Unicamprepositorio.unicamp.br/jspui/bitstream/REPOSIP/... · ADRIANA DELLA TORRE ÓLEO ESSENCIAL DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

ADRIANA DELLA TORRE

ÓLEO ESSENCIAL DE BACCHARIS TRIMERA (LESS.) DC.: ESTUDOS DE

GENOTOXICIDADE, MUTAGENICIDADE E METABOLISMO

CAMPINAS

2018

ADRIANA DELLA TORRE

ÓLEO ESSENCIAL DE BACCHARIS TRIMERA (LESS.) DC.: ESTUDOS DE

GENOTOXICIDADE, MUTAGENICIDADE E METABOLISMO

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da

Universidade Estadual de Campinas como parte

dos requisitos exigidos para a obtenção do título

de Doutora em Ciências, na área de Fármacos,

Medicamentos e Insumos para Saúde.

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA

ADRIANA DELLA TORRE E ORIENTADA PELA DRA.

ANA LÚCIA TASCA GOIS RUIZ.

Orientadora: Dra. ANA LÚCIA TASCA GOIS RUIZ

CAMPINAS

2018

Campinas, 30 de janeiro de 2018.

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz

Dra. Patrícia Santos Lopes

Dra. Denise Gonçalves Priolli

Dra. Fabiana Regina Nonato

Profa. Dra. Cristina Pontes Vicente

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra

no processo de vida acadêmica do aluno.

Dedicatória

A Deus pela vida, por ser minha Luz e ter proporcionado o

encontro com pessoas tão queridas e especiais.

Aos meus amados pais Osmar e Cecília pelo amor e constante

incentivo, pelos ensinamentos de vida, pela confiança e

presença em todas as escolhas e momentos.

Aos meus irmãos Henrique e Bruna pelo imprescindível apoio,

pelos momentos divertidos e compreensão nas ausências.

Aos meus avós João Batista (in memoriam) e Eugênia pelos

exemplos de vida.

À família Rosolen pelo carinho e apoio em grande parte do

Doutorado; em especial, à Ozeni, vó Cida, tia Lídia e ao

Rafael, companheiro fundamental que trouxe leveza e mais

cores a esta caminhada.

À família “DFT” que me acolheu de forma tão carinhosa ao

longo dos últimos sete anos.

Eu dedico esta tese, com todo carinho e gratidão.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, processo nº 2013/13196-

0) pela concessão das bolsas de Doutorado.

Ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (IB/UNICAMP),

ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas

(CPQBA/UNICAMP) e ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia de

Produtos Bioativos pela estrutura e oportunidade de realização deste trabalho.

À minha querida orientadora Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz pela oportunidade,

acolhimento, confiança em meu trabalho, pelos conhecimentos compartilhados, conselhos e

palavras de incentivo, enfim, pela paciência e carinho com os quais me orientou.

À querida Sirlene Valério Tinti, técnica da Divisão de Farmacologia e

Toxicologia (CPQBA/UNICAMP), pela eficiência, disposição, comprometimento em todas as

atividades e por contribuir com valiosas sugestões e ensinamentos na experimentação in vitro

e in vivo.

À bióloga Ana Possenti e à médica veterinária Dra. Karin Maia Monteiro pelos

cuidados e orientações na experimentação animal.

À Dra. Mary Ann Foglio e ao Dr. João Ernesto de Carvalho (FCF/UNICAMP)

pelas importantes contribuições ao grupo de pesquisa da Divisão de Farmacologia e

Toxicologia.

À Dra. Vera Lúcia Garcia e à doutoranda Adriana da Silva Santos de Oliveira, da

Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica (CPQBA/UNICAMP), pela colaboração e

contribuições na área fitoquímica.

Ao Dr. Ílio Montanari Jr., da Divisão de Agrotecnologia (CPQBA/UNICAMP),

pelo auxílio na obtenção da planta e ensinamentos sobre a espécie vegetal estudada.

À Dra. Glaucia Maria Pastore e a doutoranda Iramaia Angélica Neri-Numa, do

laboratório de Bioaromas e Compostos Bioativos (FEA/UNICAMP), pela colaboração nas

análises para determinação da capacidade antioxidante das amostras.

Ao Dr. Rodrigo Catharino e ao doutorando Carlos Melo, do Innovare Laboratório

de Biomarcadores (FCF/UNICAMP), pela parceria nas análises por ESI-MS de alta resolução

nos estudos de metabolização.

Ao Dr. Fábio Augusto e ao doutorando João Raul Belinato de Souza, do Laboratório

de Cromatografia Gasosa e Microtécnicas de Extração (IQ/UNICAMP), pelas contribuições nas

técnicas de microextração em fase sólida de voláteis dispersos em headspace.

À Dra. Yoko Oshima Franco (Universidade de Sorocaba), ao Dr. Daniel Fábio

Kawano (FCF/UNICAMP), à Dra. Denise Crispim Tavares (Universidade de Franca), à Dra.

Patrícia Santos Lopes (UNIFESP), à Dra. Denise Gonçalves Priolli (Universidade São

Franscisco), à Dra. Fabiana Regina Nonato (CPQBA/UNICAMP) e à Dra. Cristina Pontes

Vicente (IB/UNICAMP) pelas sugestões e contribuições apresentadas na análise prévia e na

defesa da tese.

À Caroline e à Letícia, estagiárias da Divisão de Química Orgânica e

Farmacêutica (CPQBA/UNICAMP), pelo apoio na coleta e processamento do material

vegetal; aos estagiários da Divisão de Farmacologia e Toxicologia (CPQBA/UNICAMP)

Lucas, Lidiane e Marine pelo coleguismo e prontidão nas atividades laboratoriais.

Aos queridos amigos da Divisão de Farmacologia e Toxicologia: Ellen de

Oliveira, Paula Paiva, Gisele Goulart, Lúcia Braga, Larissa Shiozawa, Giovanna Fiorito,

Giovanna Longato, Paula Monteiro, Ana Paula Hohne, Vanessa Helena, Mariana Cecchetto,

Humberto Spindola, Michelle Jorge, Luciana Bitencourt, Ilza de Oliveira, Tamires Sedano,

Mariana Sobreiro, Yumi Okubo, Gabriela Marchetti, Débora Vendramini, Lívia Garcia, Thais

Banzato, Rosanna Basting, Núbia Almeida, Ícaro Augusto, Elaine Cabral, Verônica Freitas,

Rogério Grando, Érica Bighetti, Tuany Cândido, Patrícia Bachiega e a todos com os quais

convivi durante o período de desenvolvimento da pesquisa, agradeço pelo acolhimento,

sugestões, contribuições, enfim, pela harmoniosa e agradável convivência.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a elaboração deste

trabalho, deixo meus sinceros agradecimentos.

RESUMO

A espécie Baccharis trimera (Less.) DC., conhecida como carqueja, é característica de

regiões tropicais e muito utilizada na medicina popular como anti-inflamatória, bem como

para disfunções estomacais e intestinais. Considerando o potencial uso medicinal do óleo

essencial de B. trimera cv. CPQBA 1 (OEBt), esta pesquisa teve por objetivo a continuação

do estudo fitoquímico e da avaliação de segurança do uso de OEBt. Foram comparados dois

lotes de OEs; o primeiro obtido por hidrodestilação das partes aéreas de B. trimera coletadas

mensalmente (Janeiro a Dezembro de 2014) no campo experimental do CPQBA/UNICAMP

(OEBt CPQBA) e o segundo adquirido comercialmente (OEBt comercial). A análise por

cromatografia gasosa acoplada a detector de massas identificou, como majoritários, os

compostos biciclogermacreno, E-cariofileno, germacreno D, β-pineno, β-mirceno e δ-

cadineno no OEBt CPQBA, ao passo que acetato de carquejila e palustrol foram identificados

em OEBt comercial. As amostras foram ainda comparadas quanto à capacidade antioxidante

in vitro através dos métodos 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•), 2,2’-azino-bis (3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•+

) e Oxygen Radical Absorbance Capacity

(ORAC). No teste ABTS•+

, OEBt comercial foi mais ativo do que o OEBt CPQBA, enquanto

no teste DPPH•, ambas as amostras apresentaram capacidade sequestrante similar; os

resultados também sugeriram a possível participação do -pineno, E-cariofileno, mirceno e -

pineno na atividade de OEBt CPQBA. No modo ORAC lipofílico, o OEBt CPQBA

apresentou atividade antioxidante superior ao OEBt comercial que pode ser, em parte,

atribuída ao E-cariofileno. No teste de atividade antiproliferativa, ambas as amostras OEBts

apresentaram perfil citostático similar frente às linhagens celulares tumorais e não tumorais.

Além disso, a mutagenicidade das amostras foi estudada através dos modelos de indução de

micronúcleos in vitro (células CHO-K1) e in vivo (medula óssea de camundongos) e o

potencial genotóxico foi avaliado por meio do teste Cometa alcalino em células CHO-K1. O

OEBt CPQBA induziu um aumento significativo na frequência de micronúcleos (MN) em

células CHO-K1, independente da concentração avaliada, enquanto o OEBt comercial

aumentou de maneira significativa a frequência de MN nas maiores concentrações; os

compostos mirceno, E-cariofileno e β-pineno podem ter, em parte, contribuído para a

mutagenicidade do OEBt CPQBA. A presença do sistema de metabolização exógena (fração

S9) reverteu os efeitos mutagênicos de ambos OEBts, sugerindo a formação de compostos

menos mutagênicos após metabolização. No teste Cometa alcalino in vitro, o OEBt CPQBA

foi menos genotóxico do que o OEBt comercial, sendo que o uso da fração S9 reduziu a

fragmentação do DNA induzida por OEBt comercial. O experimento de toxicidade oral aguda

determinou a dose de 800 mg/kg como dose máxima tolerável (DMT) para ambos OEBts e,

para tratamentos repetidos, selecionou-se a dose de 300 mg/kg. O OEBt comercial foi

mutagênico (aumento na frequência de MN em eritrócitos policromáticos, MNPCE) nas três

doses avaliadas, enquanto OEBt CPQBA induziu um aumento significativo na frequência de

MNPCE apenas nas duas maiores doses. Através da abordagem metabolômica de fingerprint

(ESI-MS seguido de análise de PLS-DA com VIP score) e da técnica de microextração em

fase sólida de voláteis dispersos em headspace, foi possível evidenciar diferenças na

composição química dos OEBts CPQBA e comercial antes e após o tratamento com fração

S9. Concluindo, o OEBt CPQBA apresenta um efeito antioxidante mais evidente, além de ser

menos genotóxico/mutagênico do que OEBt comercial; essas diferenças biológicas estão

relacionadas com as variações encontradas na composição química. Estes resultados indicam

uma potencial segurança no uso terapêutico de OEBt CPQBA, o que poderá ser comprovado

em estudos complementares.

ABSTRACT

Baccharis trimera (Less.) DC., known as “carqueja”, is a native species from tropical regions

widely used in folk medicine as anti-inflammatory and to treat stomach and intestinal

disorders. Considering the medicinal use of B. trimera cv. CPQBA 1 essential oil (EOBt), this

research aimed to continue the phytochemical study and safety evaluation of EOBt. This

study compared two batches of EOs; the first one was obtained by hydrodistillation of B.

trimera aerial parts collected from January to December 2014 in the CPQBA/UNICAMP

experimental field (EOBt CPQBA), while the second was a commercial sample (EOBt

commercial). Gas chromatography coupled to the mass detector identified as major

compounds the bicyclogermacrene, E-caryophyllene, germacrene D, β-pinene, β-myrcene and

δ-cadinene in EOBt CPQBA, whereas carquejyl acetate and palustrol were identified in EOBt

commercial. The samples were compared for in vitro antioxidant capacity using 2,2-diphenyl-

1-picrylhydrazyl (DPPH•), 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS

•+)

and Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC). In the ABTS•+

assay, EOBt commercial

was more active than EOBt CPQBA, while in the DPPH• assay, both samples presented

similar scavenger abilities; the results also suggested the possible participation of α-pinene, E-

caryophyllene, myrcene and β-pinene on EOBt CPQBA activity. In the ORAC lipophilic

mode, EOBt CPQBA showed higher antioxidant activity than EOBt commercial and this

antioxidant potential can be attributed, in part, to E-caryophyllene. In the antiproliferative

activity assay, both EOBts samples presented a similar cytostatic profile against the tumor and

non-tumor cell lines. In addition, the mutagenicity of the samples was studied using the in

vitro (CHO-K1 cells) and in vivo (mouse bone marrow) micronuclei induction models while

the genotoxic potential was evaluated by the in vitro (CHO-K1 cells) alkaline Comet assay.

EOBt CPQBA increased the micronuclei (MN) frequency in CHO-K1 cells, concentration-

independent, while EOBt commercial increased the MN frequency at the highest

concentrations; myrcene, E-caryophyllene and β-pinene may have contributed in part to the

EOBt CPQBA mutagenicity. The presence of an exogenous metabolic system (S9 fraction)

reversed both EOBts mutagenic effects, suggesting the formation of less mutagenic

compounds after metabolization. In the in vitro alkaline Comet assay, EOBt CPQBA was less

genotoxic than EOBt commercial and the use of S9 fraction reduced the EOBt commercial-

induced DNA fragmentation. The acute oral toxicity experiment determined 800 mg/kg as the

maximum tolerable dose (MTD) for both EOBts and from this, the dose of 300 mg/kg was

selected for repeated treatments. EOBt commercial was mutagenic (dose-dependent increase

in micronucleated polychromatic erythrocytes, MNPCE) in the three doses evaluated, while

EOBt CPQBA increased MNPCE frequency only in the two higher doses. Through the

fingerprint metabolomic approach (ESI-MS followed by PLS-DA analysis with VIP score)

and the solid-phase microextraction technique of headspace volatiles, it was possible to show

differences in the chemical composition of EOBts CPQBA and commercial before and after

treatment with S9 fraction. Concluding, EOBt CPQBA has a more evident antioxidant effect

in addition to being less genotoxic/mutagenic than EOBt commercial; these biological

differences are related to chemical composition variations. These results indicate potential

safety in the therapeutic use of EOBt CPQBA, which can be evaluated in complementary

studies.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Baccharis trimera (Less.) DC., cultivar CPQBA 1. .............................................. 25

Figura 2: Fotomicroscopia representativa da linhagem celular CHO-K1, aumento de 40x. .. 28

Figura 3: Esquema representativo do teste Cometa.............................................................. 30

Figura 4: Formação dos micronúcleos. ................................................................................ 31

Figura 5: Alterações detectadas pelo teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese. ...... 33

Figura 6: Processo de maturação das células da linhagem eritrocitária. ............................... 34

Figura 7: Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96 compartimentos

utilizada no teste de atividade antiproliferativa. .................................................................... 43

Figura 8: Esquema representativo das etapas do teste do micronúcleo, com e sem

metabolização. ..................................................................................................................... 46

Figura 9: Esquema representativo das etapas do teste Cometa, com e sem metabolização. .. 49

Figura 10: Sistema para extração do óleo essencial. ............................................................ 57

Figura 11: Perfil do rendimento dos óleos essenciais em bases fresca e seca (% m/m) em

função do mês de coleta ao longo de 2014. ........................................................................... 58

Figura 12: Comparação entre o teor de umidade (% m/m) das partes aéreas de B. trimera,

coletadas no período de Janeiro a Dezembro de 2014, e o rendimento de óleo essencial em

base seca (A) e base úmida (B)............................................................................................. 59

Figura 13: Estrutura química dos compostos majoritários identificados no

OEBt CPQBA 1. .................................................................................................................. 61

Figura 14: Estrutura química dos compostos majoritários identificados no

OEBt comercial. .................................................................................................................. 61

Figura 15: Grupos de compostos presentes nos óleos essenciais das partes aéreas de

Baccharis trimera. ............................................................................................................... 64

Figura 16: Atividade sequestradora de radical DPPH• das amostras de OEBt e padrões de

referência. ............................................................................................................................ 67

Figura 17: Atividade sequestradora de radical ABTS•+

das amostras de OEBt e padrões de

referência. ............................................................................................................................ 67

Figura 18: Resultados do ORAC das frações hidrofílica e lipofílica das amostras de OEBt e

padrões de referência. .......................................................................................................... 68

Figura 19: Atividade antiproliferativa in vitro dos óleos essenciais em painel de linhagens

humanas, tumorais e não-tumoral, após 48 horas de tratamento. ........................................... 71

Figura 20: Atividade antiproliferativa in vitro dos padrões de mono e sesquiterpenos

hidrocarbonetos frente à linhagem celular CHO-K1. ............................................................ 72

Figura 21: Atividade antiproliferativa in vitro dos óleos essenciais das partes aéreas de

Baccharis trimera (CPQBA e comercial), frente à linhagem celular CHO-K1. ..................... 73

Figura 22: Fotomicrografias representativas das células binucleadas analisadas no teste do

micronúcleo in vitro. ............................................................................................................ 74

Figura 23: Frequência de micronúcleos (%) em células binucleadas após exposição às

amostras OEBt CPQBA e OEBt comercial, sem ativação metabólica. .................................. 76


amostras OEBt CPQBA e OEBt comercial, com ativação metabólica. ................................. 78

Figura 25: Comparação do incremento em % de indução de micronúcleos do OEBt CPQBA

e OEBt comercial, em experimentos com (S9+) e sem (S9-) ativação metabólica. ................ 78

Figura 26: Fotomicrografias representativas dos cometas observados na análise dos óleos

essenciais de Baccharis trimera após 4 horas de tratamento, com (S9+) e sem S9 (S9-). ...... 83

Figura 27: Valores de % de DNA na cauda e de tail moment Olive obtidos através do teste

Cometa alcalino em células CHO-K1 tratadas com as amostras de OEBt por 4 horas,

sem S9. ................................................................................................................................ 84


Cometa alcalino em células CHO-K1 tratadas com as amostras de OEBt por 4 horas,

com S9. ................................................................................................................................ 85


essenciais de Baccharis trimera após 4 horas de tratamento, seguido de 20 horas de

incubação, com (S9+) e sem S9 (S9-). .................................................................................. 88


Cometa alcalino em células CHO-K1 tratadas com as amostras de OEBt por 4 horas, seguido

de 20 horas de incubação, sem S9. ....................................................................................... 89



de 20 horas de incubação, com S9. ....................................................................................... 91

Figura 32: Evolução da massa corporal de camundongos após o tratamento com OEs de

Baccharis trimera ao longo de 14 dias. ................................................................................ 93

Figura 33: Massa relativa (%) dos órgãos baço, rins, fígado, coração e pulmões de

camundongos Swiss após o tratamento em dose única com as amostras OEBt comercial e

OEBt CPQBA. ..................................................................................................................... 94

Figura 34: Massa relativa (%) dos órgãos baço, rins e fígado de camundongos Swiss após três

dias de tratamento com as amostras OEBt comercial e OEBt CPQBA. ................................. 95

Figura 35: Fotomicrografia representiva das células analisadas no teste do micronúcleo

in vivo. ................................................................................................................................. 99

Figura 36: Frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos (%MNPCE ± EP) em

camundongos Swiss, após três dias de tratamento com as amostras OEBt comercial e

OEBt CPQBA. ..................................................................................................................... 99

Figura 37: Classificação das amostras de óleo essencial de Baccharis trimera pelo modelo de

PLS-DA. ............................................................................................................................ 103

Figura 38: Classificação da amostra de óleo essencial de Baccharis trimera obtida a partir do

cultivar CPQBA 1 pelo modelo de PLS-DA. ...................................................................... 106

Figura 39: Classificação da amostra de óleo essencial de Baccharis trimera obtida

comercialmente pelo modelo de PLS-DA. .......................................................................... 106

Figura 40: Cromatogramas por CG/EM do OEBt CPQBA após técnica de microextração em

fase sólida. ......................................................................................................................... 108

Figura 41: Cromatogramas por CG/EM do OEBt comercial após técnica de microextração

em fase sólida. ................................................................................................................... 108


Baccharis trimera, antes e depois do tratamento com fração S9. ........................................ 110

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Linhagens celulares tumorais e não tumorais utilizadas nos testes de atividade

antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (DI).............................................. 42

Tabela 2: Dados mensais de massa coletada de partes aéreas de B. trimera cv. CPQBA 1,

massa de óleo essencial (OE) obtido, rendimento de OE em base seca e fresca, teor de

umidade das partes aéreas e precipitação pluviométrica. ....................................................... 58

Tabela 3: Compostos identificados, por CG/EM, nos óleos essenciais das partes aéreas de B.

trimera (Less.) DC. .............................................................................................................. 62

Tabela 4: Composição dos óleos essenciais de Baccharis trimera por grupos de

compostos. ........................................................................................................................... 63

Tabela 5: Capacidade antioxidante das amostras de OEBt e padrões de referência. ............. 66

Tabela 6: Valores de GI50 (em µg/mL) após o tratamento com o óleo essencial de B. trimera

frente às linhagens celulares. ................................................................................................ 70

Tabela 7: Valores de CBPI e RI das amostras do OEBt CPQBA e OEBt comercial, nos

sistemas com e sem metabolização exógena. ........................................................................ 75

Tabela 8: CBPI, RI e frequência de micronúcleos dos padrões de alguns compostos presentes

no OE de B. trimera. ............................................................................................................ 79

Tabela 9: Valores de referência de hemograma proposto para camundongos Swiss

fêmeas. ................................................................................................................................ 96

Tabela 10: Parâmetros hematológicos avaliados antes a após o tratamento de camundongos

Swiss fêmeas com OEBts. .................................................................................................... 97

Tabela 11: Compostos identificados nos óleos essenciais de B. trimera (Less.) DC. .......... 102

Tabela 12: Massas dos marcadores característicos apontados por PLS-DA, com VIP score a

partir de 1,5, na comparação entre OEBt CPQBA e OEBt comercial. ................................. 104


partir de 1,5, na comparação entre OEBts CPQBA e comercial metabolizada pela

fração S9. ........................................................................................................................... 105

Tabela 14: Compostos identificados por CG/EM após técnica de microextração em fase

sólida. ................................................................................................................................ 109

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

% m/m: porcentagem massa/massa

µg/mL: micrograma/mililitro

µL: microlitro

µm: micrômetro

µM: micromolar

µmol: micromol

3T3: linhagem celular de fibroblasto embrionário murino

786-0: linhagem celular de adenocarcinoma de rim

A549: linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar

AABTS: absorbância da solução de ABTS

Aam: absorbância da amostra teste

AAPH: 2,2’-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride

ABTS: radical 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

ADPPH: absorbância da solução de DPPH

ANOVA: análise de variância

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATCC: American Type Culture Collection

AUC: área sob a curva

B. trimera cv. CPQBA 1: Baccharis trimera cultivar CPQBA 1

C(n-1): número de carbonos do hidrocarboneto que elui antes do composto (x)

CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CAS: Chemical Abstracts Service

