Analisi in Analisi in silicosilico per la ricerca di domini per la ricerca di domini conservati di NRPSs batteriche in conservati di NRPSs batteriche in

genomi eucarioticigenomi eucariotici

Analisi in Analisi in silicosilico per la ricerca di domini per la ricerca di domini conservati di NRPSs batteriche in conservati di NRPSs batteriche in

genomi eucarioticigenomi eucariotici

Università degli Studi “La Sapienza” ROMA

Anno 2002/2003

Pietro Buffa

MASTER inBIOinformatica

Applicazioni BioMediche e Farmaceutiche.

Direttore Master: Prof.ssa Anna Tramontano

Relatore: Prof. Stefano Pascarella

Generalità sulle Non Ribosomal Peptide Syntetases, NRPSs

Le NRPSs provvedono ad una sintesi peptidica differente da quella svolta dai ribosomi, essi si presentano generalmente come grossi enzimi multifunzionali con un’organizzazione molecolare

di tipo modulare.

Il modulo più semplice è composto da tre domini indispensabili per il corretto funzionamento dell’enzima:

• Dominio di Adenilazione

• Dominio di Tiolazione

• Dominio di Condensazione

Catalizza l’attivazione dell’aminoacido (aminoacil-adenilato).

Lega l’aminoacido al gruppo prostetico di fosfopanteteina (PP), formando un aminoacil-tioestere.

Catalizza l’allungamento del peptide nascente.

Diversi studi condotti sul dominio di Adenilazione di questa famiglia di enzimi hanno dimostrato che:

• La natura del substrato che sarà inserito nel peptide La natura del substrato che sarà inserito nel peptide sintetizzato dalle NRPSs è controllata principalmente da questo sintetizzato dalle NRPSs è controllata principalmente da questo

dominio.dominio.

• La presenza di un aminoacil-adenilato è la necessaria La presenza di un aminoacil-adenilato è la necessaria premessa alla formazione dell’aminoacil-tioestere nel dominio premessa alla formazione dell’aminoacil-tioestere nel dominio

di Tiolazione e quindi alla sintesi del peptide.di Tiolazione e quindi alla sintesi del peptide.

• Studi condotti su oltre 150 domini di Adenilazione provenienti Studi condotti su oltre 150 domini di Adenilazione provenienti da organismi diversi, hanno rivelato la presenza di importanti da organismi diversi, hanno rivelato la presenza di importanti residui conservati coinvolti nel legame e nell’idrolisi dell’ATP. residui conservati coinvolti nel legame e nell’idrolisi dell’ATP. Sulla base di queste osservazioni è oggi possibile prevedere la Sulla base di queste osservazioni è oggi possibile prevedere la

specificità di un dominio di adenilazione a partire dalla specificità di un dominio di adenilazione a partire dalla struttura primaria con una accuratezza di circa l’86% struttura primaria con una accuratezza di circa l’86%

(Stachelhaus et al, 1999).(Stachelhaus et al, 1999).

• Nel 1997 Mohamed Marahiel della Philipps university of Nel 1997 Mohamed Marahiel della Philipps university of Marburg ha ottenuto la struttura cristallografica del dominio di Marburg ha ottenuto la struttura cristallografica del dominio di

Adenilazione della Gramicidina sintetasi di Adenilazione della Gramicidina sintetasi di Bacillus brevis.Bacillus brevis.

La struttura cristallografica, l’unica fino ad oggi risolta, è stata ottenuta con i substrati complessati, rispettivamente la L-Phe e AMP

ad una risoluzione di 1,9Å.

In giallo il dominio maggiore, in rosso il dominio minore. AMP e Phe sono mostrati come modelli a spazio pieno.

SCOPO DEL LAVORO

Punto di partenza di questa ricerca è stata la recente identificazione da parte di due ricercatori Giapponesi (T. Kasahara e T. Kato, Nature 2003) di una importante molecola:

la Pirrolo Quinolina Quinone (PQQ), cruciale per la degradazione dell’aminoacido Lisina da parte di particolari deidrogenasi PQQ-dipendenti nel topo (acido 2-aminoadipico 6-semialdeide deidrogenasi AAS) . Queste deidrogenasi, presentano una organizzazione dei domini che è tipica degli enzimi NRPS di origine batterica:Dominio di Adenilazione legante AMPDominio di Tiolazione legante PPEd un Dominio legante il PQQ

P O

O-

O

-

ONHNH

HSO O

OH

. .NHOOC

COOH

O

O

NHCOOH

Scopo della ricerca è quello di verificare se proteine contenenti i domini AMP e PP compaiono anche in altri organismi (oltre che in Topo e Drosophila dove sono stati recentemente riscontrati) e se si, associati a quale altro dominio.

RISULTATI DELLA RICERCA

Ricerca di nuove sequenze proteiche correlate alle Ricerca di nuove sequenze proteiche correlate alle NRPSs batteriche in diversi genomi eucarioticiNRPSs batteriche in diversi genomi eucariotici

Una preliminare ricerca sulle banche dati proteiche, ha permesso di individuare 15 proteine correlate alle NRPSs batteriche (contenenti cioè i domini fondamentali), non ancora annotate nella loro funzione in banca dati.

Sono state utilizzate come sonda le proteine:

AAS (Acido 2-aminoadipico 6-semialdeide deidrogenasi) di topo

[Accession number, 30348962]

U26 di Drosophila [Accession number, AAF52679]

EBONY di Drosophila [Accession number, CAA11962]

CODICE Seq. ORGANISMO DOMINI LUNGProt.

