Lezione VI. Mappatura dei cromosomi eucariotici · sesso in Drosophila e nell’uomo ... Se la...
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Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Mappatura deicromosomi eucariotici
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Mendel -> i caratteri di un individuo sono specificati da geni e sono ereditari
Ma dove sono i “geni” nella cellula?
Morgan -> alcuni caratteri vengono trasmessi di generazione in generazione allo stesso modo di come vengono trasmessi i cromosomi sessuali (ovvero alcuni caratteri sono specificati da particolari cromosomi che determinano il sesso dell’individuo)
I geni sono sui cromosomi?
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Prova cruciale della teoria cromosomica
Esperimento di Bridges
♀ ♂
♀♂
atteso
XRXb occhi rossi ½
XbY occhi bianchi ½
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ma da incroci su larga scala si puo’generare una “progenie eccezionale”
♀♂ atteso
XRXb occhi rossi ½
XbY occhi bianchi ½
♀♂
occhi bianchi XbXb?
occhi rossi, sterili
+Progenie eccezionale primaria, 0.05%
xbxb xRy
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XbXb? XRY
Progenie eccezionale secondaria
♀♂
attesoXRXb occhi rossi ½
XbY occhi bianchi ½
♀♂
occhi bianchi XbXb?
occhi rossi, fertili
+Progenie eccezionale secondaria, 4%
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Determinazione del sesso in Drosophila
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Determinazione cromosomica del sesso in Drosophila e nell’uomo
Homo Sapiens ♀ ♂ ♂ ♀
Drosophila ♀ ♂ ♀ ♂
Specie XX XY XXY XO
Cromosomi sessuali
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Determinazione del sesso in DrosophilaRapporto X:A
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Origine della progenie eccezionale primaria
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Origine della progenie eccezionale secondaria
XbXbY x XRYGameti XbXb /Y
Xb/XbYXR /Y
YYXYY
XbXbYXXbXbXbXb
YX
XbYYXXbYXbY
XbYXXbXb
YX
4%
♀ ♂♂ ♀
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Bridges confermo’ la sua ipotesi con osservazioni citologiche dirette
Le ♀ eccezionali primarie avevano cromosomi sessuali di tipo XbXbY
I ♂ eccezionali primari avevano cromosomi sessuali di tipo XRO
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I geni sono sui cromosomi e questo spiega la segregazione meiotica di caratteri indipendenti nella formazione dei gameti
AaBb
A e B su cromosomi diversi-> segregazione indipendente
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E se i geni si trovano sullo stesso
cromosoma?
Geni associati
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Geni associati
Geni su cromosomi diversi
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Esperimento di Bateson & Punnett
-Studio di altri 2 caratteri del Lathyrus odoratus
1) colore del fiore (porpora/rosso)
2) forma del granulo pollinico (lungo/tondo)
PP pp
LL ll
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IncrocioPP/LL x pp/ll
Pp/LlP
F1
435 (1)1338Rosso cortopp/ll
1303 (3)393Rosso lungopp/L-
1303 (3)390Porpora cortoP-/ll
3911 (9)4831Porpora lungoP-/L-
attesi (Mendel)
osservati
autofecondazione
F2
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• I 2 caratteri non assortiscono in modo indipendente ma sono accoppiati (maggiore frequenza dei fenotipi identici ai parentali)
• Deviazione dalla seconda legge di Mendel
• Accoppiamento dei caratteri (Coupling)
• La comprensione del fenomeno si ottenne con gli esperimenti di Morganfatti su Drosophila
Osservazioni
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plplparentale
pLpLricombinante
PlPlricombinante
PLPLparentale
Caratteri accoppiati
Caratteri indipendenti