CBMN: Células binucleadas micronucleadas

CBPI: Cytokinesis-Block Proliferation Index

CEMIB: Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais

de Laboratório

CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais

CG/EM: Cromatografia Gasosa acoplada a detector de massas

CGB: contagem de glóbulos brancos

CGEN: Conselho de Gestão do Patrimônio Genético

CGV: contagem de glóbulos vermelhos

CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média

CHO-K1: Chinese Hamster Ovary

Cit-B: citocalasina B

CLS: Cell Line Service

CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CO2: Dióxido de Carbono

COBEA: Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

CPA: ciclofosfamida

CPMA: Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas

CPQBA: Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas

CRMV-SP: Conselho Regional de Medicina Veterinária do Estado de São Paulo

DI: densidade de inoculação

dL: decilitro

DL50: dose letal mediana

DMSO: dimetilsulfóxido

DMT: Dose Máxima Tolerável

DNA: ácido desoxirribonucleico

DON: células do rim de hamster chinês

DP: desvio padrão

DPPH: radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

ECVAM: European Centre for the Validation of Alternative Methods

EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid

EMAR: espectrometria de massas de alta resolução

EP: erro padrão

ERO(s): espécie(s) reativa(s) de oxigênio

ESAC: Scientific Advisory Committee

ESI-MS: Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry

EUA: Estados Unidos

eV: elétron-volts

f0: fluorescência obtida no tempo 0

FAPESP: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

FCF: Faculdade de Ciências Farmacêuticas

FEA: Faculdade de Engenharia de Alimentos

fi: fluorescência obtida nos tempos intermediários

fL: ficolitro

FOP: Faculdade de Odontologia de Piracicaba

FWHM: full width at half maximum

GI50: 50% Growth Inhibition concentration

HaCaT: linhagem celular de queratinócito humano

HCM: hemoglobina corpuscular média

HGB: hemoglobina

HT-29: linhagem celular de adenocarcinoma colorretal

HTC: hematócrito

i.p.: intraperitoneal

IAL: Istituto Adolfo Lutz

IB: Instituto de Biologia

IC50: half maximal inhibitory concentration

ICH: International Conference on Harmonization

IQ: Instituto de Química

IRRcal: Índice de Retenção Relativa calculada

IRRlit: Índice de Retenção Relativa descrito na literatura

K-562: linhagem celular de leucemia

KCl: cloreto de potássio

kV: quilovolts

m/V: massa/volume

m/z: massa/carga

m: metro

mA: miliampère

MCF-7: linhagem celular de adenocarcinoma de mama

mg/kg: miligramas/quilograma

mg/mL: miligramas/mililitro

MgCl2: cloreto de magnésio

mL/kg: mililitros/quilograma

mL/min: mililitros/minuto

mm: milímetro

mM: milimolar

MMA: Ministério do Meio Ambiente

MMS: metilmetanosulfonato

MN(s): micronúcleo(s)

MNPCE: eritrócito policromático micronucleado

n° ou n: número

NaCl: cloreto de sódio

NADP: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

NaOH: hidróxido de sódio

NCE(s): eritrócito(s) normocromático(s)

NCI: National Cancer Institute

NCI-H460: linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão tipo não pequenas células

nm: nanômetro

NOEL: no observed effect level

OE: óleo essencial

OEBt: óleo essencial de Baccharis trimera

OECD: Organization for Economic Cooperation and Development

ORAC: Oxygen Radical Absorbance Capacity

ORAC-H: ORAC hidrofílico

ORAC-L: ORAC lipofílico

OVCAR-3: linhagem celular de adenocarcinoma de ovário

p/v: peso/volume

Pa: peso da amostra

PBS: Phosphate Buffered Saline

PCE(s): eritrócito(s) policromático(s)

PDMS-DVB: polidimetilsiloxano-divinilbenzeno

pg: picograma

pH: potencial hidrogeniônico

PLQ: plaquetas

PLS-DA: Partial Least Squares for Discriminant Analysis

Ps: peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação

Pu: peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação

RI: Replicative Index

RMCD: Randomly Methylated Cyclodextrin

RNA: ácido ribonucleico

rpm: rotações por minuto

RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute (meio de cultura – série 1640)

S. mansoni: Schistosoma mansoni

S9-: Sem ativação metabólica S9

S9+: Com ativação metabólica S9

SCGE: Single Cell Gel Electrophoresis

SFB: soro fetal bovino

SFTG: Société Française de Toxicologie Génétique

SH: sesquiterpenos hidrocarbonetos

SO: sesquiterpenos oxigenados

SPME: Solid Phase Microextraction

SRB: sulforrodamina B

T: média das absorbâncias das células tratadas

T0: média das absorbâncias das células no tempo 0

T1: controle de células

TCA: ácido tricloroacético

TE µg/g: micrograma de Trolox equivalente/grama

TMO: Tail moment Olive

tr(Cn): tempo de retenção do hidrocarboneto que elui depois do composto (x)

tr(Cn-1): tempo de retenção do hidrocarboneto que elui antes do composto (x)

tr: tempo de retenção

Tris-HCl: Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride

u.m.a.: unidade de massa atômica

U-251: linhagem celular de glioblastoma

UEC: Herbário da Universidade Estadual de Campinas

UEL: Universidade Estadual de Londrina

UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas

UNIFESP: Universidade Federal de São Paulo

v.o.: via oral

v/v: volume/volume

V79: células do pulmão de hamster chinês

VCM: volume corpuscular médio

VIP: Variable Importance in Projection

WHO: World Health Organization

μg/mL: microgramas/mililitro

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 21

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................ 23

2.1 Plantas medicinais e a fitoterapia ........................................................................... 23

2.2 Família Asteraceae – Gênero Baccharis ................................................................ 24

2.2.1 Baccharis trimera (Less.) DC. ................................................................... 24

2.3 Genotoxicidade e mutagenicidade ......................................................................... 26

2.4 Toxicogenética de produtos naturais ...................................................................... 27

2.4.1 Teste Cometa ............................................................................................ 29

2.4.2 Teste de indução de micronúcleos ............................................................. 31

A. Teste de indução de micronúcleos com bloqueio da citocinese ............. 32

B. Teste do micronúcleo em medula óssea de camundongos ..................... 33

3. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 35

3.1 Geral ..................................................................................................................... 35

3.2 Específicos ............................................................................................................ 35

4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 36

4.1 Material vegetal .................................................................................................... 36

4.2 Estudo fitoquímico ................................................................................................ 36

4.2.1 Rendimento do OE (% m/m) e teor de umidade (% m/m) .......................... 37

4.2.2 Análise qualitativa por cromatografia a gás acoplada a detector de massas

(CG/EM) ........................................................................................................... 37

4.3 Análises in vitro .................................................................................................... 38

4.3.1 Avaliação da atividade antioxidante .......................................................... 38

A. Atividade sequestradora do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

(DPPH•) .................................................................................................... 38

B. Captura do radical 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

(ABTS•+

) .................................................................................................. 39

C. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) ................................... 40

4.3.2 Atividade antiproliferativa em cultura de células ....................................... 41

A. Cultivo e preparo das suspensões celulares ........................................... 42

B. Preparo e aplicação das amostras .......................................................... 43

C. Análise dos resultados .......................................................................... 44

4.3.3 Teste de indução de micronúcleo in vitro .................................................. 45

A. Sem ativação metabólica (S9-) ............................................................. 45

B. Com ativação metabólica (S9+) ............................................................ 47

C. Análise dos resultados de indução de micronúcleos .............................. 47

4.3.4 Avaliação da genotoxicidade pelo teste Cometa ........................................ 48

A. Análise dos resultados .......................................................................... 50

4.4 Análises in vivo ..................................................................................................... 51

4.4.1 Animais .................................................................................................... 51

4.4.2 Preparo das amostras ................................................................................. 51

4.4.3 Toxicidade oral aguda ............................................................................... 51

4.4.4 Teste do micronúcleo in vivo ..................................................................... 52

A. Análise dos resultados de indução de MNs ........................................... 53

4.5 Estudos da metabolização do óleo essencial .......................................................... 54

4.5.1 Análise por espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-

MS) de alta resolução......................................................................................... 54

4.5.2 Microextração em fase sólida - Headspace dinâmico, com análise por

CG/EM .............................................................................................................. 55

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................................. 57

5.1 Rendimento do OEBt (% m/m) e teor de umidade (% m/m) .................................. 57

5.2 Análise qualitativa por cromatografia a gás acoplada a detector de massas

(CG/EM) .................................................................................................................... 60

5.3 Análises in vitro .................................................................................................... 65

5.3.1 Atividade antioxidante .............................................................................. 65

5.3.2 Atividade antiproliferativa em cultura de células ....................................... 69

5.3.3 Testes para avaliação da toxicogenética ..................................................... 73

A. Teste de indução de micronúcleo in vitro ............................................. 74

B. Avaliação da genotoxicidade pelo teste Cometa ................................... 81

5.4 Análises in vivo ..................................................................................................... 92

5.4.1 Toxicidade oral aguda ............................................................................... 92

5.4.2 Mutagenicidade in vivo ............................................................................. 95

A. Escolha das doses ................................................................................. 95

B. Avaliação da toxicidade das amostras ................................................... 95

C. Avaliação de indução de micronúcleo in vivo ....................................... 99

5.5 Estudos da metabolização do óleo essencial ........................................................ 101

5.5.1 Análise por ESI-MS de alta resolução ..................................................... 101

5.5.2 Microextração em fase sólida - Headspace dinâmico............................... 107

6. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 112

7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 113

ANEXOS

ANEXO 1 - Certificado de Registro no Cadastro Nacional de Biodiversidade. ............ 136

ANEXO 2 - Cromatogramas dos óleos essenciais de Baccharis trimera cv. CPQBA 1,

obtidos por CG/EM. .................................................................................................. 138

ANEXO 3 - Certificados da Comissão de Ética no Uso de Animais. ............................ 142

ANEXO 4 - Declaração de Direitos Autorais ............................................................... 144

21

1. INTRODUÇÃO

A utilização de plantas para os tratamentos paliativo e/ou curativo de diversas

doenças é feita desde os primórdios da humanidade, demonstrando-se como uma das

primeiras manifestações do homem em compreender e aproveitar a natureza (Cragg e

Newman, 2013). Este conhecimento acumulado durante séculos continua sendo valioso para

as gerações atuais e ainda constitui uma importante fonte de substâncias ativas (Harvey et al.,

2015).

O Brasil possui uma grande diversidade de espécies vegetais e, embora o uso de

plantas medicinais seja uma prática bastante comum em nosso país, muitas plantas

apresentam em sua constituição química compostos que podem representar sérios riscos à

saúde humana. Além de investigações farmacológicas, há a necessidade de pesquisar o

potencial toxicológico das plantas utilizadas como medicinais, visando um melhor

esclarecimento das atividades biológicas e, consequentemente, proporcionando maior

segurança da prática fitoterápica feita pela população (Singh et al., 2012).

Dentre as espécies nativas com potencial farmacológico, destaca-se a Baccharis

trimera (Less.) DC., conhecida popularmente como carqueja, amplamente utilizada na

medicina popular para tratamento de diabetes, problemas hepáticos e renais, disfunções

estomacais e intestinais, processos inflamatórios, assim como em feridas e ulcerações

(Fachinetto e Tedesco, 2009; Pádua et al., 2010; Biondo et al., 2011). Além disso, o óleo

essencial (OE) das partes aéreas de B. trimera variedade CPQBA 1 apresentou promissora

atividade in vitro frente ao parasita causador da esquistossomose (Schistosoma mansoni,

linhagem BH), doença parasitária crônica considerada uma das doenças tropicais

negligenciadas (Oliveira et al., 2012).

A esquistossomose é endêmica em 77 países, com maior prevalência na faixa

tropical e subtropical do mundo. Estima-se que cerca de 800 milhões de pessoas estejam em

risco de infecção devido à exposição à água contaminada e que de 390 a 600 milhões de

pessoas estejam infectadas com estes parasitas (Gray et al., 2010; King, 2010; WHO, 2012).

No Brasil, cerca de 25 milhões de pessoas estão expostas ao risco de contrair a

esquistossomose, estimando-se que já existam seis milhões de casos de indivíduos infectados.

Além disso, os altos índices de prevalência anual são agravados pela situação social e

econômica da sociedade que, conjugados aos fatores ecológicos, promovem uma maior

dispersão da doença (Alencar et al., 2016).

22

O tratamento clínico da esquistossomose mansônica é baseado, principalmente, no

uso do praziquantel. No entanto, seu uso extensivo e inapropriado resultou no

desenvolvimento de cepas de S. mansoni resistentes (da Silva et al., 2017). Em busca de

novos compostos, a identificação de produtos naturais com atividade esquistossomicida é uma

estratégia valiosa para a obtenção de novos compostos para combater este problema de saúde

(Kayser et al., 2003; Ioset, 2008; Schmidt et al., 2012; Ndjonka et al., 2013; Neves et al.,

2015).

Uma vez que o óleo essencial das partes aéreas de B. trimera cv. CPQBA 1

(OEBt) apresentou potencial atividade antiparasitária, estudos complementares têm sido

realizados para investigação de outras atividades biológicas, bem como testes preliminares de

segurança do uso do OEBt foram iniciados para uma melhor avaliação do potencial

terapêutico (Della Torre, 2013).

Estudos iniciais do nosso grupo de pesquisa demonstraram que o OEBt

apresentou pequenas variações na composição química ao longo do ano de 2012, mantendo

sempre um perfil citostático fraco para atividade antiproliferativa em linhagens celulares

tumorais e não-tumorais humanas, independente da época de coleta. Já quanto à capacidade

de indução de micronúcleo (MN), quando avaliados sem ativação metabólica, as alíquotas dos

OEs coletados no verão (Jan/2012), outono (Abr/2012), inverno (Jul/2012) e primavera

(Out/2012), além dos OEs dos indivíduos machos (Jul/2012), induziram um aumento na

frequência de MNs na concentração de 25 µg/mL, em relação ao controle de células sem

tratamento. Por outro lado, quando enzimas hepáticas (fração S9) foram adicionadas ao

experimento, verificou-se uma significativa redução na frequência de micronúcleos induzida

pelos OEs, sugerindo que a metabolização das substâncias presentes nos OEBts resultaria em

compostos com menor potencial mutagênico (Della Torre, 2013).

Tendo em vista o potencial uso medicinal da espécie B. trimera cv. CPQBA 1 e os

resultados obtidos em ensaios anteriores, este trabalho teve por objetivo a continuação do

estudo fitoquímico do óleo essencial de carqueja, comparando um lote de OEBt obtido de

partes aéreas coletadas no campo experimental da Coleção de Plantas Medicinais e

Aromáticas (CPQBA/UNICAMP) com uma amostra disponível comercialmente. As duas

amostras foram comparadas quanto à atividade antiproliferativa frente às linhagens celulares

tumorais e não tumorais e quanto à capacidade antioxidante in vitro através dos métodos

DPPH, ABTS e ORAC. Além disso, o potencial genotóxico das amostras foi avaliado por

meio do teste Cometa alcalino em células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) e a

mutagenicidade estudada através do modelo de indução de micronúcleos in vitro (células

23

CHO-K1) e in vivo (medula óssea de camundongos). Finalmente, análises por ESI-MS de alta

resolução e microextração em fase sólida dos compostos presentes nos OEBts foram

realizadas buscando identificar quimicamente as alterações promovidas pelas enzimas

hepáticas sobre as substâncias presentes nas duas amostras de OEs. Desta forma, buscou-se

correlacionar a composição química com as atividades biológicas observadas, contribuindo

assim, para o conhecimento da atividade farmacológica e de segurança para uso medicinal de B.

trimera.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Plantas medicinais e a fitoterapia

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2017), plantas

medicinais são aquelas capazes de aliviar ou curar enfermidades e possuem tradição de uso

como remédio em uma população ou comunidade. O fitoterápico é o produto obtido de planta

medicinal ou de seus derivados, exceto substâncias isoladas, com finalidade profilática,

curativa ou paliativa.

Embora a utilização de plantas com fins medicinais constitua uma das práticas

mais antigas para tratamento, cura e prevenção de doenças (Veiga Júnior et al., 2005), estima-

se que apenas 15% das 350.000 espécies de plantas superiores existentes tiveram seus

constituintes químicos investigados (Wurtzel e Kutchan, 2016), o que mostra que o potencial

das plantas ainda é pouco conhecido e utilizado.

Nos últimos anos, a pesquisa sobre plantas medicinais tem se destacado por elas

serem fonte de substâncias químicas que são potenciais modelos para síntese de novos

fármacos (Bellik et al., 2012). Assim, as moléculas extraídas das plantas fornecem uma

diversidade estrutural que proporciona oportunidades para a descoberta de novos compostos

farmacologicamente ativos. Até o ano de 2010, aproximadamente metade de todos os

medicamentos licenciados e registrados em todo o mundo foram produtos naturais ou seus

derivados sintéticos (Dias et al., 2012).

O Brasil é o país que detém a maior parcela da biodiversidade, em torno de 15 a

20% do total mundial (Brasil, 2006). Das espécies catalogadas para a flora brasileira, estima-

se que menos de 10% foram estudadas com fins fitoquímicos ou farmacológicos e poucos

estudos foram realizados para análise do perfil toxicológico das plantas e seus derivados

(Fonseca e Pereira, 2004; Alonso, 2008; Costa et al., 2008; Horn e Vargas, 2008; Silva et al.,

24

2013; Menegati et al., 2016; Moura et al., 2016; Traesel et al., 2017), evidenciando-se a

necessidade de pesquisas que comprovem eficácia e segurança terapêutica.

2.2 Família Asteraceae – Gênero Baccharis

A família Asteraceae é o grupo sistemático mais numeroso dentro das

Angiospermas, compreendendo cerca de 1.100 gêneros e 25.000 espécies. Cerca de 98% dos

gêneros são constituídos por plantas de pequeno porte, encontradas em todos os tipos de

habitats, desde climas temperados até tropicais, principalmente em regiões montanhosas

(Singh, 2010).

O gênero Baccharis, incluído na tribo Astereae, está representado por mais de 500

espécies distribuídas principalmente no Brasil, Argentina, Colômbia, Chile e México,

ocupando as regiões mais elevadas. As espécies do gênero Baccharis são, no geral, arbustos

que medem em média de 0,5 a 4,0 m de altura, apresentam elevado valor socioeconômico e,

em geral, são consumidas principalmente na forma de chás. Seu uso etnobotânico está focado

principalmente nas espécies conhecidas como carquejas, vassourinhas e alecrins, as quais têm

sido utilizadas para o tratamento de enfermidades como agentes antimicrobianos, digestivos,

antiparasitários, anti-ulcerogênicos, anti-inflamatórios e antioxidantes (Korbes, 1995; Verdi et

al., 2005; Campos et al., 2016).

2.2.1 Baccharis trimera (Less.) DC.

De acordo com Lorenzi e Matos (2008), a espécie Baccharis trimera (Less.) DC.,

conhecida como carqueja (Figura 1) é amplamente utilizada no Brasil na medicina popular,

hábito herdado de indígenas que há séculos a utilizavam para o tratamento de várias doenças.

O primeiro registro escrito do uso da carqueja no país é de 1931, empregada na forma de

infusão das folhas e ramos para o tratamento da esterilidade feminina e da impotência

masculina, atribuindo-lhe ainda propriedades tônicas, febrífugas e estomáquicas (Corrêa

1931; Lorenzi e Matos, 2008).

25

Figura 1: Baccharis trimera (Less.) DC., cultivar CPQBA 1.

Fonte: própria autora.

Tradicionalmente, Baccharis trimera é administrada sob a forma de infusão das

partes aéreas e utilizada como analgésica, diurética e para doenças renais, estomacais e

intestinais, assim como em feridas e ulcerações (Pavan, 1952; Soicke e Leng-Peschlow, 1987;

Pedrazzi et al., 1997; Di Stasi et al., 2002; Ladeira, 2002; Agra et al., 2007; Biavatti et al.,

2007; Agra et al., 2008; Pádua et al., 2010; Biondo et al., 2011), para o tratamento de

reumatismo (Nakasugi e Komai, 1998) e em casos de hipertensão e diabetes (Di Stasi et al.,

2002). A planta ainda é utilizada como aperiente e contra anemia, obesidade e gota (Martins

et al., 1995; Mors et al., 2000; Ladeira, 2002; Dickel et al., 2007).

Vários trabalhos descreveram os efeitos hepatoprotetor do extrato acetato de etila

(Soicke e Leng-Peschlow, 1987), vasorelaxante sobre musculatura lisa para diterpenos

isolados do extrato clorofórmico (Torres et al., 2000), além de moderada atividade

antioxidante para o extrato hidroalcoólico (Mendes et al., 2007; Pádua et al., 2010) e

antimicrobiano para os extratos alcoólicos (Bara e Vanetti, 1998) e decocto de B. trimera

(Avancini et al., 2000).

Dentre os usos populares da B. trimera, já foram evidenciados cientificamente a

capacidade de redução da secreção gástrica (Biondo et al., 2011), o efeito gastroprotetor em

modelo de úlcera induzida por etanol e ácido acético (Lívero et al., 2016), além das atividades

analgésica (Gamberini et al., 1991), anti-inflamatória (Gené et al., 1992; Gené et al., 1996) e

hipoglicemiante (Oliveira et al., 2005).

26

O óleo essencial da espécie B. trimera apresentou atividade esquistossomicida

(Schistosoma mansoni, linhagem BH) (Oliveira et al., 2012) e atividade antimicrobiana frente

às cepas bacterianas de Proteus vulgaris ATCC 13315, Micrococcus luteus ATCC 7468 e

Corynebacterium xerosis IAL 105, com valores de concentração mínima inibitória entre 500 e

1000 µg/mL (Suzuki et al., 2016).

Em relação à segurança, extratos aquosos de B. trimera foram relatados como

mutagênicos em avaliações in vitro (Fachinetto e Tedesco, 2009; Pinho et al., 2010; Menezes

et al., 2013; Menezes et al., 2015) e não mutagênicos em modelos in vivo (Peron et al., 2008;

Rodrigues et al., 2009; Menezes et al., 2016), indicando a importância da metabolização in

vivo para o uso seguro da infusão de B. trimera. Desta forma, nosso grupo de pesquisa é

pioneiro na avaliação do potencial toxicogenético do óleo essencial obtido de partes aéreas da

espécie B. trimera, cultivar CPQBA 1 (Della Torre, 2013).

2.3 Genotoxicidade e mutagenicidade

A informação genética dos organismos vivos está armazenada em moléculas de

DNA e RNA e esta é conservada e transmitida para cada célula por sucessivas gerações, por

meio de um processo de replicação fiel e preciso (Snustad e Simmons, 2013). Embora a

fidelidade desse processo seja assegurada por várias respostas celulares aos danos genéticos

(como paralisação do ciclo celular, indução de mecanismos de reparo e de morte celular

programada), algumas alterações presentes no DNA podem não ser reparadas e serão fixadas

como mutações (Levitt et al., 2007).

