ANTIBIOTICO-RESISTENZA I meccanismi con cui i batteri ...

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Fino a poco tempo fa l’insorgenza della farmaco-resistenzabatterica era attribuita unicamente a meccanismi ben co-nosciuti di trasferimento intercellulare di materiale genetico

di tipo verticale (mutazioni) od orizzontale (trasformazione, tra-sduzione, coniugazione). Poco si sapeva sull’impatto che la mo-lecola chemio-antibiotica aveva sulla fisiologia della cellula bat-terica, ad eccezione della modalità con cui essa agiva sulla suariproduzione. Negli ultimi anni, invece è emerso un concettoestremamente interessante: il fenomeno della farmaco-resistenzanon può essere spiegato solo con la pressione selettiva esercitatadalla molecola “antibiotica” sulla popolazione batterica, che de-terminerebbe quindi la selezione degli stipiti in possesso di carat-teristiche genetiche tali da renderli resistenti all’azione antimi-crobica; a ciò si affiancherebbero una serie di fenomeni chevedono la molecola chemio-antibiotica direttamente responsabiledi cambiamenti fisiologici della cellula batterica. Ci sono diversecondizioni in cui è possibile riconoscere questo fenomeno le qualisono inquadrabili all’interno di due processi biologici definiti: ri-dondanza molecolare e infedeltà molecolare [15].Con questo articolo passeremo in rassegna i meccanismi allabase della resistenza agli antimicrobici, trattando dapprimaquelli più comuni e noti e quindi descrivendo le teorie piùmoderne e suggestive.

Meccanismi di azione degli antimicrobici

Facilitate dalla loro rapida crescita, le popolazioni battericheevolvono in tempi brevi, adattandosi a situazioni avverse,quali la presenza di agenti antimicrobici. Tali composti, chepossono esercitare un’attività batteriostatica o battericida,agiscono seguendo cinque meccanismi [20]:- inibizione della sintesi della parete cellulare (agenti battericidi);- alterazione delle subunità ribosomiali 30s e 50s, che risultain una sospensione o modificazione della sintesi proteica(agenti batteriostatici);

- legame del farmaco alla subunità 30s e conseguente inibi-zione o alterazione della sintesi proteica (agenti battericidi);- modificazione del metabolismo degli acidi nucleici (agentibattericidi);- azione sul metabolismo generale del germe (agenti batteriostatici,ma che possono diventare battericidi in alcune circostanze).Inoltre, alcuni nuovi composti interferiscono con il potenzialeelettrico della cellula, portando alla sua depolarizzazione emorte [24].La suddivisione in farmaci batteriostatici e battericidi è in uncerto senso artificiale, visto che in determinate situazioni(dosi di principio attivo 4-5 volte superiore alla MIC, minimaconcentrazione inibente) o per certi patogeni, i composti bat-teriostatici esercitano un’attività battericida, mentre a basseconcentrazioni in relazione alla MIC gli agenti battericidihanno solo un’azione batteriostatica.L’intensità dell’effetto inibitorio per alcuni farmaci è soprattuttoin relazione alla durata di esposizione del germe allo stesso,per altri è più che altro in funzione della concentrazione diprincipio attivo a cui il patogeno viene sottoposto, sebbene lamaggior parte dei composti agiscano considerando entrambequeste variabili. La resistenza agli antibiotici può essere in-trinseca (naturale) o acquisita. Nel primo caso si parla di man-cata suscettibilità ed è una caratteristica di alcune specie bat-teriche i cui membri sono tutti resistenti a un particolarefarmaco, o perché mancano del meccanismo cellulare verso ilquale il composto esercita la propria azione o la loro paretecellulare è impermeabile al farmaco stesso. Nel secondo casoinvece, la resistenza origina da mutazioni cromosomiche odall’acquisizione di materiale genetico trasferibile già presentein popolazioni batteriche correlate o meno a quella ricevente.

Resistenza cromosomica

Questo fenomeno deriva da mutazioni della sequenza nu-

I meccanismi con cui i batteriresistono agli antimicrobici

ANTIBIOTICO-RESISTENZA

Numero 2 - Luglio 2014

VALENTINA CAMBIOTTI1, PAOLA ROMAGNOLI2, ANTONIO SORICE2, PAOLA SECHI1, BENIAMINO CENCI GOGA1

1Master Sanità Pubblica Veterinaria e Igiene degli Alimenti2Società Italiana di Medicina Veterinaria Preventiva

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cleotidica del cromosoma batterico risultanti nella sintesi diproteine che differiscono da quelle originali in maniera suffi-ciente a interferire con l’attività degli antibiotici. Le mutazionisi possono verificare in qualsiasi momento, indipendente-mente dalla presenza di agenti antimicrobici, ma generalmentevengono perse o “riparate” da meccanismi cellulari; la lorodiffusione avviene durante la moltiplicazione batterica (tra-sferimento verticale). La resistenza cromosomica risulta utileai germi solo quando gli antibiotici vengono usati, costituendoun mezzo di selezione naturale nei confronti dei ceppi sensibilie il suo sviluppo è un processo graduale, di solito dovuto adiverse mutazioni successive. I mutanti resistenti emergonocon maggior frequenza in vitro piuttosto che in vivo, proba-bilmente perché le mutazioni di questo tipo sono associatead altre modificazioni cellulari svantaggiose per i batteri,tanto che generalmente il numero di mutanti diminuisce inseguito alla sospensione del trattamento. Per questo motivoil fenomeno della resistenza cromosomica è ritenuto di minorimportanza rispetto a quello della resistenza trasferibile.

