Analisi degli alimenti(LMC-5: NITROSAMMINE)

Giorgio Bonaga

Anno Accademico 2010/2011

Laurea Magistrale in

CHIMICA

ANALISI DELLE NITROSAMMINE

NITROSAMMINEI nitroso-composti (NOC) comunemente chiamati nitrosoammine sono un gruppo di sostanze di diversa struttura chimica che contengono un gruppo funzionale -N-N=O. Si formano per reazione di un agente nitrosante (HNO2, NO2 NOCl, ecc.) con ammine secondarie, terziarie e più raramente quaternarie. L’attenzione verso queste sostanze è dovuta a tre ragioni:

1.molte nitrosammine sono potenti cancerogeni verso molte specie animali;2.molte nitrosammine sono risultate mutageniche; 3.livelli relativamente elevati di alcune nitrosammine si possono formare negli alimenti e bevande (birra, formaggi, ecc.), specialmente quelli conservati con nitriti e nitrati (carni).

La World Health Organization (WHO) raccomanda per gli alimenti freschi e affumicati una concentrazione di N-nitrosammine compresa tra 0,002 e 0,004 mg/kg (2 - 4 ppb).

La sintesi delle nitrosammine, come conseguenza dell’assunzione di nitriti e nitrati presenti negli alimenti, avviene nello stomaco dove si realizzano le condizioni ambientali (pH ≈ 3, elevata concentrazione degli ioni cloro del succo gastrico) per la sintesi del cloruro di nitrosile (Cl-N=O), il vero agente nitrosante della ammine secondarie e terziarie.

-+ Cl

cloruro di nitrosile

N OX + H2O

- ++ H+

H+

+ON

H

HONO OHNO O

N-nitroso-N,N-dialchilamminaN,N-dialchilammina

H X+N NR

RO+

RN

RH N OX

pH ≈ 3

I.

II.

I nitriti e nitrati sono additivi comuni delle carni conservate (bovine, suine, ecc.) perché svolgono 3 funzioni importanti:

1.impediscono lo sviluppo del Clostridium botulinum, un batterio la cui tossina è molto pericolosa (botulismo);2.reagiscono con la mioglobina (il pigmento della carne) per formare nitroso-mioglobina, di colore rosso vivo;3.sono sinergici con il NaCl, il sale impiegato nella salagione e nella stagionatura delle carni.

Anche se i nitrati sono più stabili e meno tossici dei nitriti, in realtà si convertono parzialmente in nitriti per azione della nitratoriduttasi. Per stabilire la congruità con le disposizioni di legge sul contenuto di nitrati (250 mg/kg carne) e di nitriti (150 mg/kg carne), una prima analisi è quella del dosaggio dei due sali. La determinazione dei nitriti e dei nitrati negli alimenti viene fatta, tradizionalmente, con metodi spettrofotometrici il cui limite è la scarsa sensibilità nella rivelazione di tracce di analiti e le frequenti interferenze della matrice. Attualmente si preferisce la HPLC che è più accurata, rapida e sensibile, anche se frequentemente questa tecnica richiede procedure laboriose per la precipitazione delle proteine e/o una purificazione del campione attraverso una SPE.

I nitriti e i nitrati vengono estratti da campioni (di carne) e analizzati direttamente.

10 g (salame o prosciutto) + 100 ml H2O

omogenizzazione estrazione (70-80°C, 15 min)

ESTRATTO

centrifugazione filtrazione

FILTRATO

HPLC

ANALISI DEI NITRITI E DEI NITRATI

Fig. 1 – HPLC (anion-exchange chromatography) di nitriti e nitrati nel prosciutto (A) e nel salame (B). PRECOLONNA: IonPac AS11 COLONNA: IonPac AG11 FASE MOBILE: soluzione 5 mM NaOH DETECTOR: UVD a 225 nm

A Bnitrito

nitrato

nitratonitrito

PRODOTTONITRITI

(mg/kg carne)NITRATI

(mg/kg carne)

salame 108 99

prosciutto 12 6

Le diverse tecniche analitiche utilizzate più tradizionalmente per il dosaggio delle nitrosammine volatili negli alimenti sono poco sensibili, come la TLC, o richiedono una strumentazione complessa e costosa (GC-MS e CL). Per questi motivi negli ultimi anni la HPLC, specialmente la tecnica RPC, è il metodo più utilizzato, nonostante la necessità di derivatizzare gli analiti per migliorare la sensibilità del rivelatore FLD.

ANALISI DELLE NITROSAMMINE

100 g (alimento) + 100 ml H2O

omogeneizzazione + 10 g NaCl + 10 g Na2SO4

+ 5 ml soluzione al 2% H2N-

C6H4-SO3H

+ 10 ml soluzione 1N H2SO4

distillazione in corrente di vapore

CONDENSATO

estrazione con CH2Cl2 (5 x 10 ml) filtrazione

FILTRATO

evaporazione derivatizzazione (dansyl chloride)

HPLC

Fig. 1 – HPLC di N-nitrosammine (dansyl-derivati) di estratto di salame. COLONNA: 80 mm x 2 mm, Zorbax ODS 5,0 m

FASE MOBILE: ACN:H2O = 2:1VELOCITA’ FLUSSO: 150 l/min

DETECTOR: FLD (ex 350 nm, em 530 nm)

1 = N-nitroso-N,N-dimetilammina (NDMA)2 = N-nitroso-N,N-dietilammina (NDEA)3 = N-nitroso-N,N-dipropilammina (NDPA)

Fig. 1 – TIC della GC-MS di nitrosammine estratte (SPE) da aringhe affumicate (hot). COLONNA: 30 m x 0,25 mm, HP-1701 f.t. 0,25 m TEMPERATURA: 35 (1’) 240 (1’), 50°C/min CARRIER GAS (He): 1,0 ml/min DETECTOR: MS (CI - NH3)

1 = N-nitroso-N,N-dimetilammina (NDMA)2 = N-nitroso-N,N-dietilammina (NDEA)3 = N-nitroso-pirrolidina (NPYR)4 = N-nitroso-piperazina (NPIP)5 = N-nitroso-N,N-dibutilammina (NDBA)

TOTALE = (1,0+1,2+0,8+1,3+1,1) = 5,4 ppb