Pp/Ll
Stessa probabilita’
Alta probabilita’
Alta probabilita’
Bassa probabilita’
Bassa probabilita’
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Occhio rosso
Ali normali
Occhio porpora
Ali vestigiali
x
pr+pr+
vg+ vg+ vg vg
pr pr
F1
P
Esperimento di Morgan. IStudio di altri 2 caratteri 1) colore dell’occhio
2) grandezza dell’ala
Occhio rosso
Ali normali
pr+ pr / vg+ vg
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Testcross
xF1
Occhio rosso
Ali normali
pr+ pr / vg+ vg
Occhio porpora
Ali vestigiali
pr pr / vg vg
Ci concentriamo solo sulla meiosi del doppio eterozigote
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F2
710 (1)1195Porpora vestigialepr pr/ vg vg
710 (1)154Porpora Normalepr pr/ vg+vg
710 (1)151Rosso vestigialepr+ pr/ vg vg
710 (1)1339Rosso Normalepr+ pr/ vg+vg
attesi (Mendel)osservati
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Osservazioni I.Coupling tra
pr+ e vg+e tra pr vg
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Esperimento di Morgan. II
pr+ pr+ vg vg pr pr vg+ vg+
P x
F1
pr+ pr vg+ vg
occhio rossoala vestigiale
occhio porporaala normale
occhio rossoala normale
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F1
pr+ pr vg+ vg
x
pr pr vg vg
Testcross
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F2
558 (1)146Porpora vestigialepr pr/ vg vg
558 (1)1067Porpora Normalepr pr/ vg+vg
558 (1)965Rosso vestigialepr+ pr/ vg vg
558 (1)157Rosso Normalepr+ pr/ vg+vg
attesi (Mendel)osservati
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Osservazioni II.Repulsion tra
pr+ vg+e tra pr vg
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SpiegazioneI geni pr e vg sono fisicamente uniti sullo
stesso cromosoma, viaggiano insieme nella formazione dei gameti
I 2 caratteri vengono ereditati insieme nei gameti per questo motivo e’ maggiore la frequenza dei fenotipi uguali ai parentali
1 2
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Come si spiega la comparsa dei non parentali?
Morgan sapeva che durante la meiosi i 2 cromatidi non fratelli ma omologhi duplicati si appaiano a formare un
chiasma
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Ricombinantida assortimento indipendente
Fenotipi
Perentali50%
Fenotipi
Ricombinanti
50%
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Ricombinantida crossing-over
Fenotipi
Perentali>50%
Fenotipi
Ricombinanti<50%
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Il crossing over non avviene sempre in tutte le meiosiIl crossing over è un evento raro, solo una parte degli omologhi ricombina; questo spiega perché prevalgono i cromosomi parentali.
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Ricombinanti nei cicli vitali aploidisemplice da determinare
Non c’e’ eterozigosi che puo’mascherare il carattere recessivo
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Ricombinanti nei cicli vitali diploidi
Linee pure omozigoti
testcross
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La proporzione di progenie ricombinante varia a seconda di quali geni sono presi in esame
La frequenza di crossing over e quindi di ricombinanti ottenuti puo’ essere indicativa della distanza tra 2 geni
Osservazioni III.
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Il numero di crossing over che si puo’ verificare tra 2 geni e’ funzione della loro distanza
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Maggiore è la distanza tra i geni
associati, maggiore è la probabilità che si
verifichi uno scambio nella regione
compresa tra le due coppie e quindi
maggiore è la percentuale di meiosi nelle
quali si verifica uno scambio in questa
zona. Quindi, misurando la frequenza di
ricombinazione si può ottenere una
misura della distanza di mappa tra
coppie di geni.
