Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di...

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Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad alta risoluzione Anatoly P. Sobolev Istituto di Metodologie Chimiche, CNR, Roma

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Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad alta

risoluzione

Anatoly P SobolevIstituto di Metodologie Chimiche

CNR Roma

Vari approcci allrsquoanalisi degli alimenti tramite NMR

Analisi ldquotargetrdquo

Profilo metabolico

Fingerprinting metabolico

Metabolomica

Analisi quantitativa di singoli metaboliti

Analisi di gruppi di metaboliti

Spettri NMR come le impronte digitali dellrsquoalimento

Analisi del metaboloma

Corredo completo dei metaboliti presenti in una cellula tessuto ecc(formati durante tutti i processi metabolici

Metaboloma

+ durante la conservazione e lavorazione)

NMR metabolomica la punta dellrsquoiceberg

5000 -10000

50 500 ndash 600 MHz NMRgt 10 μM

Numero di metaboliti

Estrazione

Metodologia NMR nellrsquoanalisi degli alimentiAlimenti

Liquidi Lrsquoanalisi diretta Solidi semisolidi liquidi Estrazione

Acquisizione degli spettri NMR ad alta risolizione in fase liquida

Assegnazione degli spettri

Lrsquoanalisi quantitativa

Lrsquoanalisi statistica

Identificazione di metaboliti

Distinzione di varietagrave

Valutazione della qualitagrave

Autenticazione dellrsquoorigine

Preparazione dei campioni

Come trasformare un alimento in un campione NMR

bull ldquothe optimum preparation protocol should be developed on a case-by case basishellipdepending on the foodstuff on the characteristic of target metabolites the numbering of metabolites being examined and their respective quantitiesrdquo

E Fukusaki A Kobayashi Plant metabolomics Potential for practical operation J Biosci Bioeng 100 (2005) 347-354

Preparazione dei campioni

Birra Vino Succhi di frutta Salsa di soia Aceto Oli vegetali Latte

Liquidi lrsquoanalisi diretta

Solidi o semi-solidiEstrazione

Frutta e verdura Cereali Formaggi Miele Burro margarina PesceCarne Fungi

Tegrave

Caffeacute

Latte

Campione NMR = alimento liquido estratto + solvente deuterato

EstrazioneEstrazione diretta con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Uva

Pomodori

Brassica rapa

Patate

Mais

Tegrave

Tegrave

Caffegrave

Lattuga pomodori

Farina di grano

Mozzarella di bufala

D2O CD3OD D2Otampone

EstrazioneEstrazione con un solvente miscela di solventiCentrifugazione filtrazione(Separazione di fasi)EvaporazioneliofilizzazioneRicostruzione della soluzione con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Kiwi lattuga Mais

Latte

Mozzarella di bufala

Grana Padano

Salmone spigola

Tartufo

CHCl3CH3OHH2O

EG Blighamp WJ Dyer 1959 A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol1959 37 911-917

metanoloH2OacetonitrileH2OHClO4H2O

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 2: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Vari approcci allrsquoanalisi degli alimenti tramite NMR

Analisi ldquotargetrdquo

Profilo metabolico

Fingerprinting metabolico

Metabolomica

Analisi quantitativa di singoli metaboliti

Analisi di gruppi di metaboliti

Spettri NMR come le impronte digitali dellrsquoalimento

Analisi del metaboloma

Corredo completo dei metaboliti presenti in una cellula tessuto ecc(formati durante tutti i processi metabolici

Metaboloma

+ durante la conservazione e lavorazione)

NMR metabolomica la punta dellrsquoiceberg

5000 -10000

50 500 ndash 600 MHz NMRgt 10 μM

Numero di metaboliti

Estrazione

Metodologia NMR nellrsquoanalisi degli alimentiAlimenti

Liquidi Lrsquoanalisi diretta Solidi semisolidi liquidi Estrazione

Acquisizione degli spettri NMR ad alta risolizione in fase liquida

Assegnazione degli spettri

Lrsquoanalisi quantitativa

Lrsquoanalisi statistica

Identificazione di metaboliti

Distinzione di varietagrave

Valutazione della qualitagrave

Autenticazione dellrsquoorigine

Preparazione dei campioni

Come trasformare un alimento in un campione NMR

bull ldquothe optimum preparation protocol should be developed on a case-by case basishellipdepending on the foodstuff on the characteristic of target metabolites the numbering of metabolites being examined and their respective quantitiesrdquo