Mutações são alterações súbitas e hereditárias no material genético de um

organismo (Nelson e Cox, 2014) e constituem as principais fontes de variação genética

fundamental para o processo evolutivo. Sem as mutações não há variabilidade genética e,

assim, não há evolução (Ribeiro et al., 2003; Snustad e Simmons, 2013). Apesar da grande

relevância evolutiva, as mutações podem ter efeitos prejudiciais tais como malformações

(Erdtmann, 2003), doenças crônicas degenerativas (De Flora et al., 1996) e câncer (Jenkins et

al., 2014). Tais alterações podem ser decorrentes de processos celulares normais

(espontâneas) ou podem ser induzidas pela exposição a agentes físicos, químicos, biológicos e

também pelo estresse oxidativo (Olinsk et al., 2002; Wogan et al., 2004; Iyama e Wilson,

2013).

As mutações podem ser classificadas em três níveis, a saber, as mutações gênicas,

as aberrações cromossômicas estruturais (deleções, duplicações, inversões e translocações) e

as aberrações cromossômicas numéricas (aneuploidias e euploidias) (Kirsch-Volders et al.,

27

2002). Por sua vez, os agentes mutagênicos podem ser classificados como agentes diretos

(atuam diretamente sobre o DNA), agentes indiretos (os seus metabólitos é que são

mutagênicos), agentes que promovem a produção de espécies reativas de oxigênio (as quais

poderão danificar o DNA) e agentes inibidores dos processos de reparo e/ou síntese do DNA

(Lee e Steinert, 2003).

Agentes que interagem com o DNA e/ou com seus componentes celulares (fibras

do fuso) e enzimas (topoisomerases), formando alterações oxidativas ou rompendo a fita de

DNA, são conhecidos como genotóxicos. O efeito genotóxico é definido como uma indução

de alterações no DNA que podem (irreversíveis) ou não (reversíveis) resultarem em

mutagenicidade que, por sua vez, pode ser definida como a indução de mudanças permanentes

ou transmissíveis a gerações futuras, em genes e/ou cromossomos (Dearfield et al., 2002;

Eastmond et al., 2009; Ji et al., 2017).

Os ensaios de genotoxicidade/mutagenicidade desempenham um papel

significativo no desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que ao encontrar relações entre

os grupos funcionais presentes em uma molécula e a possível atividade genotóxica e/ou

carcinogênica, é possível delinear novas estruturas químicas que preservem a atividade

farmacológica com menor atividade tóxica (Gollapudi e Krislma, 2000; Freitas et al., 2013).

2.4 Toxicogenética de produtos naturais

Devido à importância de assegurar a integridade genética aos organismos, a área

da genética toxicológica ou toxicogenética vem ganhando destaque. A Genética Toxicológica

é uma das áreas da ciência que se dedica à pesquisa das propriedades genotóxicas e

mutagênicas de agentes aos quais os organismos estão expostos, fazendo uso de diversos

testes que avaliam o dano que estes podem vir a causar ao DNA na presença ou ausência de

sistemas de metabolização (Vogel, 1987). Dessa forma, grande parte do perfil de segurança de

novas moléculas farmacologicamente ativas é resultado de estudos de toxicologia genética, os

quais podem identificar danos causados ao DNA e quantificá-los, de forma que seu estudo

torna-se importante na prevenção do desenvolvimento de cânceres, além de outras doenças

degenerativas (Custer e Sweder, 2008).

Estudos para detecção e avaliação de efeitos citotóxicos, genotóxicos,

mutagênicos e carcinogênicos de compostos de origem vegetal e o entendimento dos

benefícios e potencial toxicidade dessas plantas à saúde são de fundamental importância para

reduzir os possíveis riscos desses agentes e aumentar a segurança do uso das plantas

28

medicinais feito pela população (Bast et al., 2002; Teixeira et al., 2003; Cravotto et al., 2010;

Bettega et al., 2011).

As avaliações in vitro dos danos genotóxicos vêm de encontro ao panorama

internacional que fomenta o princípio dos 3Rs (replace, reduce, refine) no uso de animais.

Assim, os experimentos com cultura de células constituem uma importante ferramenta de

investigação básica, servindo a diversas áreas de investigação como a imunologia, a virologia,

a genética e a toxicologia in vitro (Lewinska et al., 2007). Testes com cultura de células de

mamíferos apresentam várias vantagens, tais como, facilidade para padronizar as condições

experimentais (temperatura, pH, composição do meio de cultura, densidade populacional);

possibilidade de tratamento das células em várias fases do ciclo celular; economia, rapidez e

boa reprodutibilidade; organização dos cromossomos e do DNA igual às células in vivo

(Rabello-Gay et al., 1991); além de eficiência estatística, uma vez que o número de células

analisadas é maior em relação a outros testes.

Na tentativa de padronizar esses testes, diversos sistemas de células têm sido

utilizados. Conforme Gebhart (1992), células de mamíferos são classicamente conhecidas e

utilizadas para estudos de mutagênese e antimutagênese, tais como as linhagens CHO (células

de ovário de hamster chinês) (Figura 2), V79 (células do pulmão de hamster chinês) e DON

(células do rim de hamster chinês). Células humanas do tipo linfócitos do sangue periférico,

fibroblastos primários, células de hepatoma, entre outras, também são difundidas em testes in

vitro. As linhagens imortalizadas estabelecidas apresentam algumas vantagens em relação às

culturas primárias de linfócitos, dentre as quais se destacam a facilidade de manipulação e

crescimento durante o cultivo, pequeno número cromossômico e ciclo celular curto (10 a 14

horas, aproximadamente), o que fornece uma alta frequência de metáfases analisáveis, além

de serem bem caracterizadas quanto ao cariótipo (Preston et al., 1987; Kuroda et al., 1992;

Doyle e Griffths, 1998).

Figura 2: Fotomicroscopia representativa da linhagem celular CHO-K1, aumento de 40x.


29

A maior desvantagem dos experimentos em células de cultura é que a maioria das

linhagens celulares empregadas não apresenta capacidade de metabolização de substâncias,

necessitando da adição de um sistema exógeno de metabolização como, por exemplo, a fração

S9 (Preston, 1997). No entanto, segundo Kuroda et al. (1992), embora os experimentos com

animais reproduzam com maior semelhança as condições humanas, os sistemas in vitro têm se

mostrado eficazes na detecção de agentes ambientais mutagênicos e antimutagênicos. Botham

(2004) sugere a utilização de testes in vitro como preliminares a testes in vivo, a fim de

auxiliarem na seleção da dose a ser testada e na redução do número de animais a serem

utilizados.

Dentre os diferentes modelos experimentais in vitro para avaliação de

mutagenicidade/genotoxicidade (Araldi et al., 2015; Cartus e Schrenk, 2017), pode-se

destacar o modelo de indução de micronúcleos in vitro (avaliação de dano cromossomal) e o

teste Cometa (avaliação de quebras no DNA).

2.4.1 Teste Cometa

Sistemas apropriados de avaliação da genotoxicidade de novos agentes químicos,

bem como modelos de protocolos, têm sido frequentemente determinados pelas diretrizes

regulatórias internacionais. Um grande progresso tem sido obtido na tentativa de se

padronizar os protocolos para testes de genotoxicidade, particularmente por esforços da

International Conference on Harmonization (ICH) e da Organization for Economic

Cooperation and Development (OECD) (Galloway, 2017).

O ensaio Cometa, também chamado Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE), é

amplamente aceito como um método padrão para avaliar fragmentação da cadeia de DNA

(McKenna et al., 2008). Esta é uma técnica utilizada para detectar lesões genômicas que, após

serem processadas, podem resultar em mutação. Ao contrário das mutações, as lesões

detectadas pelo teste Cometa são passíveis de correção (Gontijo e Tice, 2003), constituindo-

se, portanto, lesões pré-mutagênicas (Kammann et al., 2001).

Ostling e Johanson (1984) foram os primeiros pesquisadores a desenvolverem

uma metodologia capaz de mensurar danos no DNA em células individuais com a utilização

da eletroforese em gel. O princípio desta técnica consiste em células embebidas em agarose e

dispostas em uma lâmina de microscopia, sendo então as células submetidas às etapas de lise

das membranas por ação de detergentes, da extração de proteínas nucleares por soluções com

altas concentrações de sais e, consequentemente, da liberação do DNA. Em seguida, as

lâminas são submetidas à eletroforese, sob condições neutras (protocolo original), com

30

migração das moléculas de DNA em direção ao anodo. As células que se apresentam como

um núcleo redondo (nucleoide) são identificadas como normais, sem dano detectável no

DNA. Como, após as quebras, os fragmentos de DNA sofrem um relaxamento, essas alças de

DNA podem ser arrastadas durante a eletroforese. Assim, as células danificadas são

identificadas visualmente por um nucleoide (menor quanto maior o dano) com uma espécie de

cauda, similar a um cometa, formada pelos fragmentos de DNA (Tice et al., 2000; Azqueta et

al., 2009; Oliveira et al., 2009) (Figura 3).

Entretanto, o método inicialmente desenvolvido permitia somente a detecção da

quebra de fita dupla de DNA. Em 1988, Singh e colaboradores inovaram este método,

utilizando a eletroforese em pH alcalino, o que tornou possível a detecção da quebra de fita

simples, lesões de sítios alcalinos lábeis, locais de reparos incompletos e crosslinks,

aumentando a sensibilidade do método (Tice et al., 2000; Gontijo e Tice, 2003; Collins et al.,

2008; Azqueta e Collins, 2013).

Figura 3: Esquema representativo do teste Cometa.

Fonte: adaptado de Kumar et al., 2013.

Assim, o teste Cometa é um método rápido, sensível e relativamente simples para

a detecção de danos primários no DNA em células individuais (Fairbairn et al., 1995; Collins

et al., 1997; Wong et al., 2005; Azqueta e Collins, 2013; Gonçalves et al., 2013). É

amplamente empregado em estudos de genética toxicológica, biomonitoramento ambiental e

de populações humanas expostas a agentes genotóxicos, constituindo uma ferramenta valiosa

A

nálises

Células tratadas Suspensão celular

Lâmina com agarose

Células em agarose de

baixo ponto de fusão

Célula

Núcleo

Lise Nucleoide com DNA fita dupla

DNA cadeia simples

Eletroforese alcalina

Fragmentos de DNA

Neutralização

Coloração Análises

31

para investigar danos e reparo no DNA em diferentes tipos celulares, em sistemas in vivo e in

vitro, em resposta a agentes que causam lesões no DNA (Collins, 2004; Dusinska e Collins,

2008; Liao et al., 2009; Piperakis, 2009).

2.4.2 Teste de indução de micronúcleos

Outra técnica bastante empregada para estudos e monitoramento de agentes

mutagênicos, inclusive os carcinogênicos, é a contagem de micronúcleos (MNs), proposta

inicialmente por Heddle (1973). A contagem de micronúcleos fornece um indicador sensível

de dano cromossômico, dentro da gama dos testes de genotoxicidade, devido à simplicidade

na quantificação dos MNs, sua aplicabilidade em vários tipos celulares e a avaliação confiável

tanto da perda quanto da ruptura do cromossomo, emergindo como um dos métodos

recomendados para avaliação dos danos cromossomais (Fenech, 2000; Fenech, 2005;

Samanta e Dey, 2010; Kirsch-Volders et al., 2011; OECD 487, 2016).

Os micronúcleos são formados durante a telófase da mitose ou da meiose, quando

o envelope nuclear é reconstituído ao redor dos cromossomos das células-filhas. Originam-se

de fragmentos cromossômicos que são resultantes de lesões cromossômicas (efeito

clastogênico) ou de cromossomos inteiros (efeito aneugênico), os quais não se ligaram às

fibras do fuso e não foram incluídos nos núcleos filhos principais durante a divisão nuclear

em razão de lesões nas proteínas envolvidas na segregação cromossômica (Fenech et al.,

2011; OECD 487, 2016) (Figura 4).

Figura 4: Formação dos micronúcleos.

Fonte: adaptado de Fenech et al., 2011.

Com relação ao teste de indução de micronúcleos in vitro, inúmeros trabalhos

corroboram a robustez e aplicabilidade do teste em vários tipos celulares (Zhang et al., 1995;

Cromossomo inteiro

(dano aneugênico)

Fragmentos cromossômicos

(dano clastogênico)

32

Albertini et al., 1997; Miller et al., 1997; Miller et al., 1998; Kalweit et al., 1999; Kersten et

al., 1999; Matsushima et al., 1999; von der Hude et al., 2000; Garriott et al., 2002; Elhajouji e

Lorge, 2006; Kirkland, 2010; Hashimoto et al., 2011; Honma e Hayashi, 2011). Além disso,

há estudos de validação internacional coordenados pela Société Française de Toxicologie

Génétique (SFTG) (Aardema et al., 2006; Clare et al., 2006; Lorge et al., 2006; Oliver et al.,

2006; Wakata et al., 2006) e os relatórios da International Workshop on Genotoxicity Testing

(Kirsch-Volders et al., 2000; Kirsch-Volders et al., 2003). Os dados disponíveis também têm

sido reavaliados pela European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) e

o método do teste foi aprovado como cientificamente válido pela Scientific Advisory

Committee (ESAC) (ECVAM, 2006; ESAC, 2006; Corvi et al., 2008).

A. Teste de indução de micronúcleos com bloqueio da citocinese

Os MNs são expressos em células que completaram a divisão nuclear e, portanto,

devem ser quantificados no estágio binucleado do ciclo celular. Assim, é importante

identificar as células que completaram uma divisão nuclear, sendo o bloqueio da citocinese o

método de escolha para tal no teste do micronúcleo. Nesse método, o bloqueio da citocinese

acontece pela adição de citocalasina B (Cit-B) e as células que completaram uma divisão

nuclear podem ser identificadas pela sua aparência binucleada. A Cit-B é isolada do fungo

Helminthosporum dermatoideum e atua bloqueando a citocinese por ser um potente inibidor

da polimerização de microfilamentos de actina na placa equatorial formada no final da

telófase, observando-se uma cariocinese com ausência de citocinese (Falck et al., 1997;

Fenech e Crott, 2002).

O teste de MN com bloqueio da citocinese permite a avaliação da toxicidade

celular ou atraso no ciclo celular por meio da determinação do Índice de Proliferação Pós-

Bloqueio da Citocinese proposto por Surrallés et al. (1995), além de ser usado para avaliar

pontes nucleoplasmáticas, brotamentos nucleares, mecanismos de morte celular (necrose ou

apoptose) e taxa de divisão nuclear, através da contagem de células mono, bi e multinucleadas

(Fenech, 2006 e 2007) (Figura 5).

33

Figura 5: Alterações detectadas pelo teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese.

Fonte: adaptado de Fenech, 2007.

As vantagens que este teste apresenta incluem sensibilidade e precisão, baixo

custo e detecção de perda cromossômica (Fenech, 1997). As desvantagens se referem à

necessidade de divisão celular para a análise de MN, já que esta técnica só é efetiva em

populações de células em constante divisão. Além disso, a citocalasina B pode causar

interferência na detecção de compostos que possam inibir a citocinese ou a polimerização dos

filamentos de actina (Ribeiro et al., 2003), havendo a possibilidade de não fornecer

informações sobre os tipos de aberrações cromossômicas estruturais ocorridas (Corvi et al.,

2008).

B. Teste do micronúcleo em medula óssea de camundongos

O teste do MN in vivo é internacionalmente aceito como parte da bateria de testes

recomendada na avaliação do potencial mutagênico para o registro de novos produtos

químicos que entram no mercado mundial e como um método de triagem no desenvolvimento

de novos fármacos. A alta confiabilidade e o baixo custo da técnica contribuem para o sucesso

mundial e adoção desse biomarcador para estudos de danos genéticos in vivo (Bonassi et al.,

2007; Rothfuss et al., 2011).

Esse teste pode ser executado praticamente em qualquer população de células que

estejam constantemente em divisão, sendo a medula óssea de mamíferos uma das regiões

mais adequadas, visto que suas células levam de 22 a 24 horas para completar um ciclo de

divisão (Heddle, 1973) sendo, portanto, um período adequado para administração e absorção

de um composto (Figura 6).

Agente

genotóxico/mutagênico

Apoptose

Ponte

nucleoplasmática

Micronúcleos

Brotos

nucleares

Necrose

G0

G1, S, G2

34

Figura 6: Processo de maturação das células da linhagem eritrocitária.

Fonte: Ribeiro et al., 2003.

Na medula óssea, um agente clastogênico pode induzir a ocorrência de quebras

cromossômicas, gerando fragmentos acêntricos que se atrasam em relação aos elementos com

centrômero ou causar distúrbios no aparato mitótico, de modo que algumas cromátides podem

também se atrasar em relação às demais. Assim, um cromossomo inteiro ou fragmentos

acêntricos não conseguem migrar para os polos da célula durante a anáfase e podem não ser

incluídos nos núcleos das células-filhas após a divisão celular formando, assim, os chamados

micronúcleos, observados no citoplasma dos eritrócitos policromáticos (PCE) (Kirsch-

Volders et al., 2011).

Os PCEs, quando sofrem maturação, transformam-se em eritrócitos

normocromáticos (NCEs), os quais são lançados na corrente sanguínea. O teste do MN se

caracteriza pela observação do efeito do agente testado em PCEs anucleados, que têm vida

curta; assim, qualquer micronúcleo encontrado representa dano cromossômico recente

(Salvadori et al., 2003).

Os eventos que levam à formação do MN podem ser induzidos pelo estresse

oxidativo, exposição a agentes clastogênicos ou aneugênicos, defeitos genéticos nos

checkpoints do ciclo celular e nos genes de reparo do DNA (Rajagopalan e Lengauer, 2004;

Bonassi et al., 2007). Esses eventos, que causam a formação do MN, como rearranjos

cromossômicos, expressão gênica alterada ou aneuploidia, são efeitos associados com a

instabilidade cromossômica geralmente observada no câncer (Fenech, 2002; Rajagopalan e

Lengauer, 2004).

35

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Este trabalho visou ampliar os conhecimentos a respeito da segurança de uso

medicinal do óleo essencial da espécie Baccharis trimera (Less.) DC, em conjunto com

estudos de composição química do mesmo.

3.2 Específicos

Extração do óleo essencial das partes aéreas de B. trimera cultivar CPQBA 1;

Análise sazonal da variação da composição química do OE de B. trimera

cultivar CPQBA 1;

Estudo comparativo da composição química e atividade biológica entre os OEs

de B. trimera do cultivar CPQBA 1 e um lote comercial, através de:

Avaliação da atividade antiproliferativa frente a um painel de linhagens

celulares tumorais e não tumorais;

Avaliação da atividade antioxidante in vitro através dos métodos DPPH,

ABTS e ORAC;

Avaliação dos efeitos genotóxico (teste Cometa) e mutagênico (teste de

indução de micronúcleo) das amostras em cultura de células de ovário de

hamster chinês (CHO-K1);

Estudo da toxicidade oral aguda e da indução de micronúcleos em medula

óssea de camundongos;

Avaliação dos produtos de metabolismo dos OEs expostos à fração S9, por

ESI-MS de alta resolução e pela técnica de microextração em fase sólida

(SPME) em headspace dinâmico.

36

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material vegetal

A coleta das partes aéreas de B. trimera cultivar CPQBA 1 foi realizada no campo

experimental da Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas (CPMA), localizada no Centro

Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas Biológicas e Agrícolas (CPQBA), em Paulínia, São

Paulo, pertencente à Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). A identificação

botânica foi realizada pelo Dra. Inês Cordeiro, do Instituto de Botânica de São Paulo, e a

exsicata está depositada no Herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC) sob o

número UEC 184154. As atividades de coleta foram supervisionadas pelo Dr. Ílio Montanari

Jr., pesquisador da Divisão de Agrotecnologia (CPQBA/UNICAMP).

Por se tratar de uma espécie nativa, o Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico - CNPq, credenciado pelo Conselho de Gestão do Patrimônio

Genético (CGEN/MMA), nos termos Deliberação 246/2009, emitiu autorização de Acesso e

de Remessa de Componente do Patrimônio Genético, com a finalidade de pesquisa científica,

viabilizando os estudos propostos com a espécie Baccharis trimera (Less.) DC. (Processo

010298/2014-2).

4.2 Estudo fitoquímico

Esta etapa foi realizada em colaboração com a Dra. Vera Lúcia Garcia,

pesquisadora da Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica (CPQBA/UNICAMP), e a

doutoranda Adriana da Silva Santos de Oliveira (IB/UNICAMP).

Para a obtenção do óleo essencial (OE), cerca de 2 a 3 kg de partes aéreas de B.

trimera cv. CPQBA 1 foram coletados mensalmente, de Janeiro/2014 a Dezembro/2014,

sempre no início de cada mês, em coletas realizadas no período matutino (9:00 – 10:00 horas).

As folhas frescas foram picadas, acondicionadas em três balões (aproximadamente 1

kg/balão) com 3,5 litros de água destilada e submetidas à hidrodestilação em sistema do tipo

Clevenger, por um período de 3 horas. Os OEs obtidos foram reunidos, pesados, separados

em alíquotas em frascos ambar de vidro e conservados em freezer (-20°C) até o momento das

análises química e biológica.

Ao final do período das coletas, as amostras mensais foram reunidas em

proporções iguais, originando uma amostra representativa da espécie B. trimera cv. CPQBA 1

(OEBt CPQBA). Esse lote foi avaliado quimica e biologicamente em comparação a uma

amostra comercial do OEBt (OEBt comercial). A inserção da amostra de OEBt comercial

37

(Laszlo®) no plano de trabalho possibilitou evidenciar como a diferença da composição

química influencia no potencial mutagênico do OE de B. trimera.

4.2.1 Rendimento do OE (% m/m) e teor de umidade (% m/m)

Alíquotas das partes aéreas picadas foram distribuídas em três recipientes pesa-

filtros (aproximadamente 2 g/pesa-filtro) e levadas para estufa de secagem a 105°C, de 2 em 2

horas, para análise do teor de umidade e cálculo do rendimento do OE em base seca.

A porcentagem de perda por dessecação foi avaliada de acordo com a

Farmacopeia Brasileira (2010), mediante a equação:

% = (Pu − Ps

Pa) × 100

Onde:

Pa corresponde ao peso da amostra;

Pu é o peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação;

Ps equivale ao peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação.

4.2.2 Análise qualitativa por cromatografia a gás acoplada a detector de

massas (CG/EM)

Alíquotas dos OEs (20 mg), obtidos de Janeiro/14 a Dezembro/14, foram

previamente diluídas em acetato de etila (1 mL). A análise dos constituintes voláteis foi

realizada em um cromatógrafo a gás Agilent, modelo HP-6890 equipado com um detetor de

massas Agilent, modelo HP-5975 utilizando uma coluna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm x

0,25 µm) nas seguintes condições: temperatura do injetor = 220°C, coluna = 60°C, taxa de

aquecimento de 3°C∙min-1

até 240°C e detetor = 250°C. Hélio foi utilizado como gás de

arraste numa vazão de 1 mL∙min-1

com detetor seletivo de massas operando a 70 eV, m/z = 30

a 500 u.m.a.