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Mappa di associazione
165Porpora vestigiale
pr pr/ vg vg
23Porpora Normale
pr pr/ vg+vg
21Rosso vestigialepr+ pr/ vg vg
191Rosso Normalepr+ pr/ vg+vg
osservatiSturtevant uso’ la percentuale di ricombinanti come indice quantitativo della distanza lineare di 2 geni
21+23/400=0.1111%
pr vg
11.0
locus locus
u.m. unita’ di mappa o cM
F2
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La Mappatura genetica serve per
1.conoscere il genoma di una specie e confrontarlo con quello di specie vicine
2. Diagnosticare malattie genetiche associate a determinati geni (marcatori)
3. Migliorare varietà di interessezootecnico o agrario mediantecostruzione di ceppi particolari
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Frequenza di ricombinazione (FR) di 0.01 (1%) corrisponde per definizione a 1 u.m.o 1 centiMorgan (cM)
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Incrocio a tre punti
P
F1
F2
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Distanza ed ordine dei loci sc/ec/cv295/3248=0.09 x 100= 9% sc-ec
342/3248=0.105 x 100= 10.5% ec-cv
633/3248=0.195 x 100=19.5% sc-cv
sc ec
9.0
locus locus
ec cv
10.5
locus locus
sc cv
19.5
locus locus
sc cv
19.5
locus locusec
locus
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Altro casosc/sc ec/ec vg/vg X sc+/sc+ ec+/ec+ vg+/vg+
sc/sc+ ec/ec+ vg/vg+Triplo eterozigote
sc/sc ec/ec vg/vgXTriplo recessivo
P
F1
F2
16sc+ ec vg
14sc ec+ vg+
14sc+ ec vg+
233sc+ ec+ vg
12sc ec+ vg
1008
243sc ec vg+
241sc+ ec+ vg+
235sc ec vg Non c’e’ rapporto 1:1:1:1:1:1:1:1
Geni associatiParentali che assortiscono in
modo indipendente
con vg
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Distanza ed ordine dei loci sc/ec/vg12+14+14+16/1008=0.055 x 100= 5.5% sc-ec
243+233+12+14/1008=0.498 x 100~ 50% ec-vg
243+233+14+16/1008=0.50 x 100=50% sc-vg
sc ec
5.5
locus locus
ec vg
50
locus locus
sc vg
50
locus locus
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Se la frequenza di ricombinazione e’ pari al 50% ci dobbiamo chiedere se i geni sono associati o no-> situazione limite
In ogni caso, poiche’ la frequenza dei ricombinanti e’ 50%, anche se sono sullo stesso cromosoma, li consideriamo NON ASSOCIATI, poiche’ la loro distanza e’ talmente grande che la probabilita’ che intervenga un crossing over a disgiungerli e’ appunto pari al 100%. Allora il 50% dei gameti sara’ di tipo parentale (non avra’ subito il crossing over) e il 50% di tipo ricombinante (avra’ subito il crossing over)
A B
a b
A b
a B
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Altro caso IIv+/v+ cv/cv ct/ct X v/v cv+/cv+ ct+/ct+
v/v+ cv/cv+ ct/ct+Triplo eterozigote
v/v cv/cv ct/ctXTriplo recessivo
P
F1
F2
5v+ cv ct+
3v cv+ ct
94v+ cv+ ct+
40v+ cv+ ct
89v cv ct
1448
45v cv ct+
592v+ cv ct
580v cv+ ct+ Non c’e’ rapporto 1:1:1:1:1:1:1:1
Geni associati
V=vermillion
cv= crossveinless
ct= cute (ali con bordi sfrangiati)
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Distanza ed ordine dei loci v/cv/ct45+40+89+94/1448=0.185 x 100= 18.5% v-cv
89+94+3+5/1448=0.132 x 100~ 13.2% v-ct
45+40+3+5/1448=0.064 x 100=6.4% cv-ct
v cv
18.5
locus locus
v ct
13.2
locus locus
cv ct
6.4
locus locus
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cv v
18.5
locus locuslocus
ct
19.6
5v+ ct+ cv
3v ct cv+
classi rare
592v+ ct cv
580v ct+ cv+
parentali
P
P
Doppio crossing-over
Ricombinanti che derivano da 2 eventi di crossing-over
0.064 0.132
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Poiche’ si assume che la distanza di mappa e’funzione lineare del numero di crossing-over, ovvero dei ricombinanti, nel calcolare la distanza v-cv dobbiamo considerare i ricombinanti rari 2 volte, perche’ prodotti da 2 processi di crossing-over da cui:
45+40+89+94+3+3+5+5/1448=0.196 x 100= 19.6% v-cv
E’ stato possibile individuare il doppio crossing-over poiche’ il gene intermedio ct e’ in eterozigosi
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interferenza
Nella maggior parte degli organismi superiori la formazione di un chiasma riduce la probabilità che un altro chiasma si formi in una regione adiacente. Il risultato netto di questa interferenza consiste nella formazione di un minor numero di doppi crossing over di quelli che si attendono rispetto alla distanza di mappa
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dimostrazioneSecondo la regola del prodotto, il prodotto delle frequenze dei
ricombinanti nelle regioni adiacenti dovrebbe essere uguale allafrequenza dei doppi ricombinanti
Prodotto dei singoli crossing over0.132 x 0.064=0.0084 x 1448= 12.23 ricombinanti
Ma in realta’ se ne formano solo 8!