Resistenza trasferibile

Certi geni batterici sono in grado di spostarsi tra DNA cro-mosomiale ed extra-cromosomiale, tra batteri della stessaspecie, o di specie e generi diversi (trasferimento orizzontale).I veicoli più importanti di questo movimento di geni sono:plasmidi, trasposoni e integroni. In virtù della loro mobilità

tali elementi hanno maggiore possibilità di persistere anchein assenza di pressione selettiva da parte degli antibiotici, ri-spetto alla resistenza cromosomica.

Plasmidi

I plasmidi sono molecole circolari di DNA extra-cromoso-miale che sono in grado di replicare in maniera autonoma,indipendentemente dal cromosoma batterico e trasportanogeni importanti per la riproduzione del batterio, il suo meta-bolismo, la resistenza ad antibiotici e virus batteriofagi, seb-bene non siano necessari alla sopravvivenza del germe se nonin particolari condizioni. Inoltre, tutti i plasmidi contengonouna o più zone di origine della replicazione (ori) e in alcunicasi, i geni che consentono il loro trasferimento tra batteri(plasmidi coniugativi), mentre gli elementi che non li possie-dono possono soltanto essere co-trasferiti (plasmidi non-co-niugativi). Alcuni plasmidi si replicano in una vasta gammadi specie batteriche, mentre altri hanno uno spettro d’ospiteristretto. Gli R-plasmidi contengono i geni di resistenza euno di questi può codificare per la resistenza a più di dieciantibiotici. Il fattore R conferisce ai batteri dei generi: Sta-phylococcus, Escherichia, Klebsiella, Aerobacter, Proteus eShigella resistenza multipla nei confronti di: sulfamidici, te-traciclina, cloramfenicolo, streptomicina, penicillina, kana-micina e altri antimicrobici. Tale fattore è un plasmide checontiene ori e i geni di resistenza (elementi R) oltre all’attitu-

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dine alla coniugazione (TF, transfer factor). Tuttavia, l’ele-mento citoplasmatico R può sussistere anche senza l’elementoTF, come avviene negli stafilococchi. Diversamente dalle mu-tazioni cromosomiali gli R-plasmidi conferiscono resistenzaa livelli terapeutici di antibiotici in un unico passaggio.

Trasposoni

I trasposoni (geni saltatori) sono delle corte sequenze di DNAche possono spostarsi da un plasmide a un altro, tra plasmidie cromosoma batterico o tra plasmidi e batteriofagi (virusbatterici), ma non sono in grado di replicarsi in maniera au-tonoma. Le sequenze IS (insertion sequences) costituiscono ilmodello più semplice di trasposone; tali elementi sono rap-presentati da porzioni di DNA della lunghezza massima di 2kb codificanti l’enzima trasposasi, necessario per lo sposta-mento da una posizione a un’altra del DNA. Alle estremitàdelle IS di solito ci sono delle corte sequenze ripetute e inver-tite di circa venti nucleotidi importanti per la localizzazionee l’inserimento nel DNA target. Durante la trasposizione unaporzione target viene duplicata, creando una corta sequenzaripetuta diretta su ciascuna estremità dell’elemento IS dinuovo inserimento. Nel caso in cui sequenze IS siano piuttostovicine tra di loro si può verificare la trasposizione dell’interazona interposta tra le due. Il meccanismo di selezione delDNA target non è noto; in alcune circostanze sembrano pre-ferire regioni ricche di A/T, altre volte il processo avviene in-discriminatamente. I veri trasposoni sono più lunghi di 2kbe contengono anche geni che conferiscono resistenza ad anti-biotici o metalli pesanti, virulenza, capacità di produrre eso-tossine. Esiste poi un particolare gruppo di trasposoni (re-tro-trasposoni) che si integrano mediante un meccanismoanalogo a quello dei retrovirus; tale processo richiede la tra-scrizione di un intermedio a RNA, la retrotrascrizione a DNAe lo spostamento del nuovo elemento nel genoma dell’ospite.I retrotrasposoni sono dotati di sequenze ripetute dirette alleestremità analoghe agli LTR retrovirali. I trasposoni dei bat-teri Gram- non sono coniugativi, mentre quelli dei Gram+ eBacterioides spp. possono esserlo o meno. Tuttavia, se untrasposone di un batterio Gram- è parte del DNA di plasmidiconiugativi, il trasferimento orizzontale è possibile. I plasmidiacquisiscono facilmente trasposoni e spesso alcuni di questivengono raggruppati all’interno dello stesso plasmide, con-ferendo determinanti di resistenza multipla con un singoloprocesso di coniugazione [1]. Tali spostamenti genetici con-sentono uno sviluppo rapido di resistenza in diverse popola-zioni batteriche. L’espressione dei geni localizzati sui traspo-soni può richiedere la presenza dell’antibiotico/i in questione,il quale è anche in grado di promuoverne il trasferimento, inquanto i determinanti di resistenza risultano vantaggiosi peri germi che li possiedono.

Ricombinazione

Il trasferimento orizzontale di geni (ricombinazione) può av-

venire tra il genoma di due cellule batteriche o tra il genomadi una cellula batterica e un elemento extra- cromosomico.Tra i batteri, i geni si trasmettono da un donatore a un rice-vente attraverso lo scambio di porzioni di DNA. I frammentidi DNA nel ricevente si possono allineare con il segmentocromosomico corrispondente e ricombinarsi per rottura delcromosoma dell’ospite, che perde il suo segmento e accettaquello del donatore. Sebbene i due frammenti siano omologhiper funzione, l’acquisizione del nuovo può tradursi nell’espres-sione di un diverso fenotipo nel ricevente. Tre sono i mecca-nismi noti di trasferimento: trasformazione, trasduzione econiugazione.