A identificação dos constituintes químicos foi feita através da análise comparativa

dos espectros de massas das substâncias com a biblioteca eletrônica do sistema CG/EM

(NIST-05, versão 2.0), com dados da literatura (Adams, 2007) e dos índices de retenção dos

analitos calculados pela coinjeção de uma mistura de padrões de hidrocarbonentos (C-8 a C-

22), aplicando-se a equação de Van den Dool e Kratz (Van den Dool e Kratz, 1963).

38

IRR = 100i × (tr(x) − tr(Cn−1)

tr(Cn) − tr(Cn−1)) + 100C(n−1)

Onde:

IRR = Índice de Retenção Relativa;

tr(X) = tempo de retenção da amostra;

tr(Cn-1) = tempo de retenção do hidrocarboneto que elui antes do composto (x);

tr(Cn) = tempo de retenção do hidrocarboneto que elui depois do composto (x);

i = diferença do número de carbonos entre os hidrocarbonetos que eluem depois e

antes;

C(n-1) = número de carbonos do hidrocarboneto que elui antes do composto (x).

4.3 Análises in vitro

4.3.1 Avaliação da atividade antioxidante

Esta etapa foi realizada em colaboração com a Profa. Dra. Glaucia Maria Pastore e

a doutoranda Iramaia Angélica Neri-Numa, ambas do laboratório de Bioaromas e Compostos

Bioativos, da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA/UNICAMP).

As análises para determinação da capacidade antioxidante foram realizadas com

as amostras OEBt CPQBA, OEBt comercial e os padrões mirceno (CAS 123-35-3), E-

cariofileno (CAS 87-44-5), β-pineno (CAS 127-91-3) e α-pineno (CAS 80-56-8).

A. Atividade sequestradora do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•)

A capacidade de sequestrar o radical DPPH das amostras foi determinada através

da redução do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich®) pelas

moléculas antioxidantes presentes nas amostras, de acordo com o método proposto por Brand-

Willians e colaboradores (1995) com algumas modificações (Roesler et al., 2007).

O teste foi realizado empregando-se solução de DPPH (0,004% m/v) recém-

preparada, apresentando um intervalo de absorbância entre 0,8 e 1,2 a 517 nm. As

determinações foram realizadas em microplaca de poliestireno com 96 compartimentos

(Corning®). Em cada compartimento, foram adicionados 250 µL de solução de DPPH e 50 µL

de metanol (controle negativo), Trolox (controle positivo, Sigma-Aldrich®), amostras dos

OEs e padrões adequadamente diluídas (10 mg/mL). O metanol foi utilizado para corrigir a

linha de base (branco = 300 µL metanol). As leituras foram realizadas a 517 nm no tempo

39

zero e após 30 minutos, utilizando o leitor de microplacas módulo absorbância NOVOstar

(BMG Labtech®) a 25

oC.

A capacidade de sequestrar radical livre foi expressa como percentual de

absorbância da solução controle de DPPH, obtida através da seguinte equação:

% Atividade = (ADPPH − Aam

ADPPH) × 100

Onde:

ADPPH é a absorbância da solução controle de DPPH a 517 nm;

Aam corresponde à absorbância da amostra teste.

Os resultados foram expressos como μg Trolox equivalente (TE)/g de amostra,

utilizando-se a curva padrão de Trolox (6,25 - 250 μM), realizada durante o ensaio. Estes

resultados foram obtidos em triplicata e expressos como média ± DP.

B. Captura do radical 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

(ABTS•+

)

A determinação da capacidade antioxidante pelo método ABTS•+

foi realizada de

acordo com o método descrito por Le et al. (2007), onde a atividade da amostra é determinada

pela descoloração do radical monocátion ABTS•+

(Sigma-Aldrich®), através da redução do

radical a uma absorbância de 734 nm.

O radical foi gerado previamente por meio da reação química entre ABTS (7 mM,

5 mL) e persulfato de potássio 140 mM (88 µL, concentração final de 2,45 mM) em repouso,

na ausência de luz, à temperatura ambiente, cerca de 12 a 16 horas antes do experimento.

Uma vez formado o radical ABTS•+

, uma solução de trabalho foi preparada diluindo-se a

solução estoque de ABTS•+

em etanol absoluto até obtenção do valor de absorbância de 0,70 ±

0,05 a 734 nm. Os testes foram realizados em microplacas de poliestireno com 96

compartimentos (Corning®), sendo o sistema de reação formado por 250 µL/compartimento

da solução de trabalho de ABTS•+

acrescida de 50 µL/compartimento de etanol absoluto

(controle negativo), Trolox (controle positivo), amostras dos OEBt e padrões adequadamente

diluídos (10 mg/mL), seguido por 6 minutos de incubação a temperatura ambiente, 23ºC ± 1.

As leituras foram realizadas no tempo zero e após 6 minutos, a 734 nm em espectrofotômetro

(Beckman DU 640).

40

A capacidade de sequestrar radical livre foi expressa como percentual de

absorbância da solução controle de ABTS•+

, obtida através da equação:

% Atividade = (AABTS − Aam

AABTS) × 100

Onde:

AABTS é a absorbância da solução controle de ABTS;

Aam é a absorbância da amostra.

Uma curva de calibração foi construída, baseada nos valores da porcentagem (%)

de redução em relação à concentração do Trolox (6,25 - 250 µM) e os resultados foram

expressos como μg Trolox equivalente (TE)/g de amostra, média ± DP.

C. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)

Os testes foram realizados conforme os métodos descritos por Prior et al. (2003),

Dávalos et al. (2004) e Leite-Legatti et al. (2012), com algumas modificações. Todos os

reagentes foram preparados em tampão fosfato de potássio (0,2 mM, pH 7,4) e o volume final

da mistura foi de 1 mL. As reações aconteceram em microplacas de poliestireno com 96

compartimentos, específicas para reações de fluorescência (Corning®). Para cada leitura

(estudo das frações hidrofílica e lipofílica) foi preparada uma curva padrão de Trolox (25 -

600 µM), seguida de diluições apropriadas. A solução de fluoresceína (3,78 μg/mL, Sigma-

Aldrich®) e o AAPH [2,2’-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride, 12 mM, Sigma-

Aldrich®] foram preparados e mantidos ao abrigo da luz até o momento de uso.

O sistema de reação em cada compartimento da microplaca foi realizado por meio

da adição de 20 µL de amostra, 120 µL de solução de fluoresceína e 60 µL de AAPH a uma

temperatura constante de 37°C, durante 80 minutos. A intensidade de fluorescência (485 nm

excitação/ 520 nm emissão) foi verificada a cada ciclo de 60 segundos, durante 80 ciclos em

leitor de microplacas NOVOstar (BMG Labtech®

), acompanhado com o software de análise

de dados (MARS Data Analysis versão 1.3, BMG Labtech®). O mesmo procedimento foi

adotado para o branco da reação (para correção da linha de base) e para as amostras (1,25

mg/mL).

41

Para o estudo das frações lipofílicas, as amostras foram solubilizadas em solução

de ciclodextrina metilada randomizada a 7% (RMCD, Trappsol®) em solução acetona:água

(1:1), seguida de agitação e ultrassonicação a 10°C durante 30 minutos.

As soluções de fluoresceína e AAPH foram preparadas da mesma maneira que no

ORAC hidrofílico e o padrão Trolox foi diluído em solução de RMCD 7% em diferentes

concentrações (13 - 1040 μM). Em cada poço, 20 µL de amostra (0,31 mg/mL), 120 µL de

solução de fluoresceína e 120 µL de AAPH foram misturados e analisados da mesma forma

que para o ORAC hidrofílico.

O cálculo da curva de decaimento da fluorescência ou área sob a curva (AUC) foi

realizada com o auxílio da seguinte fórmula:

AUC = 1 +fi

f0+ ⋯

fi

f0+ ⋯

f80

f0

Onde:

f0 é representado pela fluorescência obtida no tempo 0;

fi é a fluorescência obtida nos tempos intermediários entre 0 e 80 minutos.

Os resultados foram expressos em µmol equivalentes de Trolox, utilizando-se a

curva padrão de Trolox realizada para cada fração (ORAC-H ou ORAC-L). A área da perda

de fluorescência de uma amostra foi calculada subtraindo a área correspondente à do controle.

As leituras foram realizadas em triplicata e os valores expressos como μg Trolox equivalente

(TE)/g de amostra, média ± DP.

4.3.2 Atividade antiproliferativa em cultura de células

A fim de agregar informações sobre outras possíveis atividades biológicas do OE

de B. trimera, realizou-se o teste de atividade antiproliferativa em linhagens celulares

tumorais e não tumorais com as amostras de OEBt CPQBA e OEBt comercial.

As linhagens tumorais humanas foram cedidas pelo NCI (National Cancer

Institute, Frederick-MA, EUA). Já as linhagens celulares de queratinócito humano (HaCaT,

CLS Cell Line Service) e ovário de hamster chinês (CHO-K1, ATCC CCL-61) foram

gentilmente cedidas pelo prof. Dr. Ricardo Della Coletta (FOP/UNICAMP) e pelo prof. Dr.

Mário S. Mantovani (UEL), respectivamente. As linhagens estão representadas na Tabela 1.

42

Tabela 1: Linhagens celulares tumorais e não tumorais utilizadas nos testes de atividade

antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (DI).

Linhagem celular Nome DI (x104 células/mL)

Linhagens tumorais

Leucemia K-562 6,0

Mama MCF-7 6,0

Pulmão NCI-H460 4,0

Cólon HT-29 4,0

Ovário OVCAR-3 7,0

Glioblastoma U251 3,0

Rim 786-0 3,0

Linhagens não

tumorais

Queratinócito humano HaCaT 3,0

Ovário de hamster chinês CHO-K1 4,0

Os experimentos de atividade antiproliferativa dos OEBt CPQBA e comercial

foram realizados segundo o protocolo descrito por Monks et al. (1991). O crescimento celular

foi determinado por espectrofotometria, utilizando-se o corante proteico sulforrodamina B

(SRB, Sigma-Aldrich®) e as análises foram baseadas na metodologia de triagem in vitro para

drogas anticâncer realizada pelo NCI, EUA, que utiliza um painel de 60 linhagens tumorais

humanas (Monks et al., 1991; Shoemaker, 2006; Monteiro et al., 2017).

A. Cultivo e preparo das suspensões celulares

As células foram cultivadas em frascos de 25 cm2 (Corning

®) com 5 mL de meio

RPMI 1640 (Gibco®), suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB, Gibco

®) e com

solução de penicilina:estreptomicina (1000 U/mL:1000 µg/mL, 10 mL/L RPMI 1640,

Vitrocell®

) (denominado meio completo) e mantidas a 37ºC em atmosfera úmida com 5% de

CO2. Para linhagens aderidas, o desprendimento celular foi realizado mediante ação

enzimática da tripsina. Para tanto, o meio de cultura foi aspirado, o frasco lavado com 500 μL

de tampão fosfato salina (PBS 0,2 mM, pH 7,0) para eliminar resíduos de meio de cultura e,

após aspiração do tampão, foram adicionados 500 μL de solução tripsina/EDTA 2,5 g/L

(Vitrocell®), a 37ºC, até que as células se soltassem totalmente. A ação da tripsina foi

bloqueada por meio da adição de meio de cultura completo.

No primeiro dia de experimento, as suspensões celulares foram preparadas com

meio completo, em suas respectivas densidade de inoculação (Tabela 1). Foram inoculados

100 μL/compartimento de cada suspensão celular em placas de 96 compartimentos

(Corning®), que foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente

43

úmido. Da mesma forma, preparou-se uma placa controle (placa T0), contendo todas as

linhagens celulares utilizadas no experimento.

B. Preparo e aplicação das amostras

Alíquotas das duas amostras de OEBts foram diluídas em dimetilsulfóxido

(DMSO, Merck®) na concentração de 0,1 g/mL. Para adição à cultura de células, estas

soluções foram diluídas pelo menos 400 vezes em meio completo, o que evitou a toxicidade

do DMSO. As amostras de OEBts foram adicionadas às microplacas nas concentrações de

0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL (100 μL/compartimento) em triplicata e, a seguir, foram incubadas

por 48 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido (Figura 7). Como controle

positivo, utilizou-se o quimioterápico doxorrubicina (cloridrato de doxorrubicina, Eurofarma)

nas concentrações de 0,025; 0,25; 2,5 e 25 μg/mL (100 μL/compartimento), em triplicata.

Figura 7: Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96 compartimentos

utilizada no teste de atividade antiproliferativa.

Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3

Amostra 4

Amostra 5

Branco das amostras

Branco das amostras

Amostras (T) Meio de

cultura

Células (T1)

44

Para a linhagem CHO-K1, o tempo de exposição às amostras foi reduzido para 4

horas, seguido de substituição total do meio de cultivo com as amostras e incubação por 20

horas, a fim de avaliar a capacidade antiproliferativa das amostras no mesmo esquema de

tratamento do teste de indução de micronúcleos in vitro.

No momento de adição das amostras, as células inoculadas na placa controle T0

foram fixadas com a adição de 50 μL/compartimento de ácido tricloroacético (TCA, Sigma-

Aldrich®) a 50% para determinação da quantidade de células presentes no momento em que

as amostras foram aplicadas, sendo este o valor basal no tempo 0.

Após 48 horas de tratamento (ou 24 horas no caso da linhagem CHO-K1), as

células foram fixadas com 50 μL/compartimento de ácido tricloroacético a 50% e incubadas

por 1 hora, a 4ºC. Em seguida, as placas foram submetidas a quatro lavagens consecutivas em

água corrente para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários.

Após isso, foram mantidas à temperatura ambiente até a secagem completa.

Após a secagem, foram adicionados 50 μL/compartimento do corante proteico

sulforrodamina B (SRB, Sigma-Aldrich®) a 0,4 % (p/v) dissolvido em ácido acético a 1 %

(v/v) e, a seguir, as placas foram incubadas à temperatura ambiente, por 10 minutos. As placas

foram então lavadas por 4 vezes consecutivas com solução de ácido acético 1% (v/v) e, após

secagem completa à temperatura ambiente, o corante ligado às proteínas celulares foi

solubilizado com 150 μL/compartimento de Trizma Base (10 mM, pH 10,5, Sigma-Aldrich®).

A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em leitor de microplacas a 540 nm

(Molecular Devices®, modelo VersaMax).

C. Análise dos resultados

As médias das absorbâncias foram calculadas descontando o valor de seus

respectivos brancos e, através das fórmulas a seguir, foi determinado o crescimento celular

(em porcentagem) de cada linhagem celular em função das concentrações de cada amostra

testada.

Se T > T1, a amostra estimulou o crescimento.

Se T0 ≤ T < T1, a amostra foi citostática e a fórmula utilizada foi 100 x [(T-T0)/

(T1-T0)].

Se T< T0, a amostra foi citocida e a fórmula utilizada foi 100 x [(T- T0)/(T0)].

Sendo T a média das absorbâncias das células tratadas, T1 a média das

absorbâncias das células não tratadas ao final do tempo de exposição e T0 a média das

absorbâncias das células no tempo 0 (início do tempo de exposição).

45

Esses resultados foram expressos em curvas de crescimento celular para cada

linhagem em função da concentração da amostra e, a partir deles, foi calculada a concentração

efetiva GI50 (concentração necessária para inibição de 50% da viabilidade celular), através de

regressão não linear, tipo sigmoidal, empregando-se software Origin 8.0 (OriginLab

Corporation).

4.3.3 Teste de indução de micronúcleo in vitro

A avaliação da mutagenicidade por meio do teste de indução de MNs com

bloqueio da citocinese foi feita para alguns padrões (Sigma-Aldrich®

) dos principais

compostos presentes no OEBt cv. CPQBA 1, bem como para as amostras OEBt CPQBA e

OEBt comercial. Assim, os compostos mirceno, E-cariofileno, α-pineno e β-pineno foram

avaliados no teste de indução de micronúcleos na concentração de 0,25 μg/mL, em duplicata,

e os OEBt CPQBA e comercial foram avaliados nas concentrações de 25, 12,5 e 6,25 μg/mL.

As concentrações foram escolhidas com base nos resultados dos testes de atividade

antiproliferativa.

A. Sem ativação metabólica (S9-)

O teste do micronúcleo foi conduzido em placas de 6 compartimentos (Corning®)

(Figura 8). As células CHO-K1 (2 x 105 células/compartimento) foram semeadas e incubadas

por 24 horas, a 37°C, em incubadora úmida com 5% de CO2. Em seguida, iniciou-se o

tratamento das células com meio completo (RPMI 1640, controle de células) e com as

soluções de DMSO (0,25% em meio completo, controle do solvente das amostras), MMS

(metilmetanosulfonato, 25 µg/mL em meio completo, controle positivo de indução de

micronúcleos, Sigma-Aldrich®) e amostras dos padrões e dos OEBts. Após 4 horas, o meio de

cultura foi aspirado dos compartimentos, seguido da adição de solução de citocalasina B (3

µg/mL em meio completo, Sigma-Aldrich®). As culturas retornaram à incubadora úmida de

CO2, permanecendo por 20 horas.

46

Figura 8: Esquema representativo das etapas do teste do micronúcleo, com e sem

metabolização.

Após o período de incubação por 20 horas, o meio de cultura foi aspirado de todos os

compartimentos. Em seguida, as células foram lavadas em PBS (0,2 mM, pH 7,0) e

tripsinizadas com solução de tripsina/EDTA 0,25% (Vitrocell®), sendo que o conteúdo de

cada compartimento foi transferido para um tubo cônico (15 mL) correspondente. A

suspensão celular foi centrifugada (2000 rpm, 5 minutos) e o pellet de células foi

ressuspendido em 5 mL de citrato de sódio 1% (p/v) (Synth®), a temperatura ambiente. Após

5 minutos, 5 mL de fixador metanol:ácido acético (3:1) foi adicionado aos tubos.

Posteriormente, as suspensões foram centrifugadas (2000 rpm, 5 minutos) e o pellet foi

ressuspenso em metanol:ácido acético (3:1, 5 mL) por 5 minutos e novamente centrifugados

(2000 rpm, 5 minutos). Essa etapa foi repetida mais uma vez. Concluída a etapa de

centrifugação, o sobrenadante foi descartado, deixando-se cerca de 1 mL de fixador para

ressuspender o pellet. A suspensão celular foi gotejada em três lâminas histológicas, que

Meio RPMI

DMSO 0,25%

MMS 25 µg/mL

Sem Ativação Com Ativação S9

OEBt CPQBA e

OEBt comercial (25;

12,5; 6,25 µg/mL)

Padrões 0,25 µg/mL

Meio RPMI

DMSO 0,25%

CPA 10 μg/mL

Adição de citocalasina B

3 μg/mL

Hipotonia, fixação e preparo

das lâminas

Células CHO-K1

(2x105 células/poço)

OEBt CPQBA e

OEBt comercial

(25 μg/mL)

Incubadora úmida de CO2

a 37°C por 24 horas


a 37°C por 4 horas



47

foram mantidas a 65°C sobre banho termostatizado por 3 minutos. As lâminas foram deixadas

para secar em temperatura ambiente e em local livre de poeira. Por fim, as células foram

coradas com solução de Giemsa (Dinâmica®) a 5% em água deionizada, por 20 minutos. Após

rápida lavagem em água destilada e secagem das lâminas, iniciou-se a análise em microscópio

óptico (Leica, Modelo SME), com objetiva de 40x.

B. Com ativação metabólica (S9+)

Para avaliação da influência da metabolização das substâncias sobre a ação

mutagênica, o experimento de indução de micronúcleos em células CHO-K1 foi repetido,

conforme já descrito, sendo as amostras avaliadas na presença de um adequado sistema de

metabolização, a fração microssomal S9 (Figura 8).

Para este experimento, a 1 mL água destilada foram adicionados 1,75 mL de

tampão fosfato pH 7,4, 100 μL de NADP (76,5 mg/mL), 25 μL de glicose 6-fosfato (282,1

mg/mL), 25 μL de KCl (1,65 M), 25 μL de MgCl2 (0,4 M) e 100 μL de fração S9 (mistura de

enzimas hepáticas humanas, Sigma-Aldrich®). Este mix foi adicionado às placas (90

μL/compartimento, concentração final de S9 de 2%) juntamente com as amostras a serem

testadas. Além dos controles negativo (meio de cultura) e do solvente (DMSO), utilizou-se

ciclofosfamida (CPA, Cyclophosphamide Monohydrate, 10 μg/mL, Sigma-Aldrich®) como

controle positivo. As placas foram então levadas à incubadora de CO2, por 4 horas. Ao final

deste período, seguiu-se o procedimento descrito para o teste de indução sem ativação

metabólica (item 4.3.3.A).

C. Análise dos resultados de indução de micronúcleos

Todas as lâminas foram analisadas por microscopia óptica e de cada tratamento

foram contadas no mínimo 2000 células binucleadas, sendo pelo menos 1000 células em cada

cultura. Nessa população, foi considerada a incidência de células binucleadas com 1, 2 ou 3

micronúcleos. Além disso, contou-se também a quantidade de células mononucleadas e

multinucleadas. Com esses valores experimentais, foram calculados o Índice de Proliferação

Pós-Bloqueio da Citocinese (CBPI do inglês, Cytokinesis-Block Proliferation Index), o Índice

de Replicação (RI do inglês, Replication Index), ambos para inferir a citotoxicidade das

amostras, e a frequência de micronúcleos (em porcentagem), segundo as fórmulas descritas

pela OECD 487 (2016):

48

CBPI =(n° mononucleadas) + 2(n° binucleadas) + 3(n° multinucleadas)

(n° total de células)

RI =[(n° binucleadas) + 2(n° multinucleadas)] ÷ (n° total de células da cultura tratada)

[(n° binucleadas) + 2(n° multinucleadas)] ÷ (n° total de células do controle)× 100

% frequência micronúcleos =(n° total de micronúcleos)

(total de células binucleadas)× 100

Todos os resultados foram submetidos à análise de variância de uma única via

(ANOVA), considerando-se como nível crítico p ≤ 0,05 para que fosse considerada diferença

significante entre os grupos, seguida de Teste de Tukey com auxílio do software GraphPad

Prism 7.0.

4.3.4 Avaliação da genotoxicidade pelo teste Cometa

As amostras de OEBt CPQBA e OEBt comercial foram avaliadas quanto ao

potencial genotóxico por meio do teste Cometa para avaliação de danos ao DNA.

O teste foi conduzido em placa de 12 compartimentos (Corning®), em duplicatas.