E Fukusaki A Kobayashi Plant metabolomics Potential for practical operation J Biosci Bioeng 100 (2005) 347-354

Preparazione dei campioni

Birra Vino Succhi di frutta Salsa di soia Aceto Oli vegetali Latte

Liquidi lrsquoanalisi diretta

Solidi o semi-solidiEstrazione

Frutta e verdura Cereali Formaggi Miele Burro margarina PesceCarne Fungi

Tegrave

Caffeacute

Latte

Campione NMR = alimento liquido estratto + solvente deuterato

EstrazioneEstrazione diretta con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Uva

Pomodori

Brassica rapa

Patate

Mais

Tegrave

Tegrave

Caffegrave

Lattuga pomodori

Farina di grano

Mozzarella di bufala

D2O CD3OD D2Otampone

EstrazioneEstrazione con un solvente miscela di solventiCentrifugazione filtrazione(Separazione di fasi)EvaporazioneliofilizzazioneRicostruzione della soluzione con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Kiwi lattuga Mais

Latte

Mozzarella di bufala

Grana Padano

Salmone spigola

Tartufo

CHCl3CH3OHH2O

EG Blighamp WJ Dyer 1959 A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol1959 37 911-917

metanoloH2OacetonitrileH2OHClO4H2O

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 3: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

NMR metabolomica la punta dellrsquoiceberg

5000 -10000

50 500 ndash 600 MHz NMRgt 10 μM

Numero di metaboliti

Estrazione

Metodologia NMR nellrsquoanalisi degli alimentiAlimenti

Liquidi Lrsquoanalisi diretta Solidi semisolidi liquidi Estrazione

Acquisizione degli spettri NMR ad alta risolizione in fase liquida

Assegnazione degli spettri

Lrsquoanalisi quantitativa

Lrsquoanalisi statistica

Identificazione di metaboliti

Distinzione di varietagrave

Valutazione della qualitagrave

Autenticazione dellrsquoorigine

Preparazione dei campioni

Come trasformare un alimento in un campione NMR

bull ldquothe optimum preparation protocol should be developed on a case-by case basishellipdepending on the foodstuff on the characteristic of target metabolites the numbering of metabolites being examined and their respective quantitiesrdquo

E Fukusaki A Kobayashi Plant metabolomics Potential for practical operation J Biosci Bioeng 100 (2005) 347-354

Preparazione dei campioni

Birra Vino Succhi di frutta Salsa di soia Aceto Oli vegetali Latte

Liquidi lrsquoanalisi diretta

Solidi o semi-solidiEstrazione

Frutta e verdura Cereali Formaggi Miele Burro margarina PesceCarne Fungi

Tegrave

Caffeacute

Latte

Campione NMR = alimento liquido estratto + solvente deuterato

EstrazioneEstrazione diretta con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Uva

Pomodori

Brassica rapa

Patate

Mais

Tegrave

Tegrave

Caffegrave

Lattuga pomodori

Farina di grano

Mozzarella di bufala

D2O CD3OD D2Otampone

EstrazioneEstrazione con un solvente miscela di solventiCentrifugazione filtrazione(Separazione di fasi)EvaporazioneliofilizzazioneRicostruzione della soluzione con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Kiwi lattuga Mais

Latte

Mozzarella di bufala

Grana Padano

Salmone spigola

Tartufo

CHCl3CH3OHH2O

EG Blighamp WJ Dyer 1959 A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol1959 37 911-917

metanoloH2OacetonitrileH2OHClO4H2O

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 4: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Metodologia NMR nellrsquoanalisi degli alimentiAlimenti