Trasformazione

La maggior parte dei batteri non è in grado di utilizzareDNA esogeno proveniente dall’ambiente il quale, una voltainternalizzato nel germe, viene prontamente degradato da-gli enzimi nucleasi. Tuttavia, alcuni generi come Strepto-coccus, Bacillus, Haemophilus e Neisseria sono dispostiad acquisire frammenti di DNA proveniente da specie cor-relate attraverso la parete cellulare. Tale competenza risultainoltre legata a particolari fasi di crescita dei batteri, comela fase log o la sporulazione nel genere Bacillus. I micror-ganismi che non sono “naturalmente competenti” per latrasformazione possono diventarlo se sottoposti a tratta-menti chimico-fisici che permeabilizzano la parete cellulare,quali: lo shock termico (alternanza di incubazioni a 4 e 42 °C in presenza di ioni calcio ecc.) e lo shock elettrico.La comparsa di porzioni di materiale genetico nell’am-biente può derivare dalla lisi di altri germi; infatti allamorte di una cellula non necessariamente consegue la di-struzione del suo DNA, che viene rilasciato nel mezzo cir-costante. Il ricevente adsorbe frammenti di acidi nucleiciliberi, che vengono poi trasportati nel citoplasma, dove ri-combinano con un segmento omologo e possono venireincorporati nel genoma dell’ospite. Se il DNA che entranella cellula non è correlato a quello cromosomico l’as-senza di omologia impedisce la ricombinazione e il mate-riale estraneo viene degradato. Il fenomeno della trasfor-mazione è stato dimostrato grazie a un esperimento [13]che consisteva nell’estrarre il DNA da un ceppo capsulato(virulento) di pneumococco e metterlo a contatto con unceppo non capsulato (non virulento) dello stesso germe. Iltrasferimento dei geni di virulenza ai germi acapsulati, haconferito loro la capacità di sintetizzare la capsula ren-dendoli patogeni. Questo esperimento e altri successivihanno dimostrato l’importanza di tale meccanismo nelloscambio di geni tra batteri.

Trasduzione

La trasduzione è un processo di trasferimento genetico mediatoda batteriofagi: virus che infettano i batteri e si dicono virulenti,se si moltiplicano e abbandonano la cellula causandone la lisi



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(ciclo litico) e temperati, se si integrano con il genoma dell’ospitesenza necessariamente lisare subito il germe (ciclo lisogeno).Alcuni fagi hanno il genoma a DNA, altri a RNA, ma soloquelli a DNA double strand sono trasducenti. Durante la repli-cazione di un fago, tratti di DNA genomico o plasmidico pos-sono venire incorporati nella particella virale e passare così auna cellula ricevente; se il DNA trasdotto è cromosomico, puòricombinarsi con quello dell’ospite e integrarvisi, se invece èplasmidico può replicarsi ed essere espresso direttamente. Inquesti casi si parla di trasduzione generalizzata in quanto qual-siasi gene batterico può essere incorporato nel fago e tutti i fagisono difettivi perché un segmento del loro corredo genetico èstato sostituito da genoma batterico e tale deficit impedisceloro di svolgere un ciclo replicativo completo.La trasduzione ristretta invece è tipica dei fagi temperati, iquali si integrano in un punto preciso del genoma e replicanostabilmente nel cromosoma batterico (profagi), rimanendoin una fase di latenza. In seguito all’escissione dal genomadel germe, il DNA del fago può replicarsi ed entrare nel ciclolitico; nel caso in cui questo processo non si svolga perfetta-mente vengono asportate parti di DNA batterico e lasciatein situ porzioni virali dando vita a fagi difettivi che traspor-tano geni del donatore a batteri riceventi. In alcune circo-stanze la presenza di un profago e l’espressione di alcuni genivirali sono alterazioni costanti di determinati ceppi batterici;allora si parla di “conversione fagica”; ad esempio l’infezionedi Clostridium botulinum tipo C con il fago CE gli conferiscela capacità di produrre la tossina botulinica.

Coniugazione

La coniugazione consiste nell’unione di due batteri tramiteun ponte attraverso il quale il donatore trasferisce materialegenetico direttamente al ricevente. La cellula donatrice devepossedere un plasmide (fattore F) che codifica per la sintesidel sex pilus, un’appendice di natura proteica che consente iltrasferimento dei geni. Tale plasmide può permanere nel ci-toplasma come elemento libero, che si replica autonomamenteo integrarsi nel cromosoma batterico e replicarsi insieme aquest’ultimo (episoma).Di conseguenza si creano situazioni diverse:- I donatori F+ hanno il plasmide libero nel citoplasma e lotrasmettono ai riceventi F-. In uno dei due segmenti di DNAplasmidico si forma un nick (rottura dell’elica) e l’estremitàlibera passa al ricevente, replicandosi durante il trasferimento.Se il plasmide contiene altri geni oltre quelli per la coniuga-zione li trasferisce facilmente agli altri batteri.- I donatori Hfr (High frequency of recombination) hanno ilplasmide integrato nel cromosoma. Quindi, la duplicazionedel genoma del donatore inizia da una posizione adiacente alpunto d’integrazione del plasmide trasferendo buona partedel genoma al ricevente; il fattore F tuttavia, è sempre l’ultimaporzione prevista per il trasferimento e difficilmente riesce apassare al ricevente, dove quindi i geni si integrano nel cro-mosoma, ma non possono essere passati ad altri germi.

I donatori F in cui il fattore F integrato viene escisso e tornalibero nel citoplasma, possono trasportare geni batterici in-corporati nel plasmide durante la separazione, i quali si re-plicano insieme al fattore F e passano al germe ricevente incaso di coniugazione.Lo scambio di materiale genetico mediante coniugazione sem-bra essere favorito in particolari condizioni, quali la forma-zione di biofilm, soprattutto se i germi presenti al suo internosono sottoposti a dosi non letali di antibiotici [16].