As células CHO-K1 (1 x 105 células/compartimento) foram semeadas e incubadas por 24

horas, a 37°C, em incubadora úmida com 5% de CO2. Em seguida, iniciou-se o tratamento

das células com meio completo (controle de células) e com as soluções de DMSO (0,25%,

controle do solvente das amostras), MMS (metilmetanosulfonato, 25 µg/mL, controle positivo

S9-) e de amostras OEBts (CPQBA e comercial) nas concentrações de 25; 12,5 e 6,25 μg/mL.

Para o teste com presença do sistema de ativação metabólica S9, utilizou-se CPA como

controle positivo (20 μg/mL) e as amostras de OEBts foram testadas na concentração de 25

μg/mL (Figura 9).

49

Figura 9: Esquema representativo das etapas do teste Cometa, com e sem metabolização.

Após 4 horas de exposição, o meio de cultura foi aspirado de todos os

compartimentos. Em seguida, as células foram lavadas em tampão fosfato salina (pH 7,0) e

tripsinizadas com solução de tripsina/EDTA 0,25% (Vitrocell®), sendo que o conteúdo de

cada compartimento foi transferido para um microtubo (1,5 mL) correspondente. A suspensão

celular foi centrifugada (1000 rpm, 3 minutos), o sobrenadante foi descartado e o pellet de

células foi ressuspendido com 100 µL de agarose de baixo ponto de fusão 0,5% (Sigma-

Aldrich®) a 40°C. O conteúdo foi distribuído em duas lâminas previamente limpas (com

Extran® 3% e etanol absoluto) contendo uma fina camada de agarose a 1,5% com ponto de

fusão normal. Após adição da suspensão celular, colocou-se uma lamínula grande (24 x 60

mm) sobre as lâminas e as mesmas foram deixadas na geladeira por 5 minutos.

Meio RPMI

DMSO 0,25%

MMS 25 µg/mL

Sem Ativação Com Ativação S9

OEBt CPQBA e

OEBt comercial (25;

12,5; 6,25 µg/mL)

Meio RPMI

DMSO 0,25%

CPA 20 μg/mL

Preparo das lâminas em agarose e etapa de lise celular

Eletroforese

(25 volts, 300 mA, 25 minutos)

Células CHO-K1

(1x105 células/poço)

OEBt CPQBA e

OEBt comercial

(25 μg/mL)




a 37°C por 4 horas

Refrigeração a 4°C por 24 horas

(ao abrigo da luz)

Neutralização, fixação, coloração e análise em

microscópio de fluorescência

50

Após, as lamínulas foram retiradas cuidadosamente das lâminas e estas foram

mergulhadas em uma solução de lise de uso gelada [solução de lise estoque (NaCl 2,5 M;

EDTA 100 mM; Tris 10 mM, em pH 10) acrescida de Triton-X 1% e DMSO 10%] e deixadas

sob refrigeração overnight, ao abrigo da luz.

Posteriormente, as lâminas foram retiradas da solução de lise e acondicionadas do

polo negativo para o positivo em uma cuba de eletroforese envolvida em banho de gelo. As

lâminas foram deixadas na cuba por 20 minutos já com o tampão de eletroforese pH 13

(EDTA 0,5% e NaOH 3%) para promover o relaxamento das fitas de DNA. A fonte de

eletroforese foi regulada para 25 volts e 300 mA, com tempo total de corrida da eletroforese

de 25 minutos, em ambiente escuro. Após isso, as lâminas foram retiradas cuidadosamente da

cuba e mergulhadas na solução de neutralização pH 7,5 (Tris-HCl 0,4 M) e deixadas por 15

minutos sob refrigeração. Após esse tempo, as lâminas foram fixadas em etanol absoluto,

secas em temperatura ambiente e conservadas a 4ºC até a análise.

A. Análise dos resultados

No momento da leitura, as lâminas foram coradas com cerca de 50 μL de solução

de brometo de etídio (20 µg/mL), cobertas com lamínula grande (24 x 60 mm) e lidas

imediatamente após a coloração. A análise foi realizada em microscópio de fluorescência

(Carl Zeiss MicroImaging GmbH, filtro de 516-560 nm, barreira de filtro 590 nm) em

aumento de 200x e 400x, para permitir a visualização dos nucleoides.

Através de parceria com a profa. Dra. Glaucia Maria Pastore e sua doutoranda

Iramaia Angélica Neri-Numa (FEA/UNICAMP) foi possível realizar a análise das imagens

dos nucleoides empregando-se o software Comet Imager v 2.2.1 (MetaSystems GmbH), que

forneceu os parâmetros “% de DNA”, no qual calcula-se a quantidade de DNA presente na

cauda do cometa (marcador direto de dano ao DNA) e “tail moment Olive – TMO”, que

estabelece uma relação entre o comprimento da cauda e a quantidade (%) de DNA que

migrou.

Os resultados de tail moment Olive e da porcentagem de DNA na cauda foram

expressos como valores médios ± erro padrão e submetidos à análise de variância de uma

única via (ANOVA), considerando-se como nível crítico p ≤ 0,05 para que fosse considerada

diferença significante entre os grupos, seguida de Teste de Tukey com auxílio do software

GraphPad Prism 7.0.

51

4.4 Análises in vivo

4.4.1 Animais

Todos os experimentos empregaram camundongos fêmeas, da linhagem Swiss,

com 6 a 8 semanas de idade e 18 a 25 gramas de massa corpórea, obtidos do Centro

Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório

(CEMIB/UNICAMP). Os grupos experimentais foram acondicionados no biotério da Divisão

de Farmacologia e Toxicologia (CPQBA/UNICAMP), com temperatura de 22ºC ± 2ºC, ciclo

claro:escuro 12 horas:12 horas e com água e ração ad libitum. Os cuidados dos animais e os

protocolos de pesquisas estão de acordo com os princípios e diretrizes adotadas pelo Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), sob supervisão da médica veterinária Dra.

Karin Maia Monteiro (CRMV–SP 19683).

4.4.2 Preparo das amostras

As alíquotas dos óleos essenciais de B. trimera (OEBt CPQBA e OEBt

comercial), foram diluídas em tampão fosfato (0,2 mM pH 7,0) preparado em solução de

NaCl 0,9% (tampão PBS) com auxílio de Tween 80 (0,3%). Desta forma, a mistura

PBS+Tween 80 foi administrada como veículo em todos os experimentos in vivo.

4.4.3 Toxicidade oral aguda

A fim de complementar os dados toxicológicos, realizou-se o teste de toxicidade

oral aguda. O experimento foi realizado após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de

Animais da Universidade Estadual de Campinas (CEUA/UNICAMP), sob protocolo número

3547-1. O teste de toxicidade oral aguda foi baseado no protocolo da OECD 425/2008 - Acute

Oral Toxicity: Up-and-Down-Procedure, com modificações no número de doses.

Para iniciar este experimento, retomou-se o resultado do teste de atividade

antiproliferativa em cultura de células HaCaT (linhagem de queratinócitos humanos), a fim de

estimar a dose inicial das duas amostras de OEBts (CPQBA e comercial) no experimento de

toxicidade oral aguda, de acordo com a fórmula descrita no guia OECD 129/2010 (Guidance

Document on Using Cytotoxicity Tests to Estimate Starting Doses for Acute Oral Systematic

Toxicity Tests), adaptado para a utilização de células imortalizadas da linhagem HaCaT:

logDL50 = 0,372 × logIC50 + 2,024

Onde:

52

DL50 representa a dose, em mg/kg, necessária para matar 50% de uma população

em teste;

IC50 é a concentração, em µg/mL, capaz de inibir 50% da densidade celular.

A partir da substituição do valor de IC50 na linhagem 3T3 (fibroblasto

embrionário murino) pelo valor de GI50 na linhagem HaCaT, foram estipuladas as doses de

800, 400 e 200 mg/kg para o teste de toxicidade oral aguda, visando a determinação da dose

máxima tolerável para cada uma das duas amostras.

Os camundongos foram separados aleatoriamente em sete grupos experimentais

(n = 5 animais/grupo) e colocados em jejum, com água ad libitum, por 8 horas. Ao final desse

período, iniciou-se o tratamento por via oral com veículo (10 mL/kg, v.o., controle negativo),

OEBt CPQBA (200, 400 e 800 mg/kg, v.o.) e OEBt comercial (200, 400 e 800 mg/Kg, v.o.).

Após a administração via oral das amostras, todos os animais foram observados

ininterruptamente durante as primeiras quatro horas e, depois, diariamente quanto aos seus

sinais clínicos por um período de 14 dias. Nesse intervalo, foram analisados sinais clínicos de

toxicidade geral como os efeitos na locomoção, comportamento (agitação, atividade

exploratória reduzida, sonolência), alteração na respiração, salivação, lacrimejamento, cianose

de extremidades e mortalidade. O peso corporal dos animais foi avaliado nos tempos 0, 4, 7,

11 e 14 dias. Após 14 dias, os animais foram submetidos à eutanásia por aprofundamento de

anestesia seguido de deslocamento cervical e alguns órgãos internos (coração, pulmão, fígado,

rins e baço) foram analisados macroscopicamente e pesados.

4.4.4 Teste do micronúcleo in vivo

O teste do micronúcleo in vivo foi realizado a fim de avaliar a influência do

processo de metabolização sobre o potencial mutagênico das amostras. O experimento foi

realizado após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade

Estadual de Campinas (CEUA/UNICAMP), sob protocolo número 3548-1.

A partir do teste de toxicidade oral aguda, determinou-se que a máxima dose

tolerável (MDT) para as amostras de OEBts, CPQBA e comercial, foi 800 mg/kg. Como o

teste de indução de micronúcleos in vivo, segundo o guia da OECD 474/2014 (Guideline for

the testing of chemicals - Mammalian erythrocyte micronucleus test), propõe o tratamento

durante, pelo menos, três dias (doses repetidas) com a amostra teste, optou-se pela maior dose

correspondente a cerca de 40% da MDT, a fim de evitar possíveis efeitos tóxicos em função

53

da maior exposição dos animais à amostra (Mi et al., 2009). Assim, avaliou-se o potencial de

indução de micronúcleos das amostras nas doses de 300, 150 e 75 mg/kg.

Os camundongos foram pesados, identificados e distribuídos aleatoriamente em

sete grupos experimentais, os quais foram tratados por via oral com o veículo (controle

negativo, 10 mL/kg, n = 12 animais), OEBt CPQBA (75, 150 e 300 mg/kg, n = 6

animais/dose) e OEBt comercial (75, 150 e 300 mg/kg, n = 6 animais/dose) durante três dias

consecutivos. No terceiro dia, metade dos animais do grupo veículo (n = 6 animais) foram

tratados com ciclofosfamida, via intraperitoneal, dispersa no veículo na dose de 50 mg/kg

(controle positivo). No quarto dia, todos os animais foram eutanasiados por aprofundamento

de anestesia seguido de deslocamento cervical para análise macroscópica de órgãos; retirada

de órgãos de metabolismo (baço, rins e fígado), cujas massas foram mensuradas; e retirada da

medula óssea para avaliação da frequência de micronúcleos. Antes do início do tratamento e

no quarto dia, fez-se a coleta de sangue de cada animal, após sedação, via plexo retro-orbital,

visando comparar os parâmetros do hemograma antes e após o tratamento, utilizando o

analisador hematológico Sysmex pocH-100iV Diff ™.

Para avaliação da frequência de micronúcleos, a medula óssea de ambos os

fêmures de cada animal foi lavada uma única vez com 1,5 mL de soro fetal bovino por fêmur

com auxílio de seringa. As suspensões celulares resultantes dos fêmures de cada animal foram

recolhidas em tubos cônicos de 15 mL e centrifugadas a 2000 rpm, por 10 minutos. Parte do

sobrenadante foi descartada e o restante (cerca de 300 µL) foi utilizado para homogeneização

do material e preparo dos esfregaços, sendo confeccionadas três lâminas por animal.

Após secagem, as lâminas foram submersas por 3 minutos no corante eosina/azul

de metileno modificado (Leishman, Merck®). Após, foram transferidas para uma solução

diluída do mesmo corante (1:6, corante:metanol) durante 15 minutos. Em seguida, as lâminas

foram lavadas em água corrente para retirada do excesso do corante e, por último,

mergulhadas em água destilada e colocadas para secar a temperatura ambiente. Após

completa secagem, utilizou-se Entellan® e lamínulas para confecção das lâminas permanentes.

A contagem dos micronúcleos foi feita por microscopia óptica (Leica, Modelo SME),

utilizando objetiva de 100x.

A. Análise dos resultados de indução de MNs

Os MNs foram analisados em pelo menos 2000 eritrócitos policromáticos (PCEs,

eritrócitos jovens) por animal. Todos os resultados foram submetidos à análise de variância de

uma única via (ANOVA), considerando-se como nível crítico p ≤ 0,05 para que fosse

54

considerada diferença significativa entre os grupos, seguida de Teste de Tukey com auxílio do

software GraphPad Prism 7.0.

A frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados (MNPCE), expressa

em porcentagem, foi determinada pela seguinte equação:

% MNPCE =(n° de MNPCE)

(n° de células analisadas)× 100

4.5 Estudos da metabolização do óleo essencial

Para avaliação in vitro da metabolização das substâncias presentes no OEBt

CPQBA e OEBt comercial, foram aplicadas duas estratégias analíticas. Assim, as análises por

ESI-MS de alta resolução foram realizadas em parceria com o prof. Dr. Rodrigo R. Catharino

e o doutorando Carlos Melo (Innovare Laboratório de Biomarcadores, FCF/UNICAMP);

enquanto as análises por cromatografia gasosa acoplada ao detector seletivo de massas após

aplicação da técnica de extração por headspace dinâmico a partir do óleo disperso em meio de

cultura foram conduzidas no Laboratório de Cromatografia Gasosa e Microtécnicas de Extração,

IQ/UNICAMP, sob supervisão do prof. Dr. Fábio Augusto e o doutorando João Raul Belinato de

Souza.

4.5.1 Análise por espectrometria de massas com ionização por electrospray

(ESI-MS) de alta resolução

Inicialmente, as amostras dos dois OEBts foram diluídas em meio de cultura

(RPMI 1640/SFB 5%/DMSO 0,25%) na maior concentração não citostática de cada amostra

(25 µg/mL). Essas soluções foram divididas em seis alíquotas, sendo três delas tratadas com o

mix S9 [1 mL água destilada, 1,75 mL de tampão fosfato pH 7,4, 100 μL de NADP (76,5

mg/mL), 25 μL de glicose 6-fosfato (282,1 mg/mL), 25 μL de KCl (1,65 M), 25 μL de MgCl2

(0,4 M) e 100 μL de fração S9 (mistura de enzimas hepáticas humanas, Sigma-Aldrich®)

] (60

µL/microtubo, concentração final de S9 de 2%) e todas foram incubadas a 37°C. Também

foram preparados controles contendo apenas o meio de cultura completo e o meio acrescido

de mix S9. Após, 5 alíquotas de 200 µL de cada condição foram retiradas, congeladas a -20°C

para posterior análise por ESI-MS de alta resolução, juntamente com as amostras puras dos

dois OEBts.

Para a aquisição dos dados de espectrometria de massas, cada amostra foi

descongelada e injetada diretamente (análise de fingerprint) em equipamento ESI-LTQ-XL

55

Orbitrap Discovery (Thermo Scientific) com resolução nominal de 30.000 (FWHM). As

amostras foram analisadas em modos positivo e negativo, no intervalo de massa de 50 a 1000

m/z, sob as condições de taxa de fluxo de 10 mL/min, fluxo do gás de arraste em 5 unidades

arbitrárias, tensão do spray de 5 kV e temperatura do capilar de 280°C. A análise EMAR foi

realizada em triplicata biológica com quintuplicata (Machado et al., 2013).

Para a análise estatística, utilizou-se a análise de mínimos quadrados parciais com

análise de discriminantes (PLS-DA), um método supervisionado que utiliza técnicas de

regressão multivariada para extrair, através da combinação linear das variáveis originais, as

características que podem apontar a associação com uma determinada classe. A significância

estatística do modelo foi avaliada por dois testes de permutação, a saber, a precisão da

previsão durante a modelagem e a distância de separação; nos dois testes foi utilizado o

número de 2000 permutações. A seleção dos íons característicos de cada amostra foi realizada

pelo impacto de cada composto na análise, através da importância da variável na projecção

(VIP), que consiste na soma ponderada dos quadrados das cargas PLS e leva em conta a

quantidade da variação explicada em cada dimensão utilizada no modelo; como ponto de

corte foram analisados apenas os marcadores com VIP score maior que 1.5. As análises foram

feitas utilizando o software MetaboAnalist 3.0.

4.5.2 Microextração em fase sólida - Headspace dinâmico, com análise por

CG/EM

Foram preparados em tubos de centrífuga de fundo cônico (15 mL) as amostras de

meio de cultura (RPMI 1640/SFB 5%/DMSO 0,25%, 4 mL) com e sem adição de mix S9 e de

cada um dos OEBts (CPQBA e comercial, 4 mL cada), na concentração de 50 µg/mL,

também com e sem adição de mix S9 (preparado como descrito no item 4.5.1). Para as

amostras com ativação metabólica foram adicionados 100 μL de mix S9 (concentração final

de S9 de 2%). As soluções foram incubadas em estufa de CO2 5% a 37°C durante 4 horas e,

em seguida, foram mantidas congeladas a -20°C até o momento das análises.

Após descongelamento, a extração dos compostos foi feita através da técnica de

microextração em fase sólida (SPME, solid phase microextraction) em headspace dinâmico.

Cada amostra foi transferida para um frasco de vidro de 20 mL que foi vedado e

acondicionado, sob agitação de 500 rpm, em banho termostatizado a 40°C, com tempo de pré-

equilíbrio de 10 minutos. Em seguida, realizou-se a extração dos compostos no headspace

utilizando uma fibra comercial recoberta com polidimetilsiloxano-divinilbenzeno (PDMS-

56

DVB, 65 µm, Supelco). Após 30 minutos de extração, os analitos extraídos foram

imediatamente dessorvidos por 10 minutos no injetor do cromatógrafo.

As separações cromatográficas foram conduzidas usando cromatografia gasosa com

detecção por espectrometria de massas (CG/EM). O equipamento utilizado foi CG-QMS, modelo

QP2010 Plus da Shimadzu equipado com coluna HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm, Supelco).

Para a aquisição dos dados CG/EM foi utilizado o software GCMSsolution versão 5.3 (Shimadzu).

As condições cromatográficas de operação foram otimizadas para programa de temperatura: 60°C

– 150°C com 3°C/min; 150°C – 240°C com 8°C/min; vazão: 1.0 mL/min; modo injeção: Splitless;

gás arraste: Hidrogênio 5.0; temperatura do injetor: 250°C. Para o espectrômetro de massas,

utilizou-se a temperatura da fonte de íons: 200°C; temperatura da interface: 250°C; voltagem: 0,9

kV; faixa de massa: 40 - 500 m/z; taxa de aquisição dos espectros: 10 Hz; ionização por elétrons

(70 eV).

57

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Rendimento do OEBt (% m/m) e teor de umidade (% m/m)

Após o processo de hidrodestilação (Figura 10) das partes aéreas de B. trimera cv.

CPQBA 1 coletadas de Janeiro a Dezembro de 2014, foram calculados os rendimentos dos

OEBts CPQBA 1 em base fresca e em base seca (Figura 11), bem como o teor de umidade das

partes aéreas coletadas (Tabela 2, Figura 12).

Figura 10: Sistema para extração do óleo essencial.

A

B

(A) Sistema de hidrodestilação e (B) detalhe do óleo essencial recolhido (Fonte: própria autora).

58

Tabela 2: Dados mensais de massa coletada de partes aéreas de B. trimera cv. CPQBA 1,

massa de óleo essencial (OE) obtido, rendimento de OE em base seca e fresca, teor de

umidade das partes aéreas e precipitação pluviométrica.

a = rendimento do OEBt (% m/m) em função da massa fresca de material vegetal; b = rendimento do OEBt (% m/m) em função da massa seca de material vegetal; c = teor de umidade da planta (% m/m); d = volume total de

chuvas no período de um mês (dados referentes ao mês anterior ao mês de coleta; Fonte: Brasil, 2015).

Figura 11: Perfil do rendimento dos óleos essenciais em bases fresca e seca (% m/m) em

função do mês de coleta ao longo de 2014.

OEs obtidos das partes aéreas de B. trimera cv. CPQBA 1 coletadas no período de Janeiro a Dezembro de 2014.

JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

Rendimento fresco

Rendimento seco

Mês/2014

Ren

dim

ento

fre

sco

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Ren

dim

ento

seco

Época

da coleta

(2014)

Massa de

planta

(g)

Massa

OE (g)

Rendimento

frescoa

Rendimento

secob

Teor de

umidadec

Precipitação

(soma)d

Janeiro 1498,18 0,8960 0,060 0,140 57,40 82,30

Fevereiro 1515,42 0,7553 0,050 0,126 60,37 152,66

Março 2114,77 1,1899 0,056 0,251 64,36 16,07

Abril 2400,30 1,8002 0,075 0,209 64,19 103,88

Maio 2613,14 1,9679 0,075 0,244 62,72 74,41

Junho 2423,68 1,2798 0,053 0,133 60,28 28,90

Julho 2372,71 1,0391 0,044 0,090 51,81 6,10

Agosto 1313,34 0,7716 0,059 0,147 60,14 25,39

Setembro 950,60 0,7153 0,075 0,230 67,31 6,35

Outubro 1378,46 1,0641 0,077 0,248 68,83 74,16

Novembro 1430,80 0,9206 0,064 0,203 68,27 26,42

Dezembro 788,12 0,5414 0,069 0,235 70,80 125,21

59

Figura 12: Comparação entre o teor de umidade (% m/m) das partes aéreas de B. trimera,

coletadas no período de Janeiro a Dezembro de 2014, e o rendimento de óleo essencial em

base seca (A) e base úmida (B).

A

B (A) Rendimento do OE em base seca; (B) Rendimento do OE em base fresca.

De acordo com a Tabela 2 e a Figura 11, o maior rendimento do OEBt CPQBA 1,

em base seca, foi obtido no mês de março/2014 (0,251%), o que diferiu do observado na

coleta realizada durante o ano de 2012, no qual o maior rendimento, em base seca, foi obtido


0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Rendimento seco

Teor de umidade

Mês/2014

Ren

dim

ento

sec

o

40

45

50

55

60

65

70

75

Teo

r de u

mid

ade


0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

Rendimento fresco

Teor de umidade

Mês/2014

Ren

dim

ento

fre

sco

40

45

50

55

60

65

70

75

Teo

r de u

mid

ade

60

no mês de janeiro (0,262%) (Della Torre, 2013). Como esperado, observou-se uma queda

significativa no rendimento entre os meses de maio e julho (de 0,244% a 0,090%), trimestre

que compreende o período de florescimento da planta. Porém, na avaliação durante o ano de

2012, observou-se que o rendimento de extração do OE, em base seca, permaneceu baixo até

o mês de outubro (Della Torre, 2013), enquanto que em 2014 houve uma recuperação do

rendimento, em base seca, já a partir do mês de agosto (Tabela 2). Essa variação pode ser, em

parte, também atribuída às alterações no volume de chuvas (soma de precipitação), que em

2014 (Tabela 2) seguiram um padrão diferente do observado para 2012 (Della Torre, 2013).