Stima dell’interferenza I = 1 –c.o.c =1 –
Frequenza doppi ricombinanti osservata
Frequenza doppi ricombinanti attesac.o.c.= coefficiente di
coincidenza
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interferenza
AB BCAC
singolo doppio singolo
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esempioIl cromosoma 3 del mais contiene 3 loci che possono portare gli alleli b e b+, v e v+, Ig e Ig+. Un incrocio di tripli recessivi con triplo eterozigote F1 per i 3 geni dà origine alla progenie F2 indicata in tabella. Dite qual e’ la sequenza dei geni sul cromosoma, calcolate la distanza di mappa tra i geni ed il coefficiente di coincidenza.
18b v Ig22+ + +66b v +
112+ v +74+ + Ig
1000
128b + Ig275b + +305+ v Ig Parentali + v Ig triplo
b + + eterozigote
Si calcola la distanza b-v in base al numero dei ricombinanti:
74+66+22+18/1000=0.18 x 100= 18 u.m.
Si calcola la distanza b-Ig in base al numero dei ricombinanti:
128+112+22+18/1000=0.28= 28 u.m.
F2
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Si calcola la distanza v-Ig in base ai ricombinanti:
128+112+74+66/1000=0.38= 38 u.m.
Da cui si ricava che: v b Ig
18 u.m 28 u.m
38 u.m.
18 u.m. + 28 u.m.=
46 u.m.
Nel calcolo v-Ig abbiamo omesso i doppi ricombianti. Sapendo ora che la sequenza dei geni e’ v-b-Ig possiamo individuare i doppi ricombinanti, ovvero le classi piu’ rare:
v-Ig=128+112+74+66+22+22+18+18/1000=
0.46= 46 u.m.
I parentali diventano:
v + Ig+ b +
+ b +
v + Ig
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Calcolo del coefficiente di coincidenza
Frequenza doppi ricombinanti osservata
Frequenza doppi ricombinanti attesa
c.o.c.=
c.o.c.=
(0.18 x 0.28) x 1000
22+18=
40
50.4= 0.79
Interferenza = I = 1-0.79=0.21= 21%
=
FDR(O)
FDR(A)
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Natura del crossing overNel crossing over avviene uno scambio fisico di pezzi di
cromosomi omologhi (Creighton, McClintock)
Cromosoma 9 del mais
Due forme: una aberrante e una normale
Colore del seme
Composizione dell’endosperma
Studio di 2 loci sul cromosoma 9 del mais
nodo
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x
Evidenza di scambi cromosomali nei ricombinanti
CC /wx wx cc /Wx Wx
Cc /Wx wx
Ricombinanti o
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Mappa del cromosoma X di Drosophila
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Linearita’ tra frequenza di ricombinazione e distanza di mappa
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Linearita’ tra frequenza di ricombinazione e distanza di mappa
Quando 2 geni sono molto distanti tra loro si perde la linarita’ tra frequenza di crossingover e distanza di mappa. Si stima che fino a 20 cM c’e’ linearita’.