Altri meccanismi di resistenza

Gli antibiotici agiscono in maniera specifica, tanto da poter pre-servare alcune attività metaboliche che non costituiscono il ber-saglio del farmaco, ma possono essere coinvolte nel trasferimentodi geni tra microrganismi. Tali vie in alcuni casi, non solo con-tinuano a funzionare in presenza dell’antimicrobico, ma vengonoanche potenziate. Inoltre, i chemioterapici sono in grado di pro-muovere il trasferimento genetico che avviene con il meccanismodella trasformazione. Alcuni farmaci aumentano il tasso di mu-tazione, incentivando l’acquisizione di resistenza cromosomica.Rappresentando un elemento di selezione, che induce un cam-biamento dello stato fisiologico cellulare, l’antibiotico può faci-litare l’insorgenza di resistenza fenotipica verso questo e altrifarmaci. I principi attivi attuali quindi, hanno sette effetti sul-l’evoluzione della resistenza e della virulenza che andrebberoconsiderati nello sviluppo di nuovi farmaci ed evitati.Tali fenomeni vengono raggruppati in due categorie: ridon-danza molecolare e infedeltà molecolare in base alla facoltàdella molecola di indurre cambiamenti nello stato fisiologicodella cellula oppure di influenzarne la frequenza di ricombi-nazione e mutazione [14; 15].

Ridondanza molecolareGli antibiotici sono dei ligandi per i loro bersagli molecolarie vi si uniscono con la stessa specificità degli ormoni verso ipropri recettori, svolgendo anche funzioni simili. Gli ormoniinfatti, sono delle molecole segnale che influenzano l’espres-sione genica o la fisiologia cellulare. Allo stesso modo, i se-gnali antibiotico-mediati attivano il trasferimento orizzontaledi geni o alcuni meccanismi cellulari.

• Trasferimento genetico antibiotico-indottoLa trasmissione di alcuni trasposoni coniugativi è antibio-tico-mediata. ad esempio la tetraciclina stimola la trasmissionedi un trasposone proprio di Bacterioides di 100-1.000 volte;anche il trasposone Tn925 appartenente ai batteri Gram+ ri-sponde alla presenza della tetraciclina venendo trasmesso abatteri sensibili da 5 a 100 volte più frequentemente e codificaper la resistenza a quest’ultima. Il trasposone del Bacterioidestrasporta due geni: rteA e RteB omologhi a geni regolatorigià conosciuti.

• Resistenza multipla farmaco-indottaDiversi agenti ambientali inducono la trascrizione di geni che



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conferiscono fenotipi pleiotropici, inclusa la resistenza agliantimicrobici. Ad esempio il salicilato induce la trascrizionedell’operone mar che codifica per la multiresistenza. Il salici-lato può elevare la frequenza di resistenza simultanea a: te-traciclina, cloramfenicolo e acido nalidissico di 1 milione divolte grazie alla riduzione della concentrazione intracellularedei farmaci. Tra i geni controllati dal regulone (soxRS) re-dox-responsivo di E. coli ce ne sono alcuni sotto il controllodi marRAB e ulteriori meccanismi cellulari si intrecciano so-vrapponendosi e aumentando il numero di segnali ambientaliche possono mantenere il fenotipo di resistenza.

• Resistenza fenotipica antibiotico-indottaGli organismi si adattano a nuovi ambienti in seguito alla ri-cezione di segnali che inducano una modificazione degli statifisiologici. Tale processo si verifica quando il nuovo ambientenon è letale, altrimenti i germi muoiono prima di adattarsi;ad esempio l’esposizione di Pseudomonas aeruginosa allagentamicina per brevi periodi induce resistenza in quei pochibatteri che sopravvivono all’esposizione iniziale. Tali celluleesprimono resistenza anche ad altri agenti tossici quali: netil-micina, tobramicina, amikacina, isepamicina, neomicina, ka-namicina, streptomicina, polimixina ed EDTA. Sebbene ilmeccanismo di adattamento non sia conosciuto, sembra cheabbia a che fare con la via di ingresso del farmaco. La genta-

micina provoca uno stress o un segnale che promuove uncambiamento fisiologico cellulare analogo a quello causatodalla privazione di Mg2+; tale fenotipo è ereditabile e persisteper generazioni dopo che l’antibiotico è stato rimosso o ilMg2+ è stato restituito. Il fatto che sia un adattamento fisio-logico, piuttosto che mutazionale è dimostrato dalla manife-stazione del fenotipo in tutta la popolazione e dal suo pas-saggio uniforme alla progenie.

• Materiale genetico libero antibiotico-indottoIn vitro gli antibiotici aumentano la frequenza del trasferi-mento genetico riducendo la capacità della parete cellularedi fungere da barriera verso il rilascio e l’acquisizione diDNA o rendendo il microrganismo suscettibile alla fusionecon altri batteri e vescicole. I germi senza parete, o protoplasti,si lisano facilmente e rilasciano DNA in seguito a stress osmo-tico; antibiotici come i β-lattamici e la bleomicina creanoprotoplasti. Tali forme batteriche sono anche più suscettibilialla fusione con altre cellule o vescicole che si staccano dallamembrana cellulare, le quali vengono naturalmente prodottenei germi gram- e possono contenere plasmidi e fattori di vi-rulenza. In Pseudomonas la sintesi delle vescicole è stimolatadalla presenza di gentamicina. Gli antibiotici possono quindiindebolire la parete microbica e/o ridurre il numero di nucleasiperiplasmatiche.