Com relação ao rendimento em função da massa fresca, o perfil geral acompanhou

o observado para o rendimento em base seca (Tabela 2, Figura 11). Em janeiro/2014, o

rendimento em função da massa fresca foi de 0,060% (m/m), bem menor do que o observado

para o mês de janeiro de 2012 (0,093%), quando o volume de chuvas observado (soma da

precipitação referente ao mês anterior da coleta) foi de 227,3 mm, ao passo que para o ano de

2014 foi de 82,3 mm (Tabela 2, Figura 11). O menor rendimento foi observado no mês de

julho (0,044%), mês em que houve o menor volume de chuvas (6,1 mm) (Tabela 2).

Além disso, houve uma convergência entre o teor de umidade das partes aéreas e

o rendimento de extração do óleo essencial, tanto em base seca quanto em base fresca; ou

seja, os meses nos quais a planta apresentou maior teor de umidade corresponderam aos

meses nos quais o processo de extração obteve os maiores rendimentos (Figura 12). Tanto o

excesso quanto a falta de água no solo podem levar a um aumento da produção de óleo

essencial (Figueiredo et al., 2008); nossos dados, obtidos de coletas mensais realizadas em

2012 (Della Torre, 2013) e em 2014, apontam que um dos fatores que afetam a fisiologia da

espécie B. trimera é a umidade relativa do solo, sugerindo que a irrigação normal ou alta seja

importante para produção de bons rendimentos de OE.

5.2 Análise qualitativa por cromatografia a gás acoplada a detector de

massas (CG/EM)

Através da análise por CG/EM (Tabela 3) dos OEs obtidos das partes aéreas de B.

trimera CPQBA 1, coletadas de Janeiro a Dezembro de 2014, do OEBt CPQBA (mistura em

iguais proporções dos óleos obtidos durante 2014) e da amostra comercial de OEBt, foi

possível identificar como majoritários, nas amostras provenientes de B. trimera CPQBA 1, os

compostos biciclogermacreno (12,43% a 22,52%), E-cariofileno (12,98% a 16,68%),

germacreno D (9,56% a 14,28%), β-pineno (4,45% a 11,45%), β-mirceno (3,35% a 7,61%) e

δ-cadineno (5,83% a 8,53%) (Figura 13). Diferentemente, o lote comercial do OE da mesma

61

espécie, proveniente do Rio Grande do Sul, apresentou 65,36% de acetato de carquejila e

7,58% de palustrol (Figura 14).

Figura 13: Estrutura química dos compostos majoritários identificados no OEBt CPQBA 1.

Biciclogermacreno E-cariofileno Germacreno D

-pineno

-mirceno -cadineno

Refletindo a variação na composição química (Tabela 3, Figuras 13 e 14), a

amostra OEBt CPQBA apresentou um predomínio de compostos sesquiterpenos

hidrocarbonetos (SH, 52,75 – 64,02%) enquanto a amostra OEBt comercial apresentou

predomínio de sesquiterpenos oxigenados (SO, 72,94%) (Tabela 4, Figura 15).

Figura 14: Estrutura química dos compostos majoritários identificados no OEBt comercial.

Acetato de carquejila Palustrol

62

Tabela 3: Compostos identificados, por CG/EM, nos óleos essenciais das partes aéreas de B. trimera (Less.) DC.

tr: tempo de retenção (minutos); IRRcal: índice de retenção relativa calculado; IRRlit; índice de retenção relativa descrito na literatura (Adams, 2007); (-) composto ausente.

*Em destaque, as porcentagens relativas dos compostos majoritários.

tR (min) Composto IRRCal IRRLit Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez CPQBA Comercial

5,59 α-pineno 925 932 0,64 0,94 1,69 1,16 1,45 1,27 1,10 0,73 0,64 0,74 1,07 0,88 1,05 -

6,62 Sabineno 963 969 - - - - - - - - - - - - - 0,64

6,73 β-pineno 968 974 4,45 6,71 11,45 7,70 9,83 8,92 7,67 4,97 4,71 5,02 7,78 6,66 7,32 2,79

7,09 β-mirceno 981 988 4,23 4,06 5,17 5,44 7,61 6,30 6,79 4,95 4,52 3,67 5,77 3,35 5,30 -

8,30 Limoneno 1020 1024 - - - - - - - - - - - - - 2,53

8,94 E-β-ocimeno 1038 1044 1,70 1,87 2,71 2,40 2,92 3,01 3,36 1,99 2,15 2,00 2,73 1,54 2,40 1,85

19,16 Acetato de carquejila 1293 1298 - - - - - - - - - - - - - 65,36

22,83 β-elemeno 1381 1389 0,67 0,54 0,66 0,53 0,54 0,47 0,69 0,68 0,58 0,72 0,77 0,63 0,64 2,60

23,97 E-cariofileno 1408 1417 16,68 15,84 12,98 16,38 15,75 14,29 15,95 14,13 13,65 15,71 16,34 15,65 15,24 -

24,70 α-guaiaeno 1426 1437 2,82 2,90 2,63 3,69 3,85 3,24 3,00 2,63 2,43 2,83 2,08 2,50 2,87 -

25,29 α-humuleno 1441 1452 1,98 1,73 1,74 1,85 1,83 1,66 1,89 1,67 1,59 1,72 1,92 1,75 1,79 -

26,26 γ-muuroleno 1465 1478 2,31 1,75 2,33 2,42 2,54 1,49 2,05 1,72 1,61 2,04 2,02 1,78 2,02 -

26,44 Germacreno D 1469 1484 13,03 10,16 10,53 10,20 9,76 9,56 11,11 14,57 13,32 12,28 14,28 13,63 11,85 3,47

27,09 Biciclogermacreno 1485 1500 16,05 17,96 12,43 15,79 15,69 16,06 15,10 21,61 22,52 19,15 14,86 19,47 17,16 2,67

27,19 α-muuroleno 1488 1500 1,60 1,25 1,55 1,62 1,67 1,32 1,42 1,18 1,16 1,23 1,39 1,17 1,38

28,11 δ-cadineno 1511 1522 8,53 6,47 7,90 7,56 7,58 6,62 7,08 5,83 5,89 6,14 7,46 6,03 6,85 -

29,78 Palustrol 1555 1567- - - - - - - - - - - - - - 7,58

30,71 espatulenol 1579 1577 1,99 2,75 2,93 2,38 2,26 2,86 1,78 3,61 2,03 3,45 1,68 2,12 2,30 -

31,09 globulol 1589 1590 2,39 2,44 2,10 2,13 1,88 2,54 1,80 1,59 2,20 2,06 1,75 2,33 1,99 -

32,59 τ-muurolol 1629 1640 4,49 3,55 3,73 3,34 3,00 3,38 3,02 2,80 3,55 3,29 3,57 3,78 3,39 -

33,05 α-cadinol 1641 1652 4,89 3,77 3,82 3,86 3,13 3,69 2,93 2,93 4,17 3,93 4,29 5,11 3,70 -

63

Tabela 4: Composição dos óleos essenciais de Baccharis trimera por grupos de compostos.

OEs/2014

% área relativa

Monoterpenos

Hidrocarbonetos

Sesquiterpenos

Hidrocarbonetos

Sesquiterpenos

oxigenados

Total

Identificado

Janeiro 9,32 63,67 13,76 86,75

Fevereiro 13,58 58,60 12,51 84,69

Março 21,02 52,75 12,58 86,35

Abril 16,70 60,04 11,71 88,45

Maio 21,81 59,21 10,27 91,29

Junho 19,50 54,71 12,47 86,68

Julho 18,92 58,29 9,53 86,74

Agosto 12,64 64,02 10,93 87,59

Setembro 12,02 62,75 11,95 86,72

Outubro 11,43 61,82 12,73 85,98

Novembro 17,35 61,12 11,29 89,76

Dezembro 12,43 62,61 13,34 88,38

CPQBA* 16,07 59,80 11,38 87,25

Comercial# 7,81 8,74 72,94 89,49

* mistura, em parte iguais, dos OEs coletados durante o ano de 2014; # OE de B. trimera comercial proveniente

do Rio Grande do Sul.

De acordo com a literatura, o óleo essencial de B. trimera apresenta um

predomínio de substâncias sesquiterpênicas podendo ser dividido em dois quimiotipos, a

saber, aqueles ricos em sesquiterpenos hidrocarbonetos (Silva et al., 2007; Lago et al., 2008a

e 2008b; Oliveira et al., 2012) e os OEs com predomínio de sesquiterpenos oxigenados

(Besten et al., 2013; Caneschi et al., 2015; Minteguiaga et al., 2015). Como essa variação

parece coincidir com a mudança do local de coleta (predomínio de SH em indivíduos

coletados na região Sudeste e predomínio de SO em indivíduos coletados na região Sul),

novos estudos de variabilidade genética poderão ser realizados a fim de determinar se são

variedades diferentes e/ou de interferência do ambiente de cultivo.

64


Baccharis trimera.


20

40

60

80

100Á

rea

rela

tiv

a (%

)

Mês de Coleta/2014

Monoterpenos Hidrocarbonetos

Sesquiterpenos Hidrocarbonetos

Sesquiterpenos Oxigenados

A

B

(A) variação dos grupos de compostos presentes em OEBt CPQBA em função do mês de coleta; (B) comparação

dos grupos de compostos identificados em OEBt CPQBA e OEBt comercial.

CPQBA Comercial

0

25

50

75

100

Áre

a r

ela

tiv

a (

%)

Amostra de OE

Sesquiterpenos Oxigenados

Sesquiterpenos Hidrocarbonetos

Monoterpenos Hidrocarbonetos

65

5.3 Análises in vitro

5.3.1 Atividade antioxidante

A respiração aeróbica, essencial a grande parte dos organismos vivos na Terra,

apresenta uma desvantagem perigosa, a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs).

Essas espécies radicalares são altamente reativas e podem provocar danos às macromoléculas,

como lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos. Para sua proteção, os organismos vivos

desenvolveram uma série de estratégias antioxidantes, endógenas e adquiridas pela

alimentação, a fim de manter as concentrações de EROs em níveis homeostáticos. O

desequilíbrio desse sistema (EROs/antioxidantes) tem sido relacionado com a gênese de

diversas patologias (Egea et al., 2017).

Na busca por substâncias antioxidantes que possam ser utilizadas seja na

prevenção/tratamento de doenças, seja como aditivos industriais, muitas técnicas in vitro

foram desenvolvidas e têm sido utilizadas a fim de avaliar substâncias e/ou misturas com

promissora capacidade antioxidante (Huang et al., 2005; Apak et al., 2016a).

De acordo com as reações químicas envolvidas, grande parte dos métodos

utilizados para avaliar a capacidade antioxidante pode ser dividida em duas categorias: (1)

baseados na reação de transferência de elétrons, representados pelo método de sequestro de

radicais livres que envolvem um radical cromóforo, simulando as espécies reativas de

oxigênio e de nitrogênio, dos quais se destacam os radicais DPPH• e ABTS

•+ (Roesler et al.,

2007; Scherer e Godoy, 2009; Apak et al., 2016a) e (2) baseados na reação de transferência

de átomos de hidrogênio, representada pelo método de capacidade de absorção de radicais de

oxigênio - ORAC (Prior et al., 2003; Dávalos et al., 2004; Huang et al., 2005; Apak et al.,

2016b).

Na Tabela 5, estão apresentados os resultados obtidos na avaliação da capacidade

antioxidante dos OEBt CPQBA e comercial, bem como de alguns padrões de referência. Nos

três protocolos utilizados, os resultados foram expressos como equivalentes de Trolox por

grama de amostra (TE μg/g). O Trolox (ácido 6-hidroxil-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-

carboxílico) é um análogo hidrossolúvel de vitamina E amplamente utilizado como padrão de

referência em protocolos de atividade antioxidante (Sánchez-Moreno, 2002; Huang et al.,

2005; Prior et al., 2005).

66

Tabela 5: Capacidade antioxidante das amostras de OEBt e padrões de referência.

Amostras

DPPH ABTS-L ORAC-H ORAC-L

(TE µg/g)

OEBt CPQBA 2,06 ± 0,54

(I% = 7,0)

20,80 ± 0,75

(I% = 70,3) 473,59 ± 2,83 1772,13 ± 0,64

OEBt Comercial 2,25 ± 0,11

(I% = 7,6)

22,24 ± 0,12

(I% = 75,2) 497,68 ± 3,87 1275,47 ± 1,03

Mirceno* 0,47 ± 0,35

(I% = 1,6)

4,41 ± 0,24

(I% = 14,9) 236,26 ± 0,76 509,88 ± 0,27

E-cariofileno 0,93 ± 0,38

(I% = 3,1)

10,51 ± 0,87

(I% = 35,5) 461,05 ± 0,73 2006,64 ± 1,24

β-Pineno 1,66 ± 0,06

(I% = 5,6)

0,88 ± 0,21

(I% = 3,0) 231,65 ± 0,00 533,63 ± 0,31

α-Pineno 2,80 ± 2,44

(I% = 9,5)

18,77 ± 0,24

(I% = 63,4) 329,72 ± 0,46 851,10 ± 1,83

Valores expressos como média da triplicata ± desvio padrão.

TE µg/g: micrograma de Trolox equivalente por grama de amostra; %I: porcentagem de inibição; DPPH:

Sequestro do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•); ABTS-L: Captura do radical 2,2’-azino-bis (3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•+) da porção lipofílica; ORAC-H: Capacidade de absorção do

radical oxigênio da fração hidrofílica; ORAC-L: Capacidade de absorção do radical oxigênio da fração lipofílica;

*mistura de isômeros de posição.

Na avaliação de atividade antioxidante por métodos com predomínio de

transferência de elétrons (ABTS•+

e DPPH•), ambas as amostras de OEBt apresentaram

comportamento semelhante (Tabela 5, Figuras 16 e 17), sendo que apenas no teste de

sequestro de radicais ABTS•+

o OEBt comercial foi um pouco mais ativo do que o OEBt

CPQBA (p<0,05) (Figura 17). Os dois métodos avaliaram a capacidade de sequestrar radicais

livres de nitrogênio e esta é uma limitação das duas técnicas, uma vez que em sistemas

biológicos as espécies reativas de oxigênio são as mais frequentes (Apak et al., 2016a).

Além disso, a diferença na ordem de grandeza dos resultados (cerca de 2 TE μg/g para o

DPPH• e em torno de 20 TE μg/g para o ABTS

•+) pode ser, em parte, explicada pela

reatividade dos dois radicais. O radical DPPH• é um pouco mais estável, sendo

comercializado já na forma radicalar; por sua vez, o ABTS•+

é gerado in situ sendo, portanto,

um pouco mais reativo do que o DPPH•.

67

Figura 16: Atividade sequestradora de radical DPPH• das amostras de OEBt e padrões de

referência.

TE µg/g: micrograma de Trolox equivalente por grama de amostra. ANOVA, Teste de Tukey.

Figura 17: Atividade sequestradora de radical ABTS•+

das amostras de OEBt e padrões de

referência.

TE µg/g: micrograma de Trolox equivalente por grama de amostra. a = p<0,05, b = p<0,01 e c = p<0,001 em relação ao OEBt CPQBA; d = p<0,001 em relação ao OEBt comercial

(ANOVA, Teste de Tukey).

Com relação aos padrões de monoterpenos (mirceno, - e -pineno) e de

sesquiterpenos (E-cariofileno) hidrocarbonetos, nenhum deles apresentou diferenças

significativas entre si no teste com radical DPPH• (Tabela 5, Figura 16); porém, na avaliação

com radical ABTS•+

(Tabela 5, Figura 17), foi possível observar que a ordem na capacidade

de sequestrar radicais livres foi, do mais ativo para o menos, -pineno > E-cariofileno >

mirceno > -pineno. Destes compostos, apenas o -pineno foi identificado em ambas as

amostras de OEBt, em diferentes áreas relativas (7,32% em OEBt CPQBA e 2,79% em OEBt

comercial, Tabela 3). Considerando as diferentes composições químicas (Tabelas 3 e 4), é

0

2

4

6

TE

µg

/g

O E B t C P Q B A

O E B t C o m erc ia l

M irceno

E -cariofileno

-p ineno

-p ineno

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

O E B t C P Q B A

O E B t C o m erc ia l

M irceno

E -cariofileno

-p ineno

-p ineno

TE

µg

/g

c ,d

a

c ,d

c ,d

b ,d

68

possível que -pineno (1,05%), E-cariofileno (15,24%), mirceno (5,30%) e -pineno (7,32%)

contribuam para o efeito antioxidante do OEBt CPQBA, enquanto o acetato de carquejila

(65,36%), palustrol (7,58%) e o limoneno (2,53%) poderiam ser responsáveis pela atividade

observada para o OEBt comercial. Isso porque esses terpenos apresentam ligações duplas,

isoladas ou conjugadas, que poderiam ser sítios de reação com as espécies radicalares

(Amorati et al., 2013).

Finalmente, o método ORAC baseia-se na capacidade de uma substância em

proteger a oxidação da fluoresceína por radicais peróxidos gerados in situ, avaliada pelo

decaimento da intensidade de fluorescência (Huang et al., 2005). Este método é considerado

como mais próximo dos sistemas biológicos, uma vez que a espécie reativa gerada é uma

molécula pequena e oxigenada (radical peróxido) (Apak et al., 2016b). Para melhor avaliar as

substâncias lipossolúveis, o protocolo ORAC apresenta duas versões experimentais, cuja

diferença é a adição de ciclodextrina no modo lipofílico, a fim de melhorar a dispersão das

substâncias antioxidantes menos polares no meio reacional aquoso (Huang et al., 2005; Apak

et al., 2016b).

Figura 18: Resultados do ORAC das frações hidrofílica e lipofílica das amostras de OEBt e

padrões de referência.

TE µg/g: micrograma de Trolox equivalente por grama de amostra. a = p<0,001, em relação ao OEBt CPQBA (hidrofílico); b = p<0,001 em relação ao OEBt CPQBA (lipofílico)

(ANOVA, Teste de Tukey).

OE

Bt C

PQ

BA

OE

Bt C

om

e rcia

l

Mir

c e no

E-c

a r iof i

leno

-p

ine n

o

-p

ine n

o

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

H id ro fílico

L ip o fílico

TE

µg

/g

a aa

b

b b

b

69

No modo ORAC hidrofílico, não foi possível observar diferença entre as

atividades antioxidantes dos OEBt CPQBA e comercial. Quando se realizou o modo

lipofílico, o OEBt CPQBA apresentou atividade antioxidante superior ao OEBt comercial. O

potencial antioxidante observado pode ser, em parte, atribuído ao E-cariofileno, que

apresentou potencial antioxidante semelhante à amostra de OEBt CPQBA, tanto na fração

hidrofílica como na lipofílica (Tabela 5, Figura 18).

Diversos estudos demonstraram que óleos essenciais com mais de 10% de E-

cariofileno apresentaram efeito antioxidante em diferentes modelos experimentais, como por

exemplo, resultados obtidos para os OEs de cinamomo (Biondo et al., 2017), das folhas de

Juniperus rigida (Liu et al., 2016), das partes aéreas de Eupatorium ballotifolium (Sobrinho et

al., 2016) e das folhas de Hypericum gaitii (Kamila et al., 2017). Considerando-se os efeitos

biológicos do E-cariofileno isolado, há relatos de atividade antioxidante pelo teste de DPPH

(Dahham et al., 2015) e inibição de peroxidação lipídica induzida por enzimas hepáticas

(Calleja et al., 2013). Além disso, estudos pré-clínicos in vivo demonstraram que esse efeito

antioxidante pode auxiliar no tratamento de dislipidemias (Baldissera et al., 2017) e prevenir

lesões decorrentes de acidente vascular cerebral (Zhang et al., 2017).

Com relação aos compostos majoritários identificados no OEBt comercial, não

foram encontrados relatos a respeito da atividade antioxidante do acetato de carquejila e do

palustrol. Já o limoneno é descrito como não apresentando atividade antioxidante em pelo

menos quatro testes diferentes (DPPH, ABTS, peroxidação de lipídeos e teste de redução de

íons férricos) (Di Sotto et al., 2013).

5.3.2 Atividade antiproliferativa em cultura de células

Continuando a comparação entre os dois quimiotipos de OE de B. trimera

(CPQBA e comercial), realizou-se o teste de atividade antiproliferativa em sete linhagens

tumorais e uma linhagem não tumoral, originárias de tecidos humanos.

Para análise da proliferação celular, utilizou-se o método não-clonogênico da

sulforrodamina B, um corante proteico que se liga aos resíduos dos aminoácidos básicos das

proteínas de células que estavam viáveis no momento do processo de fixação. Portanto,

quanto maior a quantidade de SRB ligada por compartimento, menor a atividade

antiproliferativa da amostra em teste. Para a fixação das células viáveis foi empregado o ácido

tricloroacético (TCA) que atua como um fixador, precipitando proteínas. Desta forma, as

células viáveis se mantêm fixas na placa, enquanto células não viáveis são lavadas. Trata-se

de um método independente do metabolismo celular e que permite a quantificação de

70

proteínas de modo linear com o número de células da cultura, além de ser consideravelmente

rápido, simples e apresentar sensibilidade comparável à de metodologias fluorescentes. Outra

vantagem é a estabilidade da placa para leitura, pois as células são fixadas antes da etapa de

coloração e a medida da absorbância pode ser realizada várias semanas após o término do

experimento (Rubinstein et al., 1990; Skehan et al., 1990; Keepers et al., 1991; Monks et al.,

1991; Vichai e Kirtikara, 2006; Houghton et al., 2007).

Com os dados experimentais, foram construídos gráficos relacionando o crescimento

celular de cada linhagem em função da concentração das amostras testadas (Figura 19, A-C).

Os valores entre 100% e 0 representam proliferação celular, sendo a linha 0 o marco para a

inibição total de crescimento, ou seja, quando a quantidade de células ao final do experimento

era a mesma do momento da adição das amostras (placa T0). Já os valores negativos

representam morte celular, pois a quantidade de células (inferida através da dosagem de

proteínas coradas) era menor do que aquela do momento de adição das amostras (placa T0)

(Monks et al., 1991).

Tabela 6: Valores de GI50 (em µg/mL) após o tratamento com o óleo essencial de B. trimera

frente às linhagens celulares.

