Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni,

appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse.

ANIMALI TRANSGENICI : definizione

Vettori retrovirali (terapia genica)

Microiniezione del DNA nel pronucleo maschile (in zigoti

fertilizzati)

Cellule staminali embrionali (trasfezione/elettroporazione blastocisti)

Cellule staminali embrionali

TOPO CHIMERA

In P3 l’assortimento genotipico

segue le regole mendeliane per

l’incrocio tra due eterozigoti

È necessario selezionare la progenie per avete topi con un genotipo omogeneoeterozigote o omozigote

P1

Il topo chimerico (P1) puo’ avere lamutazione nella linea germinale

(in eterozigosi) oppure no.

P2

P3

P1

ANIMALI TRANSGENICI : come si producono???

Vettori retroviraliMicroiniezione del DNA

Cellule staminali embrionaliGene targeting/ gene trapping

KO condizionaliTrasferimento del nucleo

YAC

GFP

Gene trapping: inserzione in una cassetta CASUALE

Gene targeting:

inserzione in un gene SPECIFICOmutagenesi MIRATA

STRATEGIE PER LA PRODUZIONE DI ORGANISMI TRANSGENICI

GENE TRAPPING

Per fare topi transgenici su vasta scala generalizzata, senza un solo target...ma

anche per identificare nuovi geni“Gene trapping is a form of insertional mutagenesis

specifically designed to disrupt gene function by producing intragenic integration events”.

Integrazione casuale nel genoma di un costrutto

contenente un gene reporter (entrapment vector)

Integrazione “produttiva” porta il gene reporter sotto la regolazione trascrizionale di un gene endogeno

Il GENE TRAPPING

1) Consente l’isolamento di nuovi geni

2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene intrappolato

3) È mutagenico: produce knockout

X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter gene expression associated with a secretory trap

insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson

STRATEGIA DEL STRATEGIA DEL GENE TRAPGENE TRAP

Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento

Selezione dei cloni tramite “marker”

Localizzazione dell’inserto nel clone selezionato

ANALISI DEL FENOTIPO

ELEMENTI necessari per ELEMENTI necessari per gene trapgene trap::

• Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo

• “Entrapment vector” contenente : - gene reporter - marker di selezione

• Cellule staminali embrionali di Topo

SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENEintegrato nel sito corretto

IntegrazioneSito specifica

• Geni reporter

• The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal)

• The firefly luciferase gene• The jelly fish green flourescence protein

(GFP) gene

“Lac Z staining”: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza

della beta-galattosidasi sia nell’organo “in toto” sia in specifici tessuti/cellule.

Elementi importantiElementi importantiper espressione di un gene e per espressione di un gene e

utilizzati per il utilizzati per il GENE TRAPPINGGENE TRAPPING

Promotore combinazione di elementi ai quali si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene

Enhancer corte sequenze che stimolano l’attività trascrizionaledi un promotoredi un promotore

Poliadenilazione aggiunta di circa 200 A all’estremità 3’ di un mRNA. La coda poly(A) è importante per la stabilità dell’mRNA

• Enhancer trap Vector• Promoter trap V.• poly A trap V.• Gene trap V.

Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING

Enhancer

DNA

RNA

protein PROTEIN XPROTEIN X β-gal NeoR

PromotoreMINIMO lac Z

P'

pApA

Endogenous gene X

Vector Integration

Vector

neo

EnhancerEnhancer Trap Trap

Exon 1 Exon 2 Exon 3

PromotoreMINIMO lac Z neo

lac Z neo

Promotore e pAINDIPENDENTI

Endogenous gene X

lac ZpA

P'

neopA

Vector Integration

DNA

RNA

protein β-gal NeoR

PromoterPromoter Trap Trap

PROTEIN XPROTEIN X

lac Z

lac Z

neo

neo

Vector

PROMOTOREPromotoreASSENTE

Promotore e pAINDIPENDENTI

SA

P'

SDVector Integration

pA

pA

β-gal NeoR

DNA

RNA

protein

Poly A Poly A TrapTrapEndogenous gene X

SA

SA

PROTEIN XPROTEIN X

lac Z neo

lac Z neo

lac Z neo

Vector

Promotore e pAINDIPENDENTI

SA

Endogenous gene X

SA pA

P'

pA

Vector Integration

DNA

RNA

protein

Spliced transcript

β-gal NeoR

GeneGene Trap Trap

SA

PROTEIN XPROTEIN X

Vector

lac Z neo

lac Z neo

lac Z neo

PromotoreASSENTE

Introne gene X

Promotore e pAINDIPENDENTI

Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

GeneGene Trap Trap

RICAPITOLANDO…………..