In SILICO

         

Nr:GI_8885525 A. thaliana AMP-PP-WD40(PQQ) 1175 NO

Nr:GI_22327387 A. thaliana AMP-PP-WD40(PQQ) 1040 NO

Nr:GI_20466612 A. thaliana AMP-PP-WD40(PQQ) 1040 NO

Nr:GI_17556356 C. elegans C-AMP-PP-C-PP-C-AMP-P 2870 NO

Trembl :q95q02 C. elegans AMP-PP-PP-C-AMP-PP 2870 NO

Nr:GI_24817561 C. elegans AMP-PP-WD40(PQQ) 707 NO

Nr:GI_24817562 C. elegans AMP-PP-WD40(PQQ) 714 NO

Nr:GI_20151443 D. melanogaster AMP-PP- ? 703 NO

Nr:GI_24648676 D. melanogaster AMP-PP- ? 879 NO

Nr:GI_32867661 D. melanogaster AMP-PP- ? 879 NO

Nr:GI_22945960 D. melanogaster AMP-PP-PQQ 1012 NO

Nr :GI_3286766 D. melanogaster AMP-PP- ? 879 NO

Nr:GI_5777799 D. melanogaster AMP-PP-PQQ 824 NO

Nr:GI_21291643 A. gambiae AMP-PP-? 881 NO

Nr:GI_31235353 A. gambiae AMP-PP-PQQ 824 NO

Le sequenze precedentemente elencate sono state utilizzate come sonda per ricerche di similarità sulle Banche Dati Genomiche utilizzando il modulo “tblastn” del programma BLAST implementato sia su NCBI che su ENSEMBL.

R. Norvegicus (Rat)

M. Musculus

H. Sapiens

D. Melanogaster

C. Elegans

C. Briggsae

A.Thaliana

D. Rerio (Zebrafish)

A.Gambiae

S. Scrofa

G. Gallus

B. Taurus

C. Intestinalis

F. Rubripes

O. sativa

Per alcuni genomi non si sono avuti risultati positivi.

Per altri si è trovata una notevole similarità e la presenza di residui chiave veniva mantenuta. Per queste sequenze si è proceduto all’esportazione delle rispettive sequenze genomiche in formato FASTA.

Costruzione di geni in silico per le sequenze ritrovate Costruzione di geni in silico per le sequenze ritrovate in seguito alle ricerche genomichein seguito alle ricerche genomiche

ORGANISMO CODICE SEQUENZA SONDA

LOCALIZZAZIONE GENOMICA

LUNGHEZZA PROTEINA

       

30348962 Crom.14 Contig: RNOR01037209

1152 AA

30348962 Crom. 4 Contig:AC06820.5.1.147534

556 AA

Danio Rerio (zebrafish)

30348962 Contig: CTG11952.6 1003 AA

Fugu Rubripes 30348962 Scaffold: 632 1088 AA

Ciona Intestinalis

30348962 AABS01000029_1 1074 AA

Oryza sativa 8885525 Nr:GI_19925098 1285 AA

Oryza sativa 8885525 Nr:GI_19961040 1551 AA

Oryza sativa 8885525 Nr:GI_19963553 1461 AA

 

Homo Sapiens

Rattus norvegicus

Le sequenze genomiche precedentemente esportate e salvate vengono utilizzate in questa seconda fase del lavoro, per cercare di ottenere, attraverso l’uso di programmi quali GenScan e genomeScan, una corretta costruzione del gene specifico per ogni sequenza ed arrivare alla fine, alla predizione della relativa sequenza proteica completa.

Realizzazione di un allineamento multiplo completoRealizzazione di un allineamento multiplo completo

– Parte dell’allineamento multiplo di 35 sequenze proteiche appartenenti alla famiglia della NRPSs,. L’allineamento è stato formattato utilizzando il programma ESPRIT 2.1.

• Abbiamo utilizzato 35 sequenze

• Da tutte le 35 seq. È stata manualmente eliminata la regione contenente il dominio C-terminale

• E’ stato utilizzato il programma HMMERalign

• Sono state eliminate dall’allineamento multiplo le regioni iniziali e terminali poichè non avendo corrispondenze ben definite, potevano creare un fastidioso rumore di fondo che andrebbe a disturbare la successiva fase di generazione dell’albero evolutivo

DFFxxLGG(HD)S(LI)Residui fondamentali del dominio

di tiolazione. La serina lega il gruppo prostetico di

fosfopanteteina.

Realizzazione dell’albero filogeneticoRealizzazione dell’albero filogenetico

Albero filogenetico.

Sono stati utilizzati i programmi:

PROTDIST

KITSCH

e DRAWTREE

Linea filetica dei Batteri

Linea filetica dei Funghi

Linea filetica dei Vegetali

Linea filetica degli organismi eucariotici superiori animali

Il completamento in corso di vari progetti gnomici ha permesso di individuare numerose proteine correlate

alle NRPSs batteriche in organismi eucariotici superiori non ancora annotate in banca dati.

La conoscenza del sistema sintetico delle NRPSs e la comprensione più approfondita dell’evoluzione che queste proteine enzimatiche , conosciute fino a poco

tempo fa soltanto a livello batterico, potrebbero avere avuto, potrebbe risultare utile per cercare di far luce

su determinate vie metaboliche non ancora molto chiare in diversi organismi superiori.

DISCUSSIONE

RINGRAZIAMENTI