Linhagens

celulares

OEBt

CPQBAa

OEBt

Comercialb

Doxorrubicinac

U251* 28,36 29,89 0,02

MCF-7* > 250 26,95 0,02

786-0* > 250 28,72 0,02

NCI-H460* 28,52 29,47 0,02

OVCAR-3* 26,80 28,89 0,06

HT-29* 30,11 28,53 0,07

K-562* 31,89 26,95 0,09

HaCaT# 29,90 34,25 0,02

*Linhagens celulares tumorais humanas: U251 (glioma), MCF-7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão tipo

não pequenas células), OVCAR-3 (ovário), HT-29 (cólon), K-562 (leucemia);

#Linhagem celular não-tumoral: HaCaT (queratinócito humano); a OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; b OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; c Doxorrubicina: quimioterápico de referência.

71

Figura 19: Atividade antiproliferativa in vitro dos óleos essenciais em painel de linhagens

humanas, tumorais e não-tumoral, após 48 horas de tratamento.

10-3

10-2

10-1

100

101

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

Cre

scim

ento

Cel

ula

r (%

)

Concentração (g/mL)

U251

MCF7

786-0

NCI-H460

OVCAR-3

HT29

K-562

HaCaT

0,025 0,25 2,5 25

A

10-3

10-2

10-1

100

101

102

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

Cre

scim

ento

Cel

ula

r (%

)


U251

MCF7

786-0

NCI-H460

HT29

K-562

HaCaT

OVCAR-3

0,25 2,5 25 250

B

10-3

10-2

10-1

100

101

102

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

Cre

scim

ento

Cel

ula

r (%

)


U251

MCF7

786-0

NCI-H460

HT29

K-562

HaCaT

OVCAR-3

0,25 2,5 25 250

C

Linhagens: U251 (glioma), MCF-7 (mama), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão tipo não pequenas células), K-562

(leucemia), OVCAR-3 (ovário), HT-29 (cólon), HaCaT (queratinócito humano). (A) doxorrubicina (controle

positivo), (B) OEBt comercial e (C) OEBt CPQBA.

72

Como esperado (Della Torre, 2013), o OEBt proveniente do cultivar CPQBA 1

(Tabela 6, Figura 19C) apresentou um perfil de atividade antiproliferativa fraca, com valores

de GI50 entre 26,80 µg/mL (OVCAR-3) e 31,89 µg/mL (K-562), sendo inativo frente as

linhagens MCF-7 e 786-0 (GI50 > 250 µg/mL). Apesar da diferença na composição química

(Tabela 3), o OEBt comercial (Tabela 6, Figura 19B) apresentou um perfil de atividade

antiproliferativa bastante similar ao observado para OEBt CPQBA, com valores de GI50 entre

26,95 µg/mL (K-562 e MCF-7) e 34,25 µg/mL (HaCaT), inibindo a proliferação de todas as

linhagens avaliadas na concentração de 250 µg/mL. Este é o primeiro relato de atividade

antiproliferativa para o OE das partes aéreas de B. trimera rico em acetato de carquejila.

Empregando-se a mesma técnica com uma pequena alteração no tempo de

exposição (4 horas de exposição à amostra seguida de 20 horas em meio de cultura), avaliou-

se também a atividade antiproliferativa dos OEBts e dos compostos mirceno, E-cariofileno, α-

pineno e β-pineno frente à linhagem celular CHO-K1 para a determinação da maior

concentração não citocida a ser empregada nos estudos de toxicogenética. Assim, todos os

padrões apresentaram atividade citocida na maior concentração testada e valores de GI50 de

0,40; 0,24; 1,66 e 6,52 µg/mL para os padrões mirceno, E-cariofileno, β-pineno e -pineno,

respectivamente, frente à linhagem celular CHO-K1 (Figura 20).

Figura 20: Atividade antiproliferativa in vitro dos padrões de mono e sesquiterpenos

hidrocarbonetos frente à linhagem celular CHO-K1.

10-3

10-2

10-1

100

101

102

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

Cre

scim

ento

Cel

ula

r (%

)


E-cariofileno

mirceno

-pineno

-pineno

0,25 2,5 25 250

Tempo de exposição: 4 horas, seguido de 20 horas após troca do meio de cultura.

Desta forma, a concentração selecionada para os testes de toxicogenética in vitro

foi a de 0,25 μg/mL para os quatro compostos. Já as amostras dos OEBts, testadas nas

73

concentrações 12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL (Figura 21), apresentaram atividade citocida

frente à linhagem CHO-K1 na maior concentração testada (200 μg/mL) e viabilidade celular

em torno de 50% a partir da concentração de 50 µg/mL. Assim, a concentração selecionada

como a maior concentração para os testes de toxicogenética in vitro foi a de 25 μg/mL, a fim

de garantir uma viabilidade celular acima de 50%.

Figura 21: Atividade antiproliferativa in vitro dos óleos essenciais das partes aéreas de

Baccharis trimera (CPQBA e comercial), frente à linhagem celular CHO-K1.

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

Cre

scim

ento

Cel

ula

r (%

)


OEBt CPQBA

OEBt comercial

Tempo de exposição: 4 horas, seguido de 20 horas após troca do meio de cultura.

5.3.3 Testes para avaliação da toxicogenética

Na literatura, há relatos sobre a avaliação do potencial genotóxico e mutagênico

da infusão das partes aéreas de B. trimera. Assim, estudos in vitro evidenciaram a atividade

mutagênica da infusão de B. trimera em teste de Allium cepa (Fachinetto e Tedesco, 2009;

Pinho et al., 2010), com aumento também de anomalias cromossômicas em linfócitos

humanos (Pinho et al., 2010). Já estudos in vivo demonstraram que após administração oral

em ratos, durante três dias (doses de 500, 1000 e 2000 mg/kg), o extrato aquoso de B. trimera

não resultou em efeitos genotóxicos nos hepatócitos (evidenciado pelo teste Cometa); porém,

induziu aumento na frequência de MNs na medula óssea dos animais tratados, independente

da dose empregada (Rodrigues et al., 2009).

74

Diferentemente dos testes supracitados, que avaliaram a infusão de B. trimera, o

presente trabalho avaliou a atividade genotóxica e mutagênica do óleo essencial da espécie,

por meio dos testes Cometa e micronúcleo in vitro e in vivo.

A. Teste de indução de micronúcleo in vitro

De acordo com o preconizado pela OECD 487 (2016), as lâminas provenientes de

culturas tratadas com citocalasina B devem possuir pelo menos 2000 células binucleadas por

concentração ou 1000 células binucleadas por cultura (sendo duas culturas por concentração);

do contrário, os resultados de contagem podem não ser confiáveis. A frequência de

micronúcleos deve ser avaliada apenas em células binucleadas (Figura 22), caso a quantidade

destas células seja inferior ao indicado e o aumento do número de micronúcleos não seja

significativo, será necessária a repetição do teste ou a diminuição das concentrações da

amostra.

Figura 22: Fotomicrografias representativas das células binucleadas analisadas no teste do

micronúcleo in vitro.

Linhagem celular CHO-K1, coloração com solução de Giemsa 5% e MNs destacados nas setas. Fotos obtidas a

partir da observação das lâminas ao microscópio óptico (Leica, Modelo SME), na objetiva de 40x, acompanhado

de sistema de fotomicroscopia digital (Optikam B3 Digital Camera, OptikaView 7.1). Fonte: própria autora.

A escolha das concentrações a serem testadas deve considerar testes preliminares

de proliferação celular a fim de eleger a maior concentração que não seja tóxica para as

células, ou seja, que garanta viabilidade celular. Além disso, durante a análise das células

binucleadas, deve-se evitar a contagem daquelas com formato irregular, núcleos de tamanhos

muito diferente e, principalmente, não as confundir com células multinucleadas, as quais

podem apresentar alta frequência de micronúcleos (OECD 487, 2016).

75

O CBPI (Índice de Proliferação Pós-Bloqueio da Citocinese) indica o número

médio de ciclos que cada célula sofre durante período de exposição à citocalasina B e pode

ser utilizado para calcular a proliferação celular. Além disso, o RI (Índice de Replicação)

indica o número relativo de núcleos nas culturas tratadas, em comparação com o controle

negativo das culturas e pode ser usado para calcular a porcentagem de células citostáticas, que

corresponde à inibição do crescimento celular (Kalweit et al., 1999; Fenech, 2007). Assim, o

RI é uma forma de comparação do número de células binucleadas ou multinucleadas que se

encontram em processo de divisão e quanto maior o seu valor, menor será a quantidade de

células citostáticas, consequentemente, menor será a citotoxicidade da amostra.

Como apresentado na Tabela 7, as amostras de OEBts CPQBA e comercial

apresentaram RI superior a 95% (citotoxicidade menor do que 10%) e CBPI acima de 1,8 nos

sistemas com e sem metabolização, confirmando a ausência de citotoxicidade para as

concentrações escolhidas. Mais ainda, apesar do guia da OECD 487 (2016) preconizar uma

viabilidade celular acima de 55%, alguns estudos têm demonstrado que valores de RI menores

do que 80% podem resultar em resultados falsos positivos (Kirkland et al., 2007; Kirkland,

2010; Fowler et al., 2012). Desta forma, os resultados de RI (acima de 95%) obtidos para

todas as amostras testadas corroboram a confiabilidade da avaliação de frequência de

micronúcleos.

Tabela 7: Valores de CBPI e RI das amostras do OEBt CPQBA e OEBt comercial, nos

sistemas com e sem metabolização exógena.

Amostras Sem S9 Com S9

CBPI RI (%) CBPI RI (%)

Controle 1,92 ± 0,02 100,0 1,91 ± 0,01 100,0

DMSO 0,25% 1,98 ± 0,01* 106,8 1,95 ± 0,02 103,4

MMS 25 µg/mL 1,89 ± 0,00 97,5 - -

CPA 10 µg/mL - - 1,93 ± 0,02 101,2

OEBt CPQBA

25 µg/mL 1,95 ± 0,01 103,7 1,94 ± 0,01 102,4

12,5 µg/mL 1,94 ± 0,01 103,0 - -

6,25 µg/mL 1,96 ± 0,00 104,8 - -

OEBt comercial

25 µg/mL 1,88 ± 0,01 95,8 1,96 ± 0,01 104,4

12,5 µg/mL 1,95 ± 0,01 104,3 - -

6,25 µg/mL 1,97 ± 0,02 105,3 - - *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 (Resultados expressos como média ± desvio padrão; ANOVA, Teste de Tukey,

em relação ao controle de células sem tratamento).

Controle: células não tratadas; DMSO: dimetilsulfóxido (controle do solvente); MMS: metilmetanosulfonato

(controle positivo sem S9); CPA: ciclofosfamida (controle positivo com S9); OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis

trimera disponível comercialmente; S9: mix de enzimas hepáticas; CBPI: Cytokinesis-Block Proliferation Index

(Índice de Proliferação Pós-Bloqueio da Citocinese); RI: Replication Index (Índice de Replicação).

76

O MMS (metilmetanosulfonato) foi escolhido como controle positivo de indução

de MNs, no experimento sem adição de enzimas de metabolização, por ser um agente

clastogênico de ação direta. Sua ação acontece principalmente pela sua capacidade de alquilar

moléculas nucleofílicas como o DNA, visto que todas as bases deste ácido possuem sítios

susceptíveis à alquilação, especificamente nos átomos de nitrogênio e oxigênio (Beranek,

1990; Moore et al., 1991; Tao et al., 1993; Jenkins et al., 2005).

Com relação à frequência de micronúcleos (% CBMN), o controle positivo MMS

elevou a frequência para 5,48 ± 0,16% em relação ao controle de células sem tratamento (1,54

± 0,08%). Por sua vez, o OEBt CPQBA (6,25; 12,5 e 25 µg/mL) induziu um aumento

significativo na frequência de MNs de (2,53 ± 0,07%; 2,55 ± 0,18% e 3,53 ± 0,23%,

respectivamente), independente da concentração avaliada, enquanto o OEBt comercial

aumentou de maneira significativa a frequência de micronúcleos nas concentrações de 25

(3,01 ± 0,03%) e 12,5 µg/mL (2,32 ± 0,22%), sendo que na concentração de 6,25 µg/mL não

houve alteração significativa (1,59 ± 0,13%) em relação às células não tratadas (Figura 23).


amostras OEBt CPQBA e OEBt comercial, sem ativação metabólica.

0

2

4

6 * **

**

* **

**

* ****

% C

BM

N

O E B t co m erc ia l 1 2 ,5 g/m L

C o n tro le

M M S 25 g/m L

D M S O 0 ,2 5 %

O E B t C P Q B A 6 ,2 5 g/m L

O E B t C P Q B A 1 2 ,5 g/m L

O E B t C P Q B A 2 5 g/m L

O E B t co m erc ia l 6 ,2 5 g/m L

O E B t co m erc ia l 2 5 g/m L

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 (Resultados expressos como média ± desvio padrão; ANOVA, Teste de Tukey,

em relação ao controle de células sem tratamento). Controle: células não tratadas; DMSO: dimetilsulfóxido (controle do solvente); MMS: metilmetanosulfonato

(controle positivo); OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a

Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; CBMN: células

binucleadas micronucleadas.

Para o modelo experimental com ativação metabólica, inclui-se uma fração pós-

mitocondrial, conhecida como fração S9, geralmente obtida a partir do fígado de roedores

tratados com agentes de indução enzimática. Os resultados de CBMN obtidos com a

utilização da fração S9 (S9+) combinados com aqueles do experimento sem S9 (S9-)

77

permitem inferir se a amostra em teste é mutagênica em sua forma original (valores de CBMN

semelhantes nos dois experimentos), se necessita ser metabolizada para se tornar mutagênica

(valores de CBMN S9+ são maiores do que CBMN S9-) ou ainda se os metabólitos gerados

são menos mutagênicos (valores de CBMN S9- são maiores do que CBMN S9+) (OECD 487,

2016).

No teste realizado neste trabalho, optou-se pela utilização da fração S9

proveniente de fígado humano (Sigma-Aldrich®, S2442), a fim de reproduzir ao máximo as

condições de biotranformação em humanos. De acordo com Plant (2004), um sistema de

ativação metabólica que possui um maior grau de semelhança com o que ocorre na

metabolização de moléculas (xenobióticos) do organismo humano beneficia e favorece a

extrapolação para o valor preditivo sobre as análises de risco em mutagenicidade. Além disso,

a fração hepática S9 oferece uma representação mais completa do perfil metabólico quando

comparada a microssomos preparados a partir de hepatócitos. Isto porque na fração S9

encontram-se enzimas tanto da fase 1 (reações de oxidação) quanto da fase 2 (reações de

conjugação) do metabolismo (Hariparsad et al., 2006).

Para esse modelo experimental, o agente indutor de MNs foi a ciclofosfamida, que

após ser metabolizada pelo citocromo P450 apresenta efeitos genotóxicos (Kulka et al., 1993).

Desta forma, a ciclofosfamida elevou significativamente a frequência de MNs para 3,96 ±

0,07%, em relação ao controle negativo (2,06 ± 0,03%), enquanto OEBt CPQBA e OEBt

comercial, na concentração de 25 µg/mL, não induziram aumento significativo da frequência

de MN (2.26 ± 0,30% e 2,41 ± 0,08%, respectivamente) em relação ao controle de células

(Figura 24).

78


amostras OEBt CPQBA e OEBt comercial, com ativação metabólica.

0

1

2

3

4

5

***

% C

BM

NC o n tro le

C P A 1 0 g/m L

D M S O 0 ,2 5 %


O E B t co m erc ia l 2 5 g/m L

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 (Resultados expressos como média ± desvio padrão; ANOVA, Teste de Tukey, em relação ao controle de células sem tratamento).

Controle: células não tratadas; DMSO: dimetilsulfóxido (controle do solvente); CPA: ciclofosfamida (controle

positivo); OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014;

OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; CBMN: células binucleadas

micronucleadas.

Comparando-se os resultados de CBMN dos dois experimentos, observou-se que

a presença do mix de enzimas hepáticas resultou em um aumento na frequência de MNs

significativamente menor (CBMN = 9,7 e 17% para OEBt CPQBA e comercial,

respectivamente) em relação à frequência observada na ausência da fração S9 (CBMN = 130

e 95% para OEBt CPQBA e comercial, respectivamente), em relação aos respectivos

controles de células sem tratamento (Figura 25). Esses resultados sugerem uma possível

redução do potencial mutagênico dos óleos essenciais de Baccharis trimera quando

submetidos à metabolização.

Figura 25: Comparação do incremento em % de indução de micronúcleos do OEBt CPQBA

e OEBt comercial, em experimentos com (S9+) e sem (S9-) ativação metabólica.

S e m S 9 C o m S 9

0

5 0

1 0 0

1 5 0O E B t C P Q B A 2 5 g/m L

O E B t c o m e rc ia l 2 5 g/m L

In

cr

em

en

to e

m %

de

in

du

çã

o d

e M

N

OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt

comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; S9: mix de enzimas hepáticas.

79

Essas diferenças na frequência de MNs induzida pelos OEBt CPQBA e comercial

podem ser atribuídas às diferenças na composição química dos mesmos. Enquanto o OEBt

CPQBA apresentou predomínio de sesquiterpenos hidrocarbonetos (59,8%), o OEBt

comercial mostrou-se rico em sesquiterpenos oxigenados (72,9%) (Tabela 4), com uma

composição qualitativa muito diferente. Os principais constituintes de OEBt CPQBA foram

biciclogermacreno (17,16%), E-cariofileno (15,24%), germacreno D (11,85%), β-pineno

(7,32%), δ-cadineno (6,85%) e β-mirceno (5,30%), enquanto o lote comercial de OE da

mesma espécie, proveniente do Rio Grande do Sul, apresentou 65,36% de acetato de

carquejila, 7,58% de palustrol e 2,53% de limoneno, compostos ausentes no OEBt CPQBA

(Tabela 3).

Além das amostras dos OEBts, os padrões de referência mirceno, E-cariofileno, α-

pineno e β-pineno foram avaliados quanto ao potencial mutagênico por meio do teste de

indução de MNs, sem ativação metabólica.

Como apresentado na Tabela 8, todas as amostras referentes aos padrões

apresentaram RI superior a 90% (citotoxicidade menor do que 10%) e CBPI acima de 1,8,

dados que confirmam ausência de citotoxicidade para a concentração testada. Com relação à

frequência de micronúcleos, a concentração de DMSO utilizada (correspondente à quantidade

empregada para diluir os óleos essenciais) não induziu a formação de MN em relação ao

controle de células, enquanto o MMS elevou a frequência para 8,35 ± 0,23.

Tabela 8: CBPI, RI e frequência de micronúcleos dos padrões de alguns compostos presentes

no OE de B. trimera.

Amostras CBPI RI (%) % CBMN

Controle 1,92 ± 0,02 100 1,23 ± 0,09

DMSO 0,25% 1,95 ± 0,02 103,7 1,55 ± 0,13

MMS 25 µg/mL 1,84 ± 0,06 91,6 8,35 ± 0,23***

Mirceno 0,25 µg/mL 1,92 ± 0,03 100,4 2,48 ± 0,52*

E-cariofileno 0,25 µg/mL 1,91 ± 0,04 99,5 2,41 ± 0,01*

α-pineno 0,25 µg/mL 1,93 ± 0,01 101,7 1,20 ± 0,07

β-pineno 0,25 µg/mL 1,95 ± 0,01 104,2 2,59 ± 0,30*

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 (Resultados expressos como média ± desvio padrão; ANOVA, Teste de Tukey,

em relação ao controle de células sem tratamento).

Controle: células não tratadas; DMSO: dimetilsulfóxido (controle do solvente); MMS: metilmetanosulfonato

(controle positivo); CBPI: Cytokinesis-Block Proliferation Index (Índice de Proliferação Pós-Bloqueio da

Citocinese); RI: Replication Index (Índice de Replicação); CBMN: células binucleadas micronucleadas.

As amostras mirceno, E-cariofileno e β-pineno proporcionaram um aumento

estatisticamente significativo na frequência de micronúcleos (CBMN = 2,48 ± 0,52; 2,41 ±

80

0,01 e 2,59 ± 0,30, respectivamente) em relação às células não tratadas, porém foi um

aumento bem menor do que o induzido pelo MMS (Tabela 8). Estes compostos podem estar

envolvidos no aumento da frequência de micronúcleos observado para a amostra de OEBt

CPQBA no teste realizado sem a fração S9 (Figura 23). Além disso, o composto α-pineno

apresentou uma frequência de MN parecida com aquela observada para as células não tratadas

(Tabela 8).

Segundo dados da literatura, no teste microssomal em diferentes cepas de

Salmonella (teste AMES), com ou sem ativação metabólica S9, tanto o α-pineno

(enantiômeros ou mistura racêmica) quanto o β-pineno (isômero dextrogiro ou mistura

racêmica) mostraram-se não mutagênicos (Florin et al., 1980; Connor et al., 1985; Gomes-

Carneiro et al., 2005; Saverini et al., 2012). Já estudos de dano ao DNA avaliados através do

teste Cometa demonstraram que, em células de adenocarcinoma pulmonar humano A549, o α-

pineno (mistura racêmica) não provocou danos no DNA (Gminski et al., 2010), enquanto em

células de hamster chinês (linhagem V79 e sublinhagem V79-Cl3), tanto o α-pineno (mistura

racêmica) quanto β-pineno provocaram danos ao material genético provavelmente pela

geração de espécies reativas de oxigênio (Catanzaro et al., 2012; Saverini et al., 2012).

Já para o β-mirceno, diversos estudos sugerem que este composto não induz

aberrações cromossômicas nem mutações genéticas, tanto em modelos in vitro com células de

mamíferos (Kauderer et al., 1991) e com bactérias (Gomes-Carneiro et al., 2005), quanto em

modelos in vivo de aberrações cromossômicas em medula óssea de ratos Wistar (Zamith et al.,

1993).

Finalmente, sobre o E-cariofileno (ou β-cariofileno), há relatos de que este

sesquiterpeno não apresentou mutagenicidade no teste AMES, com e sem ativação metabólica

(Di Sotto et al., 2008) e em modelo de indução de micronúcleos in vivo (Molina-Jasso et al.,

2009). Mais ainda, o β-cariofileno foi capaz de inibir a ação clastogênica induzida por

etilmetanossulfonato em culturas de linfócitos humanos (Di Sotto et al., 2010).

Assim, os resultados obtidos no ensaio de indução de micronúcleos in vitro

evidenciaram um potencial mutagênico para os compostos E-cariofileno, mirceno e β-pineno,

sem a utilização de um sistema de metabolização exógena, apesar de vários resultados da

literatura indicarem para a ausência de potencial mutagênico. Além disso, apesar dos

resultados da literatura demonstrarem que tanto o α-pineno quanto o β-pineno tem um perfil

semelhante de atividade, os resultados obtidos no presente trabalho com modelo de indução

81

de micronúcleos em células da linhagem CHO-K1 parecem sugerir que o β-pineno tenha um

potencial mutagênico maior do que o α-pineno.