Il GENE TRAPPPING consente

1)Identificazione NUOVI GENI2)Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)3)ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI

PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene

modifications in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting.”

GENE TARGETING

Mario R. Capecchi

Martin J. Evans Oliver Smithies

GENE TARGETING

Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione omologa in cellule ES

Permette la creazione di una mutazione in un gene PREDETERMINATO

Questa mutagenesi può avere come risultato:

1)INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-OUT)2)DIMINUZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-DOWN)3)INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (correzione) (KNOCK-IN)

IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA

IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA

Nelle cellule di Mammifero la RICOMBINAZIONE OMOLOGA è un evento MOLTO RARO (a differenza del Lievito)

La frequenza di questo evento aumenta se il grado di OMOLOGIA di sequenzatra il DNA introdotto (esogeno) e il GENE BERSAGLIO (endogeno) è molto elevata

Per questo il clone di DNA esogeno è una sequenza ISOGENICA(derivante dallo stesso ceppo murino)

vettori utilizzati per vettori utilizzati per GENE TARGETINGGENE TARGETING

1) VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-OUT)

2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-IN)

Gene di interesse

M: marker esternoalla regione omologa

Gene di interesse

M: marker internoalla regione omologa

Singolo evento di ricombinazioneDistruzione del locus genico: KO

Doppia ricombinazioneSostituzione di parti del locus genico1)Per correggere un gene2)Per produrne forma inattiva

Un topo KO per un gene X non sempre ha “fenotipo”

Per effetto di RIDONDANZA GENETICA (presenza nel genoma di altri geni con funzione simile)

PER QUESTO PUO’ ESSERE NECESSARIO PRODURRE DOPPI/TRIPLI KO

DOPPI e TRIPLI KNOCK-OUT

La famiglia delle Serin-treonine chinasi PIM

Ruolo di PIM

…esempio di TRIPLO KO………

Solo il triplo KO ha un fenotipo“Mice Deficient for All PIM Kinases Display Reduced Body Size and

Impaired Responses to Hematopoietic Growth Factors”

PIM1 KO: nessun FENOTIPOPIM2 KO: nessun FENOTIPOPIM3 KO: nessun FENOTIPO

…esempio di KNOCK-IN………

Qual è l’importanza della FOSFORILAZIONE della proteina ribosomale S6???

?

Ribosomal protein S6 phosphorylation is a determinant of cell size and glucose

homeostasis

S6K1 KO: rpS6 fosforilata!S6K2 KO: rpS6 fosforilata!

S6K1/K2 doppioKO: rpS6 fosforilata!

……..esiste un’altra chinasi (o piu’ di una!!)

Unica soluzione……..RPS6 KNOCK-IN non fosforilabile

MUTAGENESI CHIMICA/FISICA

Mutagenesi chimica: ENU (Etil-Nitrosurea) EMS (Etil-Metilsolfonato)

Mutagenesi fisica : raggi X

Mutagenesi RANDOM

LABORIOSA ANALISI FENOTIPO E IDENTIFICAZIONE GENE MUTATOPER CORRELARE GENE/FENOTIPO

CONFRONTO TECNICHE MUTAGENESI

GENETRAPPING

GENETARGETING

MUTAGENESICHIMICA

G 19/03: PRESENTAZIONE + Lez1 ANIMALI TRANSGENICIG 26/03: OGM (Prof. Gravina)Lez1G 02/04: OGM (Prof. Gravina)Lez2G 09/04: Lez2 ANIMALI TRANSGENICI ***consegna articoliG 16/04: Lez3 ANIMALI TRANSGENICIG 23/04: Lez4 DROSOPHILAG 30/04: Lez5 PIANTEG 07/05: Lez6 PIANTE(3 a lezione) 15m ognunaG 14/05: PRESENTAZIONI 1A 1B 1C (topi tecniche)G 21/05: PRESENTAZIONI 2A 2B 2C (topi KO K-In)G 28/05: PRESENTAZIONI 3A 3B 3C (topi KO K-In)G 04/06: PRESENTAZIONI 4A 4B 4C (Drosophila)G 11/06: PRESENTAZIONI 5A 5B 5C (piante)