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• Vettori antibiotico-indottiDi norma gli antibiotici inibiscono la divisione cellulare, mararamente bloccano i processi metabolici necessari all’acqui-sizione e distribuzione dei geni attraverso i plasmidi. Si parlaquindi di “vettori morti”, in quanto il farmaco impediscealla cellula di riprodursi o definitivamente (agenti battericidi)o solo in presenza dell’antimicrobico (agenti batteriostatici),ma rimane attivo il processo di coniugazione e i geni di resi-stenza possono essere scambiati anche per un lungo periododopo la morte del batterio donatore. Sebbene alcuni chemio-terapici inibiscano la coniugazione in certe circostanze, altrine stimolano la frequenza proteggendo il metabolismo speci-fico che la permette dall’azione di altri antibiotici o riducendole barriere allo scambio genetico.

Infedeltà molecolareVari meccanismi biochimici (ad esempio gli enzimi di restrizione),classificano il DNA come “self” o “non self” e risultano divitale importanza per prevenire mutazioni durante la replicazionedegli acidi nucleici. Gli enzimi di restrizione degradano i segmentiche hanno perduto uno o più dei propri gruppi metilici, chevengono posti su certe basi in un ordine preciso, a seconda dellasequenza; inoltre il DNA di nuova sintesi viene comparato conaltre sequenze della stessa cellula, per accertarne l’omologia; iframmenti che violano le regole dei legami a idrogeno tra nu-cleotidi o la geometria elicoidale degli acidi nucleici vengonoanch’essi eliminati. Allentare la rigidità di tali processi di con-trollo può risultare in un’evoluzione più rapida della resistenza.

• Stress continuo e antibioticiLo stress può rendere le cellule più recettive verso DNA pro-veniente dall’ambiente. Ad esempio, Corynebacterium glu-tamicum esposto al calore, etanolo o altri agenti denaturantile proteine, può ricevere DNA da altri germi in maniera 100-1.000 volte più efficiente e il cloramfenicolo potenzia ulte-riormente tale trasferimento. Probabilmente lo stress denaturagli enzimi che degradano il materiale genetico estraneo e l’an-tibiotico ne previene l’ulteriore sintesi, prolungando la per-missività del batterio verso gli acidi nucleici estranei.

• Mutagenesi antibiotico-stimolataGli antibiotici che causano danni al DNA elevano in manieradiretta la frequenza di mutazione; tuttavia, anche i farmaciche modificano la fedeltà della traduzione aumentano il tassodi mutazione dei germi. ad esempio, la produzione di mutantidi E. coli in colture dove è presente la streptomicina è mag-giore rispetto ad ambienti che ne sono privi. Una spiegazioneplausibile del fenomeno è data dalla produzione, per erroridi traduzione, di DNA-polimerasi errate ma funzionanti, in-clini a commettere errori durante la replicazione del genoma.

La selezione nello sviluppo e nel mantenimento di popolazioni batteriche antibiotico-resistenti

Un germe può essere resistente a tre o più classi di antibiotici

grazie a diversi meccanismi, generalmente codificati da geni dif-ferenti e questo fenomeno prende il nome di “multiresistenza”.La resistenza a differenti antibiotici mediante lo stesso meccani-smo è definita “cross-resistenza” e generalmente tali principiattivi appartengono tutti alla stessa classe di farmaci. La multiresistenza viene attribuita all’acquisizione di tra-sposoni, integroni, plasmidi e non viene persa facilmente,nemmeno quando tali antimicrobici non vengono usati perun lungo periodo di tempo. Una ragione di questo feno-meno può essere rappresentata dal fatto che il gene per-mane in seguito all’uso di altri farmaci a cui il determinanteè geneticamente correlato (co- selezione). Un’altra spiega-zione potrebbe essere che il gene non sia “contro-selezio-nato” in assenza dell’antibiotico. Infatti, qualsiasi mecca-nismo di resistenza è associato a un costo di adattamentoe le mutazioni che vengono fissate sono quelle compensa-torie che alleggeriscono tale costo, senza comprometterela resistenza verso gli antimicrobici. L’evoluzione di resi-stenza avviene in maniera rapida quando all’interno dellapopolazione si verificano diverse mutazioni o comunque,di largo effetto; viceversa l’adattamento procederà lenta-mente nel caso in cui le mutazioni siano poche o con uneffetto poco significativo [17]. Le basi molecolari della re-sistenza e le dosi di antibiotico a cui i germi vengono sot-toposti giocano un ruolo importante nel determinare mu-tazioni benefiche per i batteri. La selezione verso laresistenza se si utilizzano basse dosi di antibiotico, cheinibiscono solo parzialmente la crescita dei batteri sensibili,è debole e solo le mutazioni con un basso costo di adatta-mento provocano a chi le possiede un vantaggio nei con-fronti degli altri microrganismi. Se i germi vengono sotto-posti a dosi di farmaco tali da inibire la crescita di batterisensibili invece, qualsiasi mutazione che aumenti la resi-stenza sarà benefica, al di là del costo che comporta. Unaltro parametro importante da valutare è la struttura del-l’antibiotico in questione: se la flessibilità conformazionaledel farmaco è bassa, ogni mutazione che alteri la strutturadel sito di legame nella proteina bersaglio risulterà in unaumento di resistenza considerevole, mentre se tale flessi-bilità è alta, solo un piccolo gruppo di mutazioni che in-terferiscono direttamente con il legame farmaco-proteinaporterà un beneficio significativo al germe.Ogni mutazione è associata a un costo: la resistenza cromo-somica si acquisisce per alterazione della struttura, della fun-zione o dell’espressione di enzimi importanti per la fisiologiacellulare che possono quindi assolvere in maniera meno effi-ciente i propri compiti; mentre il trasporto dei plasmidi ag-giunge un carico metabolico alla cellula e può creare un con-flitto intragenomico tra i geni cromosomici e quelli deglielementi mobili. Tali costi di adattamento sono responsabilidella rigidità di selezione contro le mutanti resistenti in seguitoalla sospensione del trattamento. Il costo della resistenza cro-mosomica comunque, può variare largamente considerandomutazioni diverse che conferiscono resistenza verso un unicofarmaco oltre che nei confronti di antibiotici differenti. I bat-