Liquidi Lrsquoanalisi diretta Solidi semisolidi liquidi Estrazione

Acquisizione degli spettri NMR ad alta risolizione in fase liquida

Assegnazione degli spettri

Lrsquoanalisi quantitativa

Lrsquoanalisi statistica

Identificazione di metaboliti

Distinzione di varietagrave

Valutazione della qualitagrave

Autenticazione dellrsquoorigine

Preparazione dei campioni

Come trasformare un alimento in un campione NMR

bull ldquothe optimum preparation protocol should be developed on a case-by case basishellipdepending on the foodstuff on the characteristic of target metabolites the numbering of metabolites being examined and their respective quantitiesrdquo

E Fukusaki A Kobayashi Plant metabolomics Potential for practical operation J Biosci Bioeng 100 (2005) 347-354

Preparazione dei campioni

Birra Vino Succhi di frutta Salsa di soia Aceto Oli vegetali Latte

Liquidi lrsquoanalisi diretta

Solidi o semi-solidiEstrazione

Frutta e verdura Cereali Formaggi Miele Burro margarina PesceCarne Fungi

Tegrave

Caffeacute

Latte

Campione NMR = alimento liquido estratto + solvente deuterato

EstrazioneEstrazione diretta con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Uva

Pomodori

Brassica rapa

Patate

Mais

Tegrave

Tegrave

Caffegrave

Lattuga pomodori

Farina di grano

Mozzarella di bufala

D2O CD3OD D2Otampone

EstrazioneEstrazione con un solvente miscela di solventiCentrifugazione filtrazione(Separazione di fasi)EvaporazioneliofilizzazioneRicostruzione della soluzione con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Kiwi lattuga Mais

Latte

Mozzarella di bufala

Grana Padano

Salmone spigola

Tartufo

CHCl3CH3OHH2O

EG Blighamp WJ Dyer 1959 A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol1959 37 911-917

metanoloH2OacetonitrileH2OHClO4H2O

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 5: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Come trasformare un alimento in un campione NMR

bull ldquothe optimum preparation protocol should be developed on a case-by case basishellipdepending on the foodstuff on the characteristic of target metabolites the numbering of metabolites being examined and their respective quantitiesrdquo

E Fukusaki A Kobayashi Plant metabolomics Potential for practical operation J Biosci Bioeng 100 (2005) 347-354

Preparazione dei campioni

Birra Vino Succhi di frutta Salsa di soia Aceto Oli vegetali Latte

Liquidi lrsquoanalisi diretta

Solidi o semi-solidiEstrazione

Frutta e verdura Cereali Formaggi Miele Burro margarina PesceCarne Fungi

Tegrave

Caffeacute

Latte

Campione NMR = alimento liquido estratto + solvente deuterato

EstrazioneEstrazione diretta con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Uva

Pomodori

Brassica rapa

Patate

Mais

Tegrave

Tegrave

Caffegrave

Lattuga pomodori

Farina di grano

Mozzarella di bufala

D2O CD3OD D2Otampone

EstrazioneEstrazione con un solvente miscela di solventiCentrifugazione filtrazione(Separazione di fasi)EvaporazioneliofilizzazioneRicostruzione della soluzione con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Kiwi lattuga Mais

Latte

Mozzarella di bufala

Grana Padano

Salmone spigola

Tartufo

CHCl3CH3OHH2O

EG Blighamp WJ Dyer 1959 A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol1959 37 911-917

metanoloH2OacetonitrileH2OHClO4H2O

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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Preparazione dei campioni

Birra Vino Succhi di frutta Salsa di soia Aceto Oli vegetali Latte

Liquidi lrsquoanalisi diretta

Solidi o semi-solidiEstrazione

Frutta e verdura Cereali Formaggi Miele Burro margarina PesceCarne Fungi

Tegrave

Caffeacute

Latte

Campione NMR = alimento liquido estratto + solvente deuterato

EstrazioneEstrazione diretta con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Uva

Pomodori

Brassica rapa

Patate

Mais

Tegrave

Tegrave

Caffegrave

Lattuga pomodori

Farina di grano

Mozzarella di bufala

D2O CD3OD D2Otampone

EstrazioneEstrazione con un solvente miscela di solventiCentrifugazione filtrazione(Separazione di fasi)EvaporazioneliofilizzazioneRicostruzione della soluzione con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Kiwi lattuga Mais

