelle singole neoplasie: il 44% è posi­tivo per più di un marker; il 18% per tutti e quattro. In quest'ultimo caso la maggioran­za è rappresentata da adenocarcinomi ben differenziati.

Dei casi positivi per un solo marker, ben il 27% dimostra positività per il CEA. L'im­munoreattività per il CEA presenta una lo­calizzazione citoplasmatica variabile a se­conda del grado di differenziazione rieopla­stica: all'apice cellulare, delimitante il lume ghiandolare, negli adenocarcinomi ben dif­ferenziati; in forma diffusa o con alone cito­plasmatico periferico nei carcinomi scarsa­mente differenziati e nei sigillocellulari (Fig. 1).

Fig. 1. Carcinoma di tipo intestinale, sigillocellulare. Cellule neoplastiche intensamente positive per il CEA, distribuite tra preesistenti strutture ghiandolari negati­ve alla reazione immunoistochimica (P AP x 250).

L YS, AA T e ACT presentano invece una reattività di tipo granulare nel citoplasma sopranucleare nelle neoplasie ben differen­ziate; diffusa in tutto il citoplasma nei carci­nomi scarsamente differenziati e nei sigillo­cellulari (Fig. 2-3).

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Fig. 2. Carcinoma di tipo mucocellulare, ben differen­ziato. Reattività per illisozima di tipo granulare in sede sopra nucleare (P AP x 560).

Fig. 3. Carcinoma di tipo misto, sigillocellulare. Positi­vità citoplasmatica uniforme o finemente granulare della reazione immunoistochimica per l'ACT (PAP x 560).

Dall'analisi del rapporto tra positività per i diversi marker e tipo di mucine elaborate dalle cellule neoplastiche appare una signi­ficativa correlazione tra presenza di CEA e

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mucine acide e tra presenza di LYS e AAT e mucine neutre. L'ACT invece, pur prevalen­do nelle forme con sole mucine neutre, è talora reperibile anche in quelle con sole mucine acide (tab. IV).

Tab. IV. Positività immunoistochimica per CEA, L YS, AA T, ACT e tipo di mucine elaborate dal carcinoma.

W casi Tipo di mucine CEA LYS AATACT

20 neutre 5 8 5 7 sialomucine N-acetilate l l l

19 neutre, sialomucine N-acetilate 14 4 4 5

2 sialomucine N-acetilate, solfomucine 2

8 neutre, sialomucine N-acetilate, solfomucine 6 6 2 4

l. neutre, sialomucine N- ed 0-acetilate

3 sialomucine N- ed 0-acetilate, solfomucine 3

20 neutre, sialomucine N- ed 0 -acetilate, solfomucine 19 3 6 14

Relativamente alla prognosi, la sopravvi­venza a 5 anni è al momento valutabile in 40 casi ed è pari a 30 casi (75% ); nei 10 pazienti deceduti, il carcinoma era intramucoso in 7 ed esteso alla sottomucosa in 3. Consideran­do l'istotipo ed il grado di differenziazione, non sono state rilevate differenze prognosti­che significative, anche se una prognosi ve­rosimilmente peggiore sembra p·oter essere ascritta al carcinoma di tipo misto, che ha presentato una mortalità del36%. Analoga­mente, non sono state rilevate differenze prognostiche significative tra neoplasie po­sitive o negative per CEA, AAT e ACT. Significativa invece (P < O, 05), pur nell'esi­guità della casistica, è la diversa sopravvi­venza presentata dal carcinoma gastrico precoce in rapporto alla ricerca del L YS: i casi L YS-negativi hanno dimostrato infatti una sopravvivenza a 5 anni dell '88%, che scende al 53% nei casi L YS-positivi.

Carcinom a gastrico precoce

Discussione

È stato precedentemente dimostrato co­me nel carcinoma gastrico avanzato la posi­tività immunoistochimica per L YS, AA T e ACT differisca a seconda della sede di origi­ne della neoplasia e come questo profilo immunoistochimico rifletta in parte la distri­buzione dei tre marker nell'epitelio gastrico normale (10). In contrasto con questo risul­tato, Tahara et al. .(23) e più recentemente Wittekind et al. (25) hanno segnalato nel carcinoma del corpo gastrico la presenza di numerose cellule neoplastiche positive per AAT e ACT, marker normalmente assenti in questa sede.

Nel presente studio la positività dei quat­tro marker esaminati è apparsa indipenden­te dalla sede di origine della neoplasia, con l'unica eccezione forse della regione antro­pilorica, che sembra essere più spesso inte­ressata dalle neoplasie positive per L YS, AATeACT.

