Coltura “in vitro” di uova Anche le uova devono “MATURARE”

La maturazione degli oociti in vitro (IVM) e la fertilizzazione (IVF) sono tecniche indispensabili che trovano applicazione sia in campo veterinario che umano. Lo sviluppo di un oocita competente per la fertilizzazione ed il successivo processo diembriogenesi dipendono da appropriati segnali provenienti dalle cellule della granulosa (CG)che, a loro volta, devono essere adeguatamente stimolate dall’oocita in crescita.

Colture cellulari Per colture cellulari si intende cellule provenienti dalla dissociazione di tessuti animali che si

moltiplicano “in vitro” per una o più generazioni avendo perduto l’architettura del tessuto e di solito avendo subito un certo grado di differenziazione.

•Possibilità di coltivare “in vitro” diversi tipi cellulari, permettendo la sopravvivenza e la funzionalità cellulare in un ambiente diverso da quello naturale.

•Le colture cellulari vengono utilizzate nella ricerca come modello sperimentale in innumerevoli tipi di esperimenti. Esse sono utilizzate per analizzare l'effetto di farmaci e verificare la mutagenicità e cancerogenicità delle sostanze. Vengono utilizzate come modello in cui studiare effetto dell'espressione di particolari geni.

Ritorni in campo zootecnico, veterinario, clinico, medico, farmacologico.

Colture cellulari

2D 3D

Nei sistemi in vivo lo sviluppo differisce significativamente rispetto alle cellule coltivate in 2D, soprattutto per quanto riguarda la morfologia, la cinetica di crescita, l’espressione genica ed il grado di differenziazione.

le colture cellulari tridimensionali (3D) costituiscono un approccio alternativo e/o parallelo al 2D. Esse sono il punto di legame tra la coltura cellulare tradizionale e i modelli in vivo.

Incapsulazione di cellule vive in

membrane semipermeabili e

biocompatibili

INCAPSULAZIONE DI CELLULE DELLA GRANULOSA (GC) PER LO SVILUPPO IN VITRO DI PSEUDOFOLLICOLI OVARICI

Follicoli primordiali ovarici sono strutture circondate da un singolo strato di cellule piatte che durante la maturazione del follicolo diventano cuboidali e si differenziano in cellule della granulosa (GC), della teca interna e della teca esterna.

Follicoli Ovarici:CELLULE DEL CUMULO

La MEIOSILa meiosi sussiste in due divisioni nucleari (indicate come meiosi I e meiosi II) che producono un totale di quattro nuclei figli, aventi ciascuno la metà del numero dei cromosomi presenti nel nucleo di partenza.

Ia Divisione meioticaProfase ILa cromatina inizia a condensarsi e i cromosomi duplicati diventano pertanto visibili al microscopio; subito dopo, in un processo chiamato sinapsi, i cromosomi omologhi si appaiano per tutta la loro lunghezza. Formatasi questa struttura che prende in nome di tetrade può avvenire il crossing over. Metafase IFormazione del fuso mitotico e allineamento degli omologhi.Anafase II cromosomi si separano completamente e migrano verso il polo.Telofase IRiformazione dell’involucro nucleare con distribuzione asimmetrica del materiale citoplasmatico. Crossing over

IIa Divisione meiotica Viene completata ad ogni ovulazione conferendo all’ovocita la possibilità di essere fecondato.

Profase IIAl picco pre-ovulatorio delle gonadotropine l’attività nucleare riprende: l’ovocita completa la 1° divisione meiotica ed elimina il primo globulo polare: l’ovocita ora detto secondario inizia la seconda divisione meiotica ma si arresta in MII.

Metafase IISi forma il fuso e scompare l’involucro nucleare. Comincia l’allineamento dei cromosomi: solo dopo l’ovulazione e la successiva fertilizzazione, l’ovocita completerà anche la seconda divisione meiotica con l’estrusione del secondo globulo polare.

Anafase III centromeri dei cromosomi dei cromatidi fratelli si rompono e i cromatidi si dividono, migrando ai poli opposti della cellula.Telofase IIsi riforma l’involucro nucleare ed i cromosomi si despiralizzano parzialmente.

PROFASE I: GV visibile, assenza globulo polare

METAFASE I: assenza GV e globulo polare

METAFASE II: assenza GV, I° globulo polare

POST-MATURO: I° globulo polare visibile, degenerazione citoplasma, disomogeneo

Ovocita immaturo (profase I)

•Le cellule del cumulo possono presentare qualche grado di espansione.•Le cellule della corona sono compatte e strettamente addossate alla zona pellucida

PB

Ovocita maturo (metafase II)

•Globulo polare estruso• Cellule del cumulo espanse•Cellule della corona con tipica disposizione radiata•Cellule della granulosa, larghe e abbondanti.