Latte

Mozzarella di bufala

Grana Padano

Salmone spigola

Tartufo

CHCl3CH3OHH2O

EG Blighamp WJ Dyer 1959 A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol1959 37 911-917

metanoloH2OacetonitrileH2OHClO4H2O

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 7: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

EstrazioneEstrazione diretta con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Uva

Pomodori

Brassica rapa

Patate

Mais

Tegrave

Tegrave

Caffegrave

Lattuga pomodori

Farina di grano

Mozzarella di bufala

D2O CD3OD D2Otampone

EstrazioneEstrazione con un solvente miscela di solventiCentrifugazione filtrazione(Separazione di fasi)EvaporazioneliofilizzazioneRicostruzione della soluzione con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Kiwi lattuga Mais

Latte

Mozzarella di bufala

Grana Padano

Salmone spigola

Tartufo

CHCl3CH3OHH2O

EG Blighamp WJ Dyer 1959 A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol1959 37 911-917

metanoloH2OacetonitrileH2OHClO4H2O

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 8: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

EstrazioneEstrazione con un solvente miscela di solventiCentrifugazione filtrazione(Separazione di fasi)EvaporazioneliofilizzazioneRicostruzione della soluzione con un solvente deuteratoCentrifugazione filtrazione

Kiwi lattuga Mais

Latte

Mozzarella di bufala

Grana Padano

Salmone spigola

Tartufo

CHCl3CH3OHH2O

EG Blighamp WJ Dyer 1959 A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol1959 37 911-917

metanoloH2OacetonitrileH2OHClO4H2O

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 9: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Solventi deuterati nella spettroscopia 1H NMR

bull La risonanza del deuterio serve per bloccare una frequenza di riferimento

bull Il solvente completamente deuterato non mostra alcun segnale nello spettro 1H NMR

La scelta del solvente

Composti polari Composti non polari

D2O D2OCD3OD DMSO-d6 CD3ODCDCl3 CDCl3 CDCl3DMSO

Aminoacidi zuccheri

acidi organici

composti idrosolubili polifenoli

composti polari e non

polari

fosfolipidi glucolipidi chlorofilla

lipidi carotenoidi

steroliSucchi di

frutta birra miele

Frutta verdura tegrave carne

Miele aceto lattuga Olio drsquooliva pesce burro

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 10: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Effetto di pH

Utilizzare un tamponeAggiustare pH con HCl NaOH

657585

AH + H2O A- + H3O+

AH A-Posizione del segnale

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 11: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Acquisizione degli spettri 1H NMR

bull Numero di scansioni egrave sufficiente per un buon rapporto SN

bull Il tempo tra due scansioni egrave sufficiente per il rilassamento di tutti i segnali (t ge 5T1 dove T1 egrave tempo di rilassamento longitudinale

Alcuni aspetti da verificare

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 12: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Spettri 1H NMR Estratti acquosi

Lattuga

Spigola

Acidi organiciaminoacidi

Zuccheri

Acido lattico

CRPCRTMAOTaurinaGly-bet

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 13: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Assegnazione degli spettri 1H NMR

bull Banchi dati dati della letteratura

bull Esperimenti 2D 1D-selettivi (correlazioni editing dello spettro)

bull Aggiunta degli standard

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 14: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

httpwwwbmrbwisceduBanche dati

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 15: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

httpwwwhmdbcaBanche dati

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 16: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

ldquoFittarerdquo lo spettro con gli spettri dei singoli metaboliti

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 17: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Assegnazione degli spettri 1H NMR

1D1H 1H con un filtro

in diffusione

DiffusionOrdered

SpectroscopY

2DCOSY TOCSY

NOESY 1H-13C HSQC

HMBC

Esperimenti di correlazione editing dello spettro

Trovare correlazione tra i segnali differenti per semplificare lo spettro Separare i segnali sovrapposti (seconda dimensione editing dello spettro)

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 18: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Editing dello spettro con un filtro in diffusione

Lo spettro 1H NMR di un estratto acquoso di

tartufo x 64

a

b

c1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

1520253035404550 ppm

Un filtro in diffusione

polisaccharidi

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 19: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