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teri inoltre, possono adattarsi al costo della resistenza subendoe fissando delle mutazioni compensatorie che rimediano par-zialmente o totalmente ai danni causati dalla prima selezione,senza compromettere la resistenza. I meccanismi di questofenomeno possono essere diversi: la funzione dell’enzima al-terato può essere ristabilita grazie a nuove mutazioni intra oextra-genetiche; la perdita della funzione enzimatica può ve-nire controbilanciata dall’amplificazione genica, la quale au-menta la concentrazione di enzima nella cellula; la richiestadell’enzima bersaglio può essere alleviata dall’aumento del-l’espressione di proteine associate a vie metaboliche alterna-tive. Il tasso di adattamenti compensatori spesso differiscetra mutazioni che conferiscono resistenza allo stesso antibio-tico, questo perché mutazioni differenti hanno accesso a unnumero diverso di adattamenti compensatori: ad esempiotutti gli aminoacidi in una proteina danno un certo contributoalla stabilità termodinamica della sua struttura e circa il 20%delle mutazioni portano a un moderato aumento della stabi-lità, diversamente, solo pochi aminoacidi contribuiscono di-rettamente al dominio catalitico delle proteine, suggerendoun potenziale di adattamento assai più ristretto quando ilcosto di resistenza dipende da tali mutazioni.Un’altra soluzione al costo della resistenza è rappresentata dalla

reversione della mutazione, che tuttavia si verifica più raramenterispetto alla compensazione, probabilmente perché ci sono di-versi possibili adattamenti compensatori per ogni mutazionedi resistenza. Inoltre, una volta insorte le mutazioni di com-pensazione, la reversione sarebbe svantaggiosa in quanto, i be-nefici acquisiti sono effettivi solo in presenza della mutazioneche compensano. Le condizioni ambientali influenzano sia iltasso di mutazione, sia il costo di resistenza e le mutazionicompensatorie. Ad esempio in caso di trattamento con più diun farmaco, quando si verifica un’interazione di antagonismotra gli antibiotici (gli antimicrobici mascherano l’uno l’effettodell’altro), fissare una mutazione che conferisca resistenza a unsolo principio attivo porterà uno scarso beneficio, smascherandol’effetto inibitorio del secondo chemioterapico; diversamentein caso di interazione sinergica (gli antibiotici aggravano l’unol’effetto dell’altro), dove la resistenza verso un principio allevieràl’effetto inibitorio di un farmaco ed eliminerà la sinergia conl’altro. Al contrario, considerando le interazioni tra i costi dellemutazioni: rapporti di antagonismo (le mutazioni allevianol’una il costo dell’altra) promuovono l’evoluzione di resistenzamultipla riducendone i costi e sono le più diffuse, mentre il si-nergismo (le mutazioni aggravano l’una il costo dell’altra) con-trasta lo sviluppo di tale resistenza.

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Tuttavia, se i costi sono sinergici, compensare per il costo diresistenza a un antibiotico comporta anche l’eliminazionedel costo addizionale della resistenza multipla e avrà un largoeffetto, mentre se sono antagonisti compensare per uno diloro aggraverà l’altro, risultando in un basso tasso di adatta-mento. Il livello di antibiotici varia nello spazio e la migra-zione dei batteri in ambienti diversi può anch’essa influenzarel’evoluzione della resistenza in positivo o in negativo, anchese generalmente la promuove. Naturalmente la resistenza sidiffonde in aree in cui ci sia una forte selezione da antibiotici,soprattutto grazie al trasferimento orizzontale di geni; diver-samente la migrazione ostacola lo sviluppo di resistenza seporta alla competizione tra batteri sensibili e mutanti resistenticon una crescita stentata in ambienti liberi da antibiotici. Larelazione tra migrazione e resistenza comunque, differiscetra antibiotici e lo spostamento ha un effetto minore quandole mutazioni sono prontamente disponibili. Infatti, se l’ac-quisizione di mutazioni è un fattore limitante per l’evoluzionedi resistenza perché ci sono poche mutazioni, con scarso ef-fetto, la migrazione aumenterà l’evoluzione di resistenza; seinvece le mutazioni sono facili da ottenere, di largo effettoma costose, la migrazione in aree con popolazione battericasuscettibile ostacolerà l’evoluzione della resistenza. Inoltre,la migrazione di batteri sensibili può provocare la reversionedella resistenza in seguito alla cessazione dell’esposizione al-l’antibiotico, in dipendenza dal tasso di fissazione delle mu-tazioni.In conclusione, maggiore è il tasso di variazione ambientalesperimentato dai batteri, minore è la possibilità della resi-stenza di evolvere. Riguardo il rapporto tra concentrazionedi farmaco e resistenza, c’è un intervallo di dosaggio di anti-microbico all’interno del quale gli organismi con una sensi-bilità ridotta hanno un vantaggio rispetto agli altri [12].Drlica and Zhao [10] hanno definito questa MSW (finestradi mutazione selezione) da tre concentrazioni:- la MIC dello stipite selvaggio;- la concentrazione superiore alla MIC dello stipite selvaggiodove si riscontra una fase di plateau nell’uccisione del germedovuta alla sopravvivenza della sottopopolazione microbicameno suscettibile;- la concentrazione che uccide anche i batteri più resistenti(MPC).Concentrazioni di antimicrobici poste tra il valore MIC e MPCrisiedono nella finestra e favoriscono la selezione di mutantiresistenti e la perdita di efficacia del farmaco nel tempo. Ri-guardo la durata dell’esposizione agli antibiotici, dovrebbe es-sere abbastanza limitata da evitare l’eradicazione della popo-lazione suscettibile di germi, fenomeno che favorirebbe lacrescita dei batteri resistenti, privi di qualsiasi tipo di contro-selezione [6]. L’uso degli antibiotici influenza quindi la selezionedi meccanismi di resistenza batterica e poiché l’uomo condividealcuni patogeni con gli animali da reddito (dove possono cau-sare malattia o meno), si è frequentemente affermato che par-ticolari modelli di resistenza rinvenuti nei patogeni umani de-rivino dall’utilizzo di farmaci in Veterinaria.