Nielsen e Teglbjoerg (16), nei loro studi sulla distribuzione immunoistochimica del CEA nel carcinoma gastrico, classificato se­condo lo schema di Mulligan (15), hanno dimostrato una significativa correlazione tra carcinoma di tipo intestinale e positività al CEA. Ciò trova conferma nella nostra ricer­ca, dove il CEA, presente nella totalità dei carcinomi di tipo misto, è risultato espresso nella larga maggioranza dei carcinomi di tipo intestinale. Il L YS, a sua volta, è sempre stato più frequente nei carcinomi di tipo mucocellulare e di tipo misto, mentre l'ACT è prevalso nettamente in quelli di tipo misto ed in quelli di tipo pilorocardiale. L' AA T non ha mostrato correlazioni con alcun isto­tipo neoplastico.

Relativamente al grado di differenziazio­ne, in analogia con l'osservazione di Tahara et al. (23) che la presenza immunoistochimi­ca dell 'AA T nel carcinoma gastrico può es­sere usata come marker tessutale della for­ma ben differenziata, il nostro studio ha dimostrato che la percentuale di positività per tutti i quattro marker esaminati è ten­denzialmente più alta nelle forme ben diffe­renziate; unica eccezione il CEA, che predi­lige, in percentuale superiore all 'SO%, i car-

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cinomi sigillocellulari. Analoga elevata posi­tività per il CEA nei carcinomi gastrici sigil­locellulari era stata descritta da Wittekind et al. (25) e da Mori et al. (14). Anche nelle neoplasie con simultanea produzione di L YS, CEA, AA T, ACT, le forme ben diffe­renziate risultano le più frequenti. Questo dato, mentre da un lato conferma la presen­za contemporanea dell'AAT e dell'ACT ne­gli adenocarcinomi gastrici ben differenziati osservata da Tahara et al. (23), contrasta con quanto da loro precedentemente soste­nuto: che il carcinoma gastrico scarsamente differenziato esprimerebbe con maggior fre­quenza più marker associati (21).

La positività immunoistochimica per il CEA, per il LYS e per l'AAT sembra avere una stretta correlazione col tipo di mucine elaborate dalle cellule neoplastiche (3, 17, 22). Infatti il CEA si ritrova significativa­mente associato a carcinomi con ricca com­ponente mucinica acida, ed in particolar modo a sialomucine-0-acetilate e solfomu­cine, piuttosto che a carcinomi producenti solo mucine neutre. Il LYS e l'AAT sono invece sempre assenti quando il carcinoma secerne mucine acide, mentre sono intensa­mente positivi quando le cellule neoplasti­che producono o solo mucine neutre o muci­ne neutre ed acide associate. L'ACT infine non sembra essere correlabile con alcun tipo di mucine.

La presenza di inibitori di proteasi come l'AAT e l'ACT, di LYS e di CEA nelle cellule del carcinoma gastrico solleva il pro­blema di loro possibili relazioni con la diffu­sione metastatica ed in generale con la pro­gnQsi.

E stato riportato recentemente (23) che la prognosi dei carcinomi gastrici avanzati po­sitivi all'AAT sembra peggiore di quella dei carcinomi AAT-negativi. Wittekind et al. (25) sostengono invece che i carcinomi ga­strici avanzati AAT-positivi hanno prognosi migliore dei carcinomi AA T -negativi. Per gli stessi AA., peraltro, la positività immunoi­stochimica per il CEA, l'ACT ed il L YS non dimostra correlazioni significative con la so­prawivenza.

Kojima et al. (11), in uno studio condotto su 162 carcinomi gastrici avanzati, hanno

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trovato invece che la soprawivenza a 5 anni era notevolmente ridotta nelle forme positi­ve al CEA rispetto alle negative. Inoltre, un follow-up condotto da Tahara et al. (22) su 27 carcinomi gastrici avanzati ha mostrato che la soprawivenza è ridotta a meno di due anni per i carcinomi che producono lisozi­ma.

Nel nostro studio il follow-up a 5 anni condotto su 40 casi di carcinoma gastrico precoce non ha rivelato differenze progno­stiche significative tra tumori positivi e tu­mori negativi per CEA, AA T ed ACT, né tanto meno tra i diversi istotipi ed i gradi di differenziazione neoplastica.

La differenza è invece risultata statistica­mente significativa (P < O, 05) confrontan­do la soprawivenza di 15 pazienti affetti da carcinoma lisozima-positivo con quella di 25 pazienti con carcinoma lisozima-negativo: nei primi la soprawivenza era del 53%, mentre nei secondi saliva all'88%. Così co­me sostenuto da Tahara et al. (22) per il carcinoma gastrico avanzato, anche il carci­noma gastrico precoce sembra avere pertan­to una prognosi peggiore quando produce lisozima.

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Corrispondenza

Prof. Carmela De Gaetani Istituto di Anatomia Patologica Policlinico Universitario Largo del Pozzo 71 Tel. 059/364210 41100 Modena (MO)

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