DOSY

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2OH

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

H

OH

H

H

OHCH 2

O

OCH 2OH

HH

OHH

OH

OH

H

H

OO

OH

OHH

H

OO

OH

OH

H

H

H

H

HOOC

HOOC

Inulina A

Inulina B

Acido cicorico

Lo spettro DOSY di un estratto acquoso di lattuga

Mw = 504Mw = 828

D ~ 1 Mw05

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 20: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Esperimenti 2D COSY

COSY correla protoni tramite gli accoppiamenti geminali e vicinali (i picchi fuori dal diagonale)

A B C

-CH2-CH2-CH2-Lo spettro COSY di un estratto acquoso di kiwi

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 21: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Esperimenti 2D 1H-13C HSQC

1H-13C HSQC correla protoni e carboni legati direttamente

-CH -CH2 -CH3

Lo spettro 1H-13C HSQC della frazione lipidica in lattuga

ppm

343638404244464850 ppm

50

60

70

80

90

100

C1 G

DG

D

C1 G

DG

DC1

SGD

G

CH N PE2

CHD OD2

PC

13C

1H

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 22: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Lrsquoanalisi quantitativa gli esempi di dati NMR

Binning ndashsuddivisione dello spettro in piccoli regioni (002- 006 ppm) con il calcolo dellrsquoarea per ogni bin

integrale

intensitagrave

525530535540545 ppm

C ~ I nH

I ndash lrsquoarea sotto il segnalenH ndash numero dei protoni equivalenti

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

Page 23: Analisi degli alimenti tramite la Risonanza Magnetica ad ... · Rispetto ai metodi di classificazione, non solo i gruppi non sono noti a priori, ma non è neanche detto che esista

Lrsquoanalisi quantitativa elaborazione di dati NMR

Gli esempi di dati NMR

Tipo di dati Numero di variabili che si ottiene

Tutti i punti dello spettro 10000 - 30000

Bucketing (binning) 500 - 200

Integrali dei segnali selezionati

1 - 100

Intensitagrave (ampiezze) dei segnali selezionati

1 - 100

dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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dati NMR

Analisi statistica

Analisi multivariata

Analisi esplorativa non supervisionata (PCA

TCAhellip)

Analisi univariata

ANOVA t-test

Analisi supervisionata

ClassificazioneRegressione (LDA PLS-DA OPLS-DA SIMCA KNN PLS O-PLS)

ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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ANOVA (Analisi della varianza)Permette di confrontare due o piugrave gruppi di dati confrontando la variabilitagrave interna a questi gruppi con la variabilitagrave tra i gruppi

Si usano i parametri F e p-level per determinare la selezione delle variabili discriminanti F rappresenta il rapporto tra la variabilitagrave intergruppo e la variabilitagrave intragruppo Maggiore saragrave il valore di F e maggiore saragrave il potere discriminante di quella variabileIl p-level dagrave la probabilitagrave di errore che si accetta nel risultato un basso p-level corrisponde ad unrsquoalta probabilitagrave che la differenza tra i gruppi sia significante

ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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ANOVA lrsquoesempio ILe differenze del profilo metabolico tra due varietagrave di lattuga (transgenica e convenzionale)

ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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ANOVA lrsquoesempio IIDiscriminazione tra il succo drsquoarancia e il prodotto di lavaggio della polpa (adulterazione)Distribuzione dellrsquointensitagrave del segnale di dimetilprolina in vari campioni

Grafico del valore di F su tutti i punti

Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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Analisi esplorativa PCA (Analisi delle componenti principali)

Lrsquoanalisi delle componenti principali si propone di identificare a partire dai dati delle ldquodirezionirdquo privilegiate tali che lungo esse si concentri la maggior parte dellrsquoinformazione presenteIn questo modo il numero di queste nuove variabili (componenti principali) da utilizzare per descrivere i dati saragrave significativamente minore del numero di determinazioni inizialiOgnuna delle componenti principali egrave una combinazione lineare delle variabili sperimentaliDa un punto di vista matematico questo tipo di costruzione egrave equivalente a ruotare gli assi dello spazio n-dimensionale tenendo fermi i punti (campioni)I coefficienti assegnati a ciascuna variabile nella definizione delle componenti principali sono calcolati in maniera tale da massimizzare la varianza lungo una determinata direzione

PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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PCA lrsquoesempio I