È corretto ricondurre tutto all’uso e abuso degli antibiotici?

A questo proposito, l’impiego di antibiotici come promotori dicrescita in zootecnia è stato vietato in Europa [21]. Tuttavia, cisono autori che non ritengono l’uso di antibiotici negli animalida reddito un pericolo per la salute pubblica perché il suo ruolonella selezione o diffusione di ceppi resistenti è basso o nullo oche tali situazioni, se esistono, rappresentano un rischio minimoper la salute umana [5; 6; 21], mentre altri hanno una visionedifferente. Tale aperto dibattito riflette la difficoltà associataall’assegnazione di una relazione di causalità tra la mancatasuscettibilità alla terapia di patogeni umani e l’uso di antibioticinegli animali. Scoperte recenti supportano l’ipotesi che certiagenti antimicrobici possano contribuire alla prevalenza di re-sistenza mediata da plasmidi e cromosomica in batteri che in-fettano sia gli esseri umani che gli animali [26]. Il problema èche l’uso indiscriminato di farmaci negli animali risulti nel tra-sferimento di batteri resistenti e geni di resistenza ai patogeniumani. Tuttavia [25] hanno analizzato i cambiamenti nel ma-nifestarsi di resistenza in Salmonella Enteritidis e Typhimuriumottenuta da infezioni umane in Inghilterra e Galles (2000, 2002e 2004) mostrando che l’incidenza di ceppi di S. Enteritidis re-sistente all’acido nalidixico e alla ciprofloxacina era più cheraddoppiata tra il 2000 e il 2004, mentre i livelli complessivi diresistenza di S. Typhimurium erano calati del 25%.Tali dati dimostravano che le variazioni di resistenza nonerano legate all’uso di farmaci in veterinaria (come dimostratodalla valutazione delle vendite di medicinali veterinari nelRegno Unito), ma piuttosto:- per S. Enteritidis l’aumento di resistenza era dovuto ai viaggiall’estero e all’importazione di cibo contaminato con ceppiresistenti.- per S. Typhimurium il fattore più importante era il cambia-mento della prevalenza dei sierotipi, con declino del fagotipomultiresistente 104.Gli autori hanno concluso ritenendo i cambiamenti nell’inci-denza di resistenza dei fenomeni multifattoriali. Wassenaar eSilley [27] hanno analizzato i profili di suscettibilità di alcunipatogeni umani, animali e che possono infettare entrambi gliospiti. Dal loro esame di S. aureus, E. coli, S. enterica, è ri-sultato che i profili di resistenza di Salmonella sembravanoessere fortemente correlati alle sierovarianti; inoltre la multi-resistenza è un problema maggiore nei patogeni umani piut-tosto che in quelli veterinari, sebbene i patogeni isolati da es-seri umani e animali sembrano avere una maggiore incidenzadi resistenza rispetto a quelli esclusivamente animali.Nonostante le opinioni differenti, la maggior parte degli stu-diosi ritiene sia importante minimizzare il rischio potenzialedi antibiotico-resistenza attraverso un utilizzo mirato degliantibiotici in medicina umana così come in veterinaria e lariduzione della contaminazione microbica delle derrate ali-mentari. Infatti, l’utilizzo di antibiotici negli animali da red-dito può incentivare il passaggio di batteri antibiotico-resi-stenti dal bestiame agli alimenti e alla catena di distribuzione.



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Batteri antibiotico-resistenti negli alimenti

