APPROCCIO PROTEOMICO ALLO

STUDIO DELL’INFERTILITÀ

Dottoranda: Elisa Giacomini

Tutore: Prof. Giuseppe Ricci

XXIV Ciclo di Dottorato in Medicina Materno Infantile, Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia.

INFERTILITÀ: Incapacità di una coppia di concepire dopo dodici mesi

di rapporti non protetti avvenuti durante il periodo ovulatorio.

CAUSE FEMMINILI:• fattore endocrino/ovulatorio• fattore tubarico • fattore endometriale • fattore cervicale • fattore immunologico

CAUSE MASCHILI:• alterazioni dei parametri del liquido seminale

(alterazione della concentrazione: oligozoospermia)

(alterazione della motilità: astenozoospermia)• anomalie del tratto riproduttivo •cause acquisite come quelle dovute ad un trauma

FATTORE FEMMINILE & MASCHILE

O

ALCUN FATTORE CAUSA DI INFERTILITÁ

INTRODUZIONE

Individuare ed identificare proteine differenzialmente espresse nel plasma seminale di pazienti oligo/astenozoospermici e nel plasma seminale di pazienti normozoospermici.

PRIMO OBIETTIVO

Liquido seminale

Plasma seminale

Spermatozoi

1

2Ogni campione di plasma seminale appartenente a ciascun gruppo viene

analizzato mediante elettroforesi bidimensionale.Gel 2DE di pz normozoospermici Gel 2DE di pz oligo/astenozoospermici

3

I gel dei due gruppi di campioni vengono analizzati dal programma

“Ludesi Redfin Solo” in modo da individuare gli spot differenzialmente

espressi, che verranno pertanto analizzati mediante spettrometria di

massa per identificare le proteine a cui corrispondono.

SECONDO OBIETTIVO

Analizzare i fluidi follicolari per individuare delle proteine, che riflettano la maturità e la fecondabilità degli ovociti allo scopo di migliorare le percentuali di successo delle tecniche di fecondazione assistita.

1Durante il prelievo degli ovociti viene raccolto il fluido follicolare del primo follicolo

purchè contenga l’ovocita e sia privo di contaminazioni, quali sangue e cellule

(queste ultime vengono eliminate mediante centrifugazione).

2I fluidi follicolari vengono divisi in diversi gruppi di campioni, in base alle caratteristiche

dell’ovocita che contenevano. I diversi gruppi vengono opportunamente messi a

confronto ed i fluidi follicolari vengono analizzati mediante elettroforesi bidimensionale.

3Individuati gli spot differenzialmente espressi nei gel dei gruppi messi a confronto,

si procede all’identificazione delle proteine di cui sono formati mediante

spettrometria di massa.

Fluido follicolare contenente un ovocita

immaturo GV o M1

Fluido follicolarecontenete un ovocita

maturo M2

GRUPPI CONFRONTATI

Possiamo seguire il “percorso” di ogni singolo ovocita maturo M2

Fluido follicolaredi un ovocita M2 che

si è FERTILIZZATO

Fluido follicolaredi un ovocita M2 che

NON si è FERTILIZZATO

Tra i fertilizzati ci sono ovociti che daranno origine ad embrioni di qualità migliore o scarsa

Fluido follicolaredi un ovocita fertilizzato

che ha originato un embrione di I o II grado

Fluido follicolaredi un ovocita fertilizzato

che ha originato un embrione di

III, IV o V grado

Inoltre potrebbe essere possibile effettuare un ulteriore confronto tra fluidi follicolari da cui

si sono sviluppati embrioni che hanno portato o meno ad una gravidanza.

RISULTATI PRELIMINARI

10 Campioni di plasmi seminali di soggetti Normozoospermici (N) e 10 Campioni di plasmi

seminali di soggetti Oligo/Astenozoospermici (O/A) sono stati analizzati mediante elettroforesi

bidimensionale.

Es.: Analisi di un campione N Es.: Analisi di un campione O/A

Grazie al software “Ludesi Redfin Solo” vengono individuate le differenze nei due gruppi di campioni.

N O/A Statistical test AnovaApplied filters Anova < 0,05

ID 515Anova 2.234e-4Fold 2.38Presence 90 %Volume 114

PROSPETTIVE FUTURE

Individuare ed identificare proteine differenzialmente espresse nel plasma seminale di pazienti oligo/astenozoospermici e nel plasma seminale di pazienti normozoospermici.

Analizzare i fluidi follicolari per individuare delle proteine, che riflettano la maturità e la fecondabilità degli ovociti allo scopo di migliorare le percentuali di successo delle tecniche di fecondazione assistita.

Completare l’analisi col software e identificare gli spot mediante spettrometria di massa

Aumentare il numero di campioni raccolti ed iniziare con l’analisi

Analizzare mediante elettroforesi bidimensionale e successiva spettrometria di massa i liquidi seminali di soggetti che sottoposti ad un primo ciclo di IVF (in vitro fertilization) hanno fertilizzato gli ovociti e confrontarli coi liquidi seminali di soggetti che non hanno fecondato gli ovociti.