Spigole di mare aperto

Spigole di allevamento

Grafico di ldquoscoresrdquo Grafico di ldquoloadingsrdquo

PCA del profilo metabolico di spigola

Loadings indicano le variabili piugrave pertinenti al raggruppamentoIl livello di EPA DHA e TMAO egrave piugrave basso nelle spigole di allevamento

PCA lrsquoesempio IIPCA del profilo metabolico di succo drsquoorancia

PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

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MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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PC4 loadings

PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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PCA lrsquoesempio III

Separazione di birra secondo il tipo di malto (di grano o di orzo)

PCA lrsquoesempio IVPCA del profilo metabolico di filetti di manzo

Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

Lrsquoesempio di TCAEstratto lipidico del latte di bufala e di mucca

MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

bull I metodi di classificazione hanno lrsquoobiettivo di costruireun modello in grado di individuare la classe diappartenenza di ciascun campione sulla base di un certonumero di variabili indipendenti

bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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Analisi esplorativa TCA (Analisi dei cluster ad albero )

Utilizzato per trovare gli raggruppamenti (cluster) di campioni Rispetto ai metodi di classificazione non solo i gruppi non sono noti a priori ma non egrave neanche detto che esista un raggruppamento dei dati Al concetto qualitativo di similaritagrave (o dissimilaritagrave) tra gli oggetti egrave associata una grandezza numerica ndash la distanza tra gli oggetti nello spazio multidimensionale Inizialmente ogni osservazione (campione) egrave considerata un cluster a seacute stanteIl raggruppamento dei campioni procede riunendo le coppie di clusters via via piugrave simili fino a che tutti gli oggetti sono riuniti in un singolo gruppo

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MA Brescia et al JAOCS 81 (2004) 431‐436

Le analisi supervisionate classificazione

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bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

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Le analisi supervisionate classificazione

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Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

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bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

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Le analisi supervisionate classificazione

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bull A differenza dellrsquoanalisi dei clusters i metodi diclassificazione richiedono che le classi siano note apriori e che per una serie di campioni sia nota la classedi appartenenza

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA)

bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

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Lrsquoesempio di PLS-DA

Lrsquoanalisi della provenienza geografica del vino

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bull Egrave il metodo di classificazione piugrave semplice ma anche ilpiugrave utilizzato in letteratura

bull I criteri di classificazione fanno uso di combinazionilineari delle variabili originali

bull Le regioni dello spazio corrispondenti a due classidifferenti sono separate da iperpiani (lrsquoequivalente N-dimensionale di un piano)

Lrsquoanalisi discriminante lineare (LDA) un esempio

Lrsquoanalisi della provenienza geografica dellrsquoolio drsquooliva prodotto in regione Lazio

Lrsquoesempio di PLS-DA

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Il palazzo dei priori Pinacoteca Edificato alla fine del Duecento, Palazzo dei Priori è il più antico palazzo della città nato dallaggregazione di edifici.

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2° Rapporto sulla sostenibilità del Servizio Sanitario ... · Escludendo a priori un disegno occulto di smantellamento e privatizzazione del SSN, la ... la strada, la politica non

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CAPITOLO 1 - PREMESSA: POSIZIONAMENTO DELLA · 2018-07-25 · umana non è più rappresentato dall’orologio, ma dal computer: di conseguenza, più che ... esista un cambiamento

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Hydra - BlaulainHydra Gas può funzionare verticalmente sui piedini di appoggio oppure come indicato in figura, non può funzionare in altre posizioni Verificare che esista una presa

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Fiabe a teatro - BookSprint Edizioni · 2019. 12. 17. · 5 . Prefazione “Sia che esista o non esista, la magia è una bella cosa: se è usata per il bene . più felici ci può

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Proporzionale corretto e bipolarismo · funziona in un dato contesto sociopolitico", "non si può dire a priori quale sia il sistema elettorale . migliore"; il sistema proporzionale

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Modelli matematici di fenomeni aleatori Variabilità e ... · Sono esempi di grandezze variabili rappresentate da numeri a priori non noti" ... -Se X è una variabile aleatoria, di

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Un’applicazione della segmentazione a priori: l’algoritmo CHAID

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