L’ipotesi che la diffusione di batteri antibiotico resistentidagli animali agli alimenti e alla catena di distribuzione siain rapporto all’utilizzo profilattico degli antibiotici è comu-nemente accettata [4; 8]. Più recente è l’ipotesi che anche idisinfettanti possano essere alla base del fenomeno dell’anti-biotico-resistenza [28]. Esistono segnalazioni relative all’iso-lamento di stipiti di S. aureus e S. epidermidis resistenti a di-versi antibiotici e in possesso di resistenza, mediata daplasmidi, ad agenti cationici quali la clorexedina e i sali qua-ternari di ammonio [22]. Altri esempi riguardano stipiti diE. coli resistenti a comuni disinfettanti domestici [18] e ilcrescente numero di microrganismi resistenti ai trattamentieffettuati nelle industrie alimentari con composti a base dicloro [11]. In ogni caso, l’eventuale presenza di stipiti di bat-teri antibiotico-resistenti negli alimenti di origine animale, anostro avviso, obbliga a due tipi di considerazioni. In primoluogo va tenuto presente che se batteri responsabili di malattiealimentari acute di tipo infettivo acquisiscono caratteri diantibiotico-resistenza, le difficoltà nel trattamento terapeuticopossono rendere molto grave anche una banale tossinfezione.Prendiamo ad esempio l’enterocolite da Salmonella spp.. Que-sta è in genere un’infezione autolimitante [19] e ampicillina,cloramfenicolo e trimetroprim-sulfametoxazolo sono gli an-tibiotici d’elezione. Tuttavia, la crescente diffusione di stipitiresistenti a uno o più di questi prodotti tradizionali ha obbli-gato i medici a ricorrere ai chinoloni, soprattutto per il trat-tamento della malattia sistemica [9]. L’impiego, forse ecces-sivo dei chinoloni, ha portato in breve alla selezione di stipitiresistenti. La distribuzione di alimenti di origine animale sem-pre più a carattere internazionale e intercontinentale ha por-tato alla diffusione di sierotipi di Salmonella in tutto il mondo.È facile concludere che la distribuzione ubiquitaria di Salmo-nella nell’ambiente, la sua presenza nell’intera catena alimen-tare e la capacità di adattamento mostrata, unitamente al-l’emergenza di stipiti antibiotico-resistenti, obbligano leautorità sanitarie a una continua vigilanza e a controlli semprepiù intensi a tutti i livelli della produzione di alimenti [9]. Al-tro aspetto, non meno importante, anzi più subdolo è la fun-zione di vettore che l’alimento può svolgere nella diffusionenell’ambiente di batteri antibiotico resistenti. Vi sono infattimicrorganismi ampiamente diffusi negli alimenti di origineanimale, senza che questo rappresenti un pericolo per il con-sumatore, sottoforma di malattia alimentare. Ci riferiamoad esempio agli enterococchi nei salumi o agli stafilococchinei prodotti lattiero-caseari. Tali germi raggiungono il trattogastro-enterico umano tramite il consumo di alimenti, po-tendo trasmettere determinanti genetici di resistenza ai battericommensali della flora microbica intestinale e a microrgani-smi patogeni eventualmente presenti a quel livello. Si trattainoltre, di batteri responsabili di infezioni ospedaliere diffi-cilmente curabili quando sostenute da stipiti antibiotico-re-sistenti, soprattutto alla vancomicina e alla meticillina [2;23] Tra gli enterococchi non figurano specie responsabili di

malattie alimentari [7] tuttavia l’emergenza di stipiti antibio-tico resistenti in ambito veterinario, e la diffusione di questinell’ambiente, attraverso gli alimenti di origine animale, èuna possibilità che va tenuta in debita considerazione [5].L’alimento considerato idoneo per la vendita e il consumopuò infatti circolare liberamente rappresentando una poten-ziale fonte di microrganismi antibiotico-resistenti.

Strategie per il controllo

I meccanismi per il controllo della diffusione di stipiti antibioticoresistenti vanno da provvedimenti ovvi, quali l’adozione di ele-vati standard igienici negli ospedali e negli allevamenti, a veree proprie sfide per gli scienziati, quali la messa a punto di nuovemolecole antibiotiche. In primo luogo è però necessario limitarel’utilizzo di antibiotici come promotori di crescita nei paesi incui ne è ancora consentito l’utilizzo. Nel settore della produzionee trasformazione degli alimenti, il controllo della diffusione dibatteri resistenti agli antibiotici si attua sia attraverso le notemisure per limitare lo sviluppo batterico e prevenire l’adesionebatterica sulle superfici, sia con l’adozione della cosiddettaesclusione competitiva [3]. I mezzi per prevenire lo sviluppo dibatteri resistenti sulle superfici dovrebbero condurre alla dimi-nuzione dell’impiego di disinfettanti, soprattutto attraversol’utilizzo di superfici e materiali specifici. Spesso la cosiddetta“microtopografia” di una superficie rende difficoltose le ope-razioni di pulizia, allorché fessure e altre imperfezioni impedi-scono la rimozione dei batteri. È per questa ragione che i ma-teriali sono scelti in virtù delle loro capacità di resistere agliurti e alla corrosione. È ovvio che in presenza di materiali sca-denti o di apparecchiature dal cattivo design le operazioni dipulizia non sortiscono l’effetto desiderato (rimozione dei batteri)e rendono necessario l’impiego di massicce dosi di disinfettante.Uno strumento ancora in via di perfezionamento, ma che po-trebbe rendere l’utilizzo dei disinfettanti sulle superfici obsoleto,è l’utilizzo di un film protettivo sulle superfici. Si tratta dipeptidi ad attività antimicrobica, quali la nisina, che una voltaadsorbiti dalle superfici diminuiscono l’adesione batterica equindi la contaminazione [3].

Conclusioni

L’aumento e la diffusione di resistenza batterica agli antimi-crobici è un’espressione naturale dell’evoluzione: maggiore èl’utilizzo di una molecola, maggiori sono le probabilità che imicrorganismi acquisiscano resistenza. In generale il feno-meno è più evidente nel caso degli antibiotici, piuttosto chedei comuni disinfettanti. Esiste, tuttavia, la possibilità chel’esposizione dei batteri a concentrazioni soglia di disinfettanteconduca alla selezione di specie resistenti, non solo versoquel determinato composto, ma anche verso molecole anti-biotiche. La natura e la trasmissibilità del DNA giustificanola preoccupazione che i determinanti della resistenza possanodiffondere nell’ambiente, anche a specie batteriche non cor-relate a quelle originarie. I livelli di intervento per diminuire



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la pressione selettiva esercitata dagli antibiotici in campo ve-terinario sono stati precisamente codificati negli ultimi annie prevedono, come visto, sia considerazioni sull’opportunitàdi determinati impieghi, sia lo studio di nuove molecole. Nelsettore dell’industria alimentare, soprattutto di quella di tra-sformazione degli alimenti di origine animale, il controllodei batteri causa di malattie alimentari andrebbe associatoall’applicazione dei mezzi descritti in questo articolo, alloscopo di prevenire anche lo sviluppo e la diffusione di mi-crorganismi antibiotico-resistenti.

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