Stereomicroscopio:

Struttura pseudofollicolare dopo 48h di co-coltura 3D

(oo) oocita decumulato(zp) zona pellucida(GC) cellule granulosa(m) membrana Ba alg(c) core capsula

Adobe Photoshop X20

CELLULE della GRANULOSA•Giunzioni comunicanti con l’ovocita

• Ruolo centrale nella maturazione del follicolo

• Regola lo sviluppo dell’oocita (controlla l’arresto meiotico e la successiva ripresa)

• Invia all’ovocita sostanze nutritive

• Segnali all’oocita per il processo di embriogenesila granulosa è controllata dall’ovocita

proliferazione, organizzazione

differenziamento, steroidogenesi

Attività ormonale CGDurante la maturazione follicolare le CG producono estrogeni, dopo l’ovulazione si differenziano e producono P4

FOLLICOLO PREOVULATORIO

FOLLICOLO POST OVULATORIO

(CORPO LUTEO)

produzionedi 17-β-estradiolo e

progesterone

prevalente produzionedi progesterone

COLTIVAZIONE IN MONOSTRATO

ASSENZA ADEGUATA ECMADESIONE DELLE CELLULE AD UN SUPPORTO

INADATTO

MORFOLOGIA

MINOR ATTIVITÀ AROMATASICAPrevalente produzione di Progesterone

crescita bidimensionale e alterazioni morfologiche-funzionali

Monostrato

COLTIVAZIONE STRUTTURE SIMILFOLLICOLARI

PRESENZA DI ECM NATURALE/ARTIFICIALEBARRIERA SEMIPERMEABILE (LAMINA BASALE)

Produzione di 17-β-estradiolo e progesterone

3D

Competenza di Ovociti SUINI maturati mediante co-coltura tridimensionale ed in assenza

di gonadotropine esogeneSCOPO: Realizzare una struttura pseudo-follicolare finalizzata ad ottenere elevati livelli

di maturazione di oociti di animali di interesse zootecnico,

mediante l’incapsulazione di GC immobilizzate

in una matrice extracellulare artificiale.

Aspirazione follicoli (Ø 2-8 mm)Fluido follicolare contenente GC e oociti:

• centrifugare a 2000 giri/min.

• risospensione in terreno di coltura (HAM’S F-10)

• dosare 30 µl in piastra petri

• osservare allo stereomicroscopio

• isolare le uova in un’altra petri con 100 µl di terreno

OocitiPellet GC

Co-coltura 3D

+ BaCl2

Sosp cellulare

Alginato di sodio

La sospensione viene estrusa in una soluzione di alginato sodico; gli ioni bario bivalenti diffondono verso la superficie esterna inducendo la gelificazione dell’alginato intorno alla sospensione cellulare con formazione di una membrana di alginato di bario all’interfaccia delle singole gocce di estruso.

Membrana di alginato di Ba

Matrice extracellulare atificiale

Cellule della granulosa

INCAPSULAZIONEDI GC

Pellet CG

+

BaCl2 Na alginato

GC

Ba alginato

Sospensione cps in HAM’S F-10

Inserimento oocita o complesso cumulo-oocita

Coltura in 3D

IVM

37°C, 5% CO2 48 h

IVF

Coincubazione 37°C, 5% CO2 6 h

Incubazione 37°C 5% Co2 6 gg

Classificazione stereomicroscopica (48 h e 144 h)

Divisi Non Divisi

SEM: oocita suino clivato dopo 48h dalla IVF; IVM in sistema 3D hormone-free (800X)

Oociti suini in fase di divisione

Stereomicroscopio (90X): embrione suino a 144h dalla IVF; IVM in sistema 3D hormone-free

Oociti circondati da molte GC raggiungono una competenza di maturazione più elevata (Sirad et

al., 2006)

Conclusioni

GC necessarie per il normale sviluppo dell’oocita

Fondamentali i contatti tra oocita e cellule del cumulo

Coltura 3D non è influenzata dalla presenza di un’intatta corona radiata formazione

pseudo-cumulo

A 144 h presenza di GC sulla superficie

esterna degli oociti:

Importanza delle GC in fase di IVM sia per diretto contatto

che per la produzione di metaboliti e cataboliti

Conclusioni

Membrana di alginato di bario simula la membrana basale in vivo

Co-coltura 3D buona efficienza nella IVM di oociti per IVF e ET senza gonadotropine esogene

Produzione embrioni in ambito veterinario

terapia dell’infertilità umana

Conclusioni

Tecnica promettente per incrementare la qualità degli embrioni nei protocolli di IVM