Quando le distanze tra geni sono molto grandi si tende a sottostimarle se ci si basa sulla frequenza di ricombinazione
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Il crossing-over è molto meno frequente nella regione cromosomica intorno al
centromero e nelle altre regioni eterocromatiche ( = povere di
geni ), rispetto alle regioni eucromatiche
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Crossing over mitoticoScoperto in Drosophila
y colore giallo del corpo
sn setole corte e ricurve
incrocio
y+ sn/y+ sn x y sn+/Y
y+ sn/y sn+♀ ♂
♀ selvatiche
(Stern)
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Macchie gemelle in Drosophila(Stern)
In femmine y+ sn / y sn+
Troppo frequenti per essere un evento mutazionale
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Crossing over mitotico
Macchia gialla
Macchia singed
Separazione dei cromatidi fratelli
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Mappe di linkage dei cromosomi umani
Problematiche:
- Impossibile eseguire incroci controllati con individui testcross (piu’ facile per l’X)
- Numero limitato di figli, insufficiente per eseguire un calcolo affidabile delle distanze di mappa
- I geni umani posso essere separati da distanze molto grandi (necessita’ di individuare dei marcatori)
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Mappe di associazione tramite analisi di alberi genealogici
Gli individui che manifestano la sindrome nail-patella(dominante) NPS1 presentano il gruppo B
4/13=0.30=30%=30 u.m.
In realta’ la distanza NSP1-locus dei gruppi sanguigni e’10 u.m.
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MAPPAGGIO FISICOlocalizza i geni sui cromosomi dando una
posizione espressa con misure fisiche reali, cioè il numero di paia di basi (bp).1) a bassa risoluzione: permette di posizionare un gene su un cromosoma o in una regione del cromosoma; 2) ad alta risoluzione: localizza i geni con una precisione fino al singolo nucleotide
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Mappaggio mediante ibridazione in situ con fluorescenza (FISH)Metodo diretto di visualizzazione della posizione di un gene. Impiega sonde a DNA o RNA marcate con fluorocromi che ibridano su DNA denaturato di cromosomi metafasici.I cromosomi marcati vengono osservati al microscopio a fluorescenza.
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Un gene clonato puo’ essere usato per trovarne la posizione sui cromosomi mediante FISH
Tre diverse specie di conifere
Sonde: 5, 8S, 26S, 18S rosa; SGR-31 DNA satellite (verde)
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Mappatura dei geni umani mediante ibridi somatici uomo-topo
I cromosomi umani vengono persi
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Per eliminare gli ibridi topo/topo o uomo/uomo e per evitare la perdita dei cromosomi umani si usa un terreno selettivo
Terreno HATH hypoxantina
A aminopterina blocca la sintesi de novo degli acidi nucleici
T timidina
Le cellule murine mancano
dell’enzima TK fornito dalle
cellule umane mentre le cellule umane mancano
dell’hgprtfornito dalle
murine
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Selezione degli ibridi somatici col sistema HAT
Mutante HGPRT-
HGPRTipoxantina->guanina
Via di salvataggio delle purine
Mutante TK-Timidinachinasi (TK)Timidina->acido
timidilico
Via di salvataggio delle pirimidine
aminopterinaprecursori semplici
normale
bloccata daSi ottiene daVie di sintesi dei nucleotidi
Mediante selezione in terreno HAT si possono ottenere ibridi somatici contenenti il gene umano che conferisce resistenza
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Mappatura dei geni umani mediante ibridi somatici uomo-topo
Sendai virus o PEG
Estrazione dei cromosomi e loro analisi per l’individuazione
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Una volta selezionate le cellule ibride vengono organizzate in una banca di linee che contengono ciascun differente
cromosoma umano
La presenza di uno specifico prodotto genico e’correlata con la presenza di uno specifico
cromosoma umano
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Gli ibridi uomo/topo sono utili per determinare marcatori biochimici di cui può essere fatto uno
screening a livello cellulare con approccio biochimico, come pure per proteine di superficie
(FACS)
Ibrido con antigene umano di superficie