Algumas divergências em estudos de genotoxicidade para compostos α-pineno, β-

pineno, E-cariofileno e β-mirceno também foram apontadas pelo relatório do “The Panel on

Food Contact Materials, Enzymes, Flavourings and Processing Aids” da Autoridade Europeia

de Segurança Alimentar, sobre hidrocarbonetos alifáticos, alicíclicos e aromáticos, publicado

em 2011 (EFSA, 2011). Segundo esse relatório, com base nos estudos já realizados, os quatro

compostos podem ser considerados como não genotóxicos. Com relação aos compostos

majoritários identificados no OEBt comercial, não foram encontrados relatos sobre efeitos

mutagênicos/genotóxicos para acetato de carquejila e palustrol. Por sua vez, o limoneno é

descrito como não mutagênico através do teste de AMES e como uma substância

antimutagênica em diferentes modelos experimentais (Sun, 2007; Di Sotto et al., 2013).

B. Avaliação da genotoxicidade pelo teste Cometa

O teste Cometa é amplamente usado para detecção de danos ao DNA e reparo em

células e tecidos de animais e plantas (Møller et al., 2010). O princípio básico deste teste é a

migração diferenciada do DNA e seus fragmentos em uma matriz de agarose sob condições

eletroforéticas (Knasmüller et al., 2011). Quando observadas em microscópio, os nucleoides

têm a aparência de um cometa com cabeça (a região nuclear) e uma cauda contendo os

fragmentos de DNA que migram em direção ao polo positivo (Hartmann et al., 2003).

Dentre os parâmetros propostos para avaliação do teste Cometa, podem ser

destacados os parâmetros “porcentagem de DNA na cauda” e “Tail Moment – TM”. O

primeiro parâmetro reflete a quantidade de DNA presente na cauda do cometa e é um

parâmetro primário (quantificado diretamente a partir dos nucleoides visualizados), sendo

direta e linearmente proporcional ao dano provocado no DNA, independente do mecanismo

de quebra. Já o parâmetro Tail Moment estabelece uma relação matemática entre o

comprimento da cauda e a quantidade (%) de DNA que migrou, sendo um parâmetro

derivado. Este parâmetro apresenta algumas limitações como a falta de unidade padrão

(geralmente é expresso sem unidade) e as variações nas fórmulas empregadas para o cálculo;

para minimizar essa variação, estudos recentes recomendam o uso da fórmula desenvolvida

por Olive e Banáth (2006), denominada tail moment Olive (TMO), no qual calcula-se o

produto da porcentagem de DNA na cauda pelo comprimento da cauda, tomando-se como

pontos de referência para cálculo do comprimento os pontos médios da cabeça e da cauda de

82

cada nucleoide (Møller, 2006; Olive e Banáth, 2006; Lovell and Omori, 2008; Kumaravel et al.,

2009; Bright et al., 2011; Azqueta e Collins, 2013; Glei et al., 2016).

Além disso, o uso do software para captura e análise de imagens durante a leitura

das lâminas permitiu uma análise interativa rápida, confiável e semi-automatizada do teste

Cometa, pois os parâmetros relevantes foram computados automaticamente e exportados em

formatos de dados adequados para análise estatística.

83


essenciais de Baccharis trimera após 4 horas de tratamento, com (S9+) e sem S9 (S9-).

A A1

B B1

C C1

D D1

S9-: (A) Controle de células sem tratamento; (B) MMS 25 µg/mL; (C) OEBt CPQBA 25 µg/mL e (D) OEBt

comercial 25 µg/mL.

S9+: (A1) Controle de células sem tratamento; (B1) CPA 20 µg/mL; (C1) OEBt CPQBA 25 µg/mL e (D1) OEBt


OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt

comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; MMS: metilmetanosulfonato

(controle positivo S9-) e CPA: ciclofosfamida (controle positivo S9+).

Análises realizadas em microscópio de fluorescência nos aumentos de 200x (B e D) e 400x (A, C, A1, B1, C1 e

D1). Fonte: própria autora.

84

Inicialmente, as amostras de OEBt CPQBA e OEBt comercial foram avaliadas

quanto ao potencial genotóxico por meio da exposição das células CHO-K1 às amostras por

um período de 4 horas, com e sem o sistema de metabolização exógena.

Visualmente, foi possível verificar que o uso do sistema de metabolização S9

(Figura 26 A1-D1), durante 4 horas de tratamento, possibilitou a redução da fragmentação do

DNA induzida pelas amostras OEBt (Figura 26 A-D), sugerindo uma diminuição da

toxicidade das amostras após a metabolização. Essa observação foi confirmada pela análise

quantitativa dos parâmetros % de DNA e tail moment Olive (Figuras 27 e 28).


Cometa alcalino em células CHO-K1 tratadas com as amostras de OEBt por 4 horas, sem S9.

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

a

a ,ba ,b

a ,b a ,b a ,b

b

%D

NA

C élu las sem tra tam en to

D M S O 0 ,2 5 %

M M S 25 g/m L




O E B t C o m erc ia l 6 ,2 5 g/m L

O E B t C o m erc ia l 1 2 ,5 g/m L

O E B t C o m erc ia l 2 5 g/m L

A

0

5

1 0

1 5

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

2 0 0

a

a ,b a ,ba ,b

b

bb

Ta

il m

om

en

t O

liv

e


D M S O 0 ,2 5 %

M M S 25 g/m L







B Resultados expressos como média ± erro padrão (n = pelo menos 100 nucleoides/tratamento); a = p<0,001, em

relação às células sem tratamento; b = p<0,001, em relação ao MMS (ANOVA, Teste de Tukey).

(A) porcentagem de DNA na cauda (parâmetro primário); (B) Tail moment Olive: relação matemática entre a

porcentagem de DNA na cauda e o comprimento da cauda (parâmetro derivado).

DMSO: dimetilsulfóxido (controle do solvente); MMS: metilmetanosulfonato (controle positivo); OEBt

CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial:

óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente.

85


Cometa alcalino em células CHO-K1 tratadas com as amostras de OEBt por 4 horas, com S9.

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0C élu las sem tra tam en to

D M S O

C P A 2 0 g/m L



a

a ,b a ,b

% D

NA

A

0

5

1 0

1 5

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

2 0 0C élu las sem tra tam en to

D M S O

C P A 2 0 g/m L



a

Ta

il m

om

en

t O

liv

e

a ,b a ,b

B Resultados expressos como média ± erro padrão (n = pelo menos 100 nucleoides/tratamento); a = p<0,001, em

relação às células sem tratamento; b = p<0,001, em relação à CPA (ANOVA, Teste de Tukey).



DMSO: dimetilsulfóxido (controle do solvente); CPA: ciclofosfamida (controle positivo); OEBt CPQBA: óleo

essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial

de Baccharis trimera disponível comercialmente.

Em ambos os experimentos (Figuras 27 e 28), o agente dispersor das amostras

lipossolúveis em água (DMSO 0,25%) não apresentou danos significativos na concentração

analisada (% de DNA na cauda = 4,62 ± 0,44% e TMO = 2,68 ± 0,26, sem S9, e % de DNA

na cauda = 6,28 ± 0,53% e TMO = 3,55 ± 0,30, com S9) em relação ao controle de células

sem tratamento (% de DNA na cauda = 4,45 ± 0,43% e TMO = 2,34 ± 0,23, sem S9, e % de

DNA na cauda = 6,39 ± 0,58% e TMO = 3,37 ± 0,31, com S9). O metabolismo basal celular

pode provocar lesões no DNA (Gontijo e Tice, 2003), o que explica a pequena incidência de

porcentagem de DNA na cauda e o tail moment Olive observados para as células não tratadas.

86

Por outro lado, a semelhança entre esses resultados e aqueles observados para o grupo veículo

(DMSO) garantem a confiabilidade da análise das amostras em estudo; segundo Lovell e

Omori (2008), é recomendável que os grupos não tratados apresentem valores de % de DNA

na cauda abaixo de 10%, a fim de não interferir na análise das amostras teste.

Por sua vez, os agentes indutores de genotoxicidade metilmetanosulfonato (MMS,

25 µg/mL, experimento sem S9, Figura 27) e ciclofosfamida (CPA, 20 µg/mL, experimento

com S9, Figura 28) foram capazes de induzir danos significativos (% de DNA na cauda =

76,35 ± 0,95% e TMO = 87,67 ± 2,44, para MMS; e % de DNA na cauda = 20,52 ± 1,04% e

TMO = 11,92 ± 0,63, para CPA) nas células CHO-K1 após 4 horas de exposição.

Com relação às amostras de OE de B. trimera, o OEBt CPQBA induziu um

aumento significativo na porcentagem de DNA na cauda dos nucleoides nas concentrações de

12,5 e 25 µg/mL (% DNA na cauda = 10,92 ± 0,59 e 14,83 ± 0,66%, respectivamente), não

diferindo na concentração de 6,25 µg/mL (6,52 ± 0,64%) do controle de células (4,45 ±

0,43%) (Figura 27A), sendo que esse efeito genotóxico foi significativamente inferior àquele

provocado pelo MMS (76,35 ± 0,95%). Já pelo parâmetro tail moment Olive, não foi possível

evidenciar diferença estatisticamente significativa (3,53 ± 0,33; 7,15 ± 0,36 e 9,00 ± 0,43,

para concentrações de 6,25; 12,5 e 25 µg/mL, respectivamente) em relação ao controle

negativo (Figura 27B). Por outro lado, o OEBt comercial provocou danos expressivos ao

DNA (% de DNA = 91,36 ± 0,45; 91,47 ± 0,37 e 93,48 ± 0,19%, e TMO = 155,6 ± 2,38;

159,40 ± 2,53 e 168,40 ± 1,97, para as concentrações de 6,25; 12,5 e 25 µg/mL,

respectivamente), independente da concentração avaliada e até maiores do que o dano

provocado pelo MMS (Figuras 27A e B), sugerindo um potencial genotóxico para o OEBt

comercial nas condições analisadas.

Quando a mistura de enzimas hepáticas foi adicionada ao experimento, ambas as

amostras de OEBt, na concentração de 25 µg/mL, apresentaram valores similares de

porcentagem de DNA na cauda (13,46 ± 1,15 e 13,07 ± 1,02%, para OEBt CPQBA e OEBt

comercial, respectivamente) e de tail moment Olive (6,83 ± 0,58 e 6,78 ± 0,53, para OEBt

CPQBA e OEBt comercial, respectivamente) (Figuras 28A e B). Para o OEBt CPQBA, esses

valores foram muito semelhantes aos observados para essa mesma amostra na ausência de S9

(Figuras 27 A e B), sugerindo que para o efeito genotóxico do OEBt CPQBA, diretamente

após 4 horas de exposição, houve poucas alterações por ação de enzimas metabólicas. Por sua

vez, o OEBt comercial apresentou uma redução significativa em sua ação genotóxica na

87

presença de fração S9 (Figura 28) em relação aos resultados obtidos na ausência de S9 (Figura

27), sugerindo que a metabolização resultaria em compostos menos genotóxicos.

Os resultados obtidos no teste Cometa, sem e com sistema de metabolização

(Figuras 27 e 28) diferiram daqueles obtidos no teste de indução de micronúcleos in vitro

(Figuras 23 e 24), na medida em que ambos os óleos essenciais promoveram um aumento

similar na frequência de MNs (CBMN = 2,9 e 2,3 % para os OEBts CPQBA e comercial,

respectivamente), que foi revertido igualmente pela adição da fração S9.

Essas diferenças entre os resultados dos testes Cometa e MN in vitro podem ser

atribuídas, em parte, às diferenças experimentais no tempo de incubação; no protocolo do

teste in vitro de indução de micronúcleos, após o período de 4 horas de incubação com as

amostras, as células foram mantidas por mais 20 horas apenas em meio de cultura para que

pudessem completar o ciclo celular antes da avaliação de frequência de micronúcleos em

células binucleadas. Por sua vez, no protocolo padrão do teste Cometa, as células já foram

avaliadas ao final das 4 horas de incubação com as amostras.

Assim, para verificar a influência do tempo de incubação na expressão do dano ao

DNA, foram realizados experimentos do teste Cometa empregando o mesmo protocolo de

incubação do teste de indução de micronúcleos (4 horas de exposição seguida de 20 horas em

meio de cultivo), a fim de verificar se os danos ao DNA provocado pelos OEBts se manteriam

ou seriam passíveis de reversão.

88


essenciais de Baccharis trimera após 4 horas de tratamento, seguido de 20 horas de

incubação, com (S9+) e sem S9 (S9-).

A A1

B B1

C C1

D D1

S9-: (A) Controle de células sem tratamento; (B) MMS 25 µg/mL; (C) OEBt CPQBA 25 µg/mL e (D) OEBt


S9+: (A1) Controle de células sem tratamento; (B1) CPA 20 µg/mL; (C1) OEBt CPQBA 25 µg/mL e (D1) OEBt

comercial 25 µg/mL. OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; MMS: metilmetanosulfonato

(controle positivo S9-) e CPA: ciclofosfamida (controle positivo S9+).

Análise feita em microscópio de fluorescência no aumento de 400x. Fonte: própria autora.

89

Qualitativamente, observou-se que os danos ao DNA das células CHO-K1,

provocados por ambos OEBts (CPQBA e comercial), após 4 horas de exposição seguido de

20 horas de incubação em meio de cultura foram aparentemente menores (Figura 29) do que

os observados no experimento anterior (Figura 26).



de 20 horas de incubação, sem S9.

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

%D

NA

a

a ,ba ,b

a ,ba ,b

b b


D M S O 0 ,2 5 %

M M S 25 g/m L







A

0

5

1 0

1 5

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

2 0 0

Ta

il m

om

en

t O

liv

e

a


D M S O 0 ,2 5 %

M M S 25 g/m L


O E B t C C P Q B A 1 2 ,5 g/m L




O E B t C o m erc ia l 2 5 g/m La ,b

a ,b

b ,c

a ,b

b b

B Resultados expressos como média ± erro padrão (n = pelo menos 100 nucleoides/tratamento); a = p<0,001 e c =

p<0,01, em relação às células sem tratamento; b = p<0,001, em relação ao MMS (ANOVA, Teste de Tukey).



DMSO: dimetilsulfóxido (controle do solvente); MMS: metilmetanosulfonato (controle positivo); OEBt

CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente.

Também nessa condição de tratamento, o solvente (DMSO 0,25%) não induziu

danos significativos (%DNA na cauda = 5,08 ± 0,42% e TMO = 2,89 ± 0,24, sem S9, e

%DNA na cauda = 7,40 ± 0,63% e TMO = 4,16 ± 0,34, com S9) em relação às células não

tratadas (%DNA na cauda = 4,58 ± 0,49% e TMO = 2,58 ± 0,28, sem S9, e %DNA na cauda

90

= 6,48 ± 0,52% e TMO = 3,48 ± 0,28, com S9) (Figuras 30 e 31), corroborando a segurança

de uso desse agente dispersor de substâncias lipofílicas em meio aquoso.

Já os controles positivos (MMS, na condição sem S9; CPA, na presença de S9)

apresentaram uma redução no potencial genotóxico no novo esquema de tratamento em

relação ao observado após 4 horas de exposição (Figuras 27 e 28). Ainda assim, ambos

induziram danos significativos (p<0,001) ao DNA celular (% de DNA = 35,76 ± 1,29 e TMO

= 51,68 ± 1,65 para MMS 25 µg/mL; % de DNA = 16,77 ± 0,88% e TMO = 12,79 ± 0,74

para CPA 20 µg/mL) em relação às células não tratadas (Figuras 30 e 31).

A alteração no esquema de tratamento (4 horas de exposição seguidas de 20 horas

em meio de cultura) resultou em uma diminuição do efeito genotóxico do OEBt comercial.

Assim, tanto OEBt CPQBA quanto OEBt comercial, na concentração de 6,25 µg/mL, não

aumentaram significativamente os parâmetros porcentagem de DNA na cauda (%DNA = 5,94

± 0,46 e 6,31 ± 0,42%, respectivamente) e de tail moment Olive (TMO = 3,26 ± 0,24 e 3,52 ±

0,22, respectivamente) (Figura 30). Para as demais concentrações (12,5 e 25 µg/mL), tanto

OEBt CPQBA quanto OEBt comercial induziram um aumento significativo na porcentagem

de DNA na cauda (14,56 ± 0,68% e 17,11 ± 0,91%, para OEBt CPQBA; 12,36 ± 0,53 e 15,83

± 0,72%, para OEBt comercial), sendo esse aumento menos intenso do que o observado para

o MMS (Figura 30A). Em relação ao parâmetro tail moment Olive, também houve o aumento

estatisticamente significativo após o tratamento com os OEBts (CPQBA e comercial) nas

duas maiores concentrações (7,53 ± 0,37 e 9,12 ± 0,49, nas concentrações de 12,5 e 25

µg/mL, respectivamente de OEBt CPQBA; 6,21 ± 0,27 e 9,02 ± 0,42, nas concentrações de

12,5 e 25 µg/mL, respectivamente do OEBt comercial), quando comparado com os valores

registrados para as células não tratadas (Figura 30B).

Assim, para o OEBt CPQBA a inclusão de um período de recuperação para as

células (Figura 30) não levou a uma redução do efeito genotóxico (avaliado através dos

parâmetros %DNA na cauda e TMO) em relação à análise imediatamente após as 4 horas de

exposição (Figura 27). Por sua vez, esse período de incubação resultou em um menor efeito

genotóxico para o OEBt comercial (Figuras 27 e 30).

91



de 20 horas de incubação, com S9.

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

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1 0 0 C élu las sem tra tam en to

D M S O

C P A 2 0 g/m L



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% D

NA

b b ,c

A

0

5

1 0

1 5

8 0

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1 2 0

1 4 0

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bTa

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om

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liv

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C é lu la s s e m tra ta m e n to

D M S O

C P A 2 0 g /m L

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O E B t C o m e rc ia l 2 5 g /m L

b ,c

B

Resultados expressos como média ± erro padrão (n = pelo menos 100 nucleoides/tratamento); a = p<0,001 e c =

p<0,05, em relação às células sem tratamento; b = p<0,001, em relação à CPA (ANOVA, Teste de Tukey).



DMSO: dimetilsulfóxido; CPA: ciclofosfamida (controle positivo); OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis

trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera

disponível comercialmente.

Finalmente, quando avaliadas na maior concentração (25 µg/mL) na presença da

fração S9 (Figura 31), apenas a amostra OEBt comercial induziu um aumento significativo

(p<0,05) na porcentagem de DNA na cauda (9,48 ± 0,83%) e no parâmetro tail moment Olive

(5,37 ± 0,45) em relação às células não tratadas, diferentemente da amostra de OEBt CPQBA

que não apresentou diferenças significativas na porcentagem de danos no DNA no parâmetro

tail moment Olive (8,93 ± 0,81 e 4,64 ± 0,41, respectivamente), em relação ao controle

negativo (%DNA = 6,48 ± 0,52; TMO = 3,48 ± 0,28). Em relação ao experimento anterior

(Figura 28), a inclusão de um período de incubação de 20 horas em meio de cultura, após a

92

exposição por 4 horas às amostras (Figura 31), resultou em uma diminuição do efeito

genotóxico de ambas as amostras de OEBts.

5.4 Análises in vivo

5.4.1 Toxicidade oral aguda

A fim de complementar os dados toxicológicos, iniciou-se a avaliação in vivo dos

OEBts pelo teste de toxicidade oral aguda com o objetivo de determinar qual a maior dose

não tóxica para cada uma das amostras.

Inicialmente, realizou-se uma estimativa de dose oral tóxica a partir dos resultados

de atividade antiproliferativa em cultura de células HaCaT (queratinócitos humanos) e da

equação proposta [log DL50 (mg/kg) = 0,372 log IC50 (µg/mL) + 2,024] pelo guia OECD 129

(Guidance Document on Using Cytotoxicity Tests to Estimate Starting Doses for Acute Oral

Systematic Toxicity Tests) (OECD, 2010), substituindo-se o valor de IC50 na linhagem 3T3

(fibroblasto embrionário murino) pelo valor de GI50 na linhagem HaCaT.

Desta forma, considerando-se os valores de GI50 do OEBt comercial (GI50 = 34,25

μg/mL) e do OEBt CPQBA (GI50 = 29,90 μg/mL), foram obtidos os valores estimados de

DL50 de 393 e 374 mg/kg para OEBts comercial e CPQBA, respectivamente. Com base

nesses valores, o experimento de toxicidade oral aguda foi iniciado com a dose de 400 mg/kg

para ambas as amostras. Como nenhum sinal clínico de toxicidade foi observado durante as

primeiras 4 horas, os animais referentes aos grupos de cada OEBt foram então tratados com

200 mg/kg (metade da dose inicial) e 800 mg/kg (dobro da dose inicial) (OECD 425, 2008).

Novamente, nenhum sinal clínico de toxicidade foi evidenciado durante as primeiras quatro

horas imediatamente após o tratamento.

A ausência de quaisquer alterações nos parâmetros de locomoção,

comportamento, respiração, salivação e lacrimejamento, além da não ocorrência de cianose de

extremidades e óbito, manteve-se durante todo o período de 14 dias. A massa corporal dos

animais foi inferida a cada três dias a partir do primeiro dia do experimento e todos os animais

tratados com as três doses dos dois OEBts apresentaram uma evolução corporal similar àquela

observada para os animais que receberam apenas o veículo (Figura 32).

93

Figura 32: Evolução da massa corporal de camundongos após o tratamento com OEs de

Baccharis trimera ao longo de 14 dias.

0 4º

7º

11º

14º

1 8

2 0

2 2

2 4

2 6

2 8V eícu lo

O E B t C P Q B A 2 0 0 m g /k g



O E B t C o m erc ia l 2 0 0 m g /kg



D ia s

Ma

ss

a c

or

po

ra

l (g

)

Resultados expressos como média do grupo, n = 5 animais/grupo; camundongos Swiss fêmeas (6 a 8 semanas de

idade); tratamento por via oral; jejum de 8 horas; volume máximo administrado: 10 mL/kg.

Veículo: solução de tampão fosfato pH 7,0 em sol. de NaCl 0,9% e Tween 80 0,3%; OEBt CPQBA: óleo



No 14º dia, os animais foram anestesiados profundamente e, em seguida,

submetidos a deslocamento cervical para avaliação macroscópica do coração, pulmões,

fígado, rins e baço, os quais foram também retirados e pesados para o cálculo da massa

relativa de cada órgão. Não foram observados quaisquer sinais macroscópicos de lesões nos

órgãos avaliados, bem como não foram evidenciadas alterações nas massas relativas dos

mesmos (Figura 33).

94

Figura 33: Massa relativa (%) dos órgãos baço, rins, fígado, coração e pulmões de

camundongos Swiss após o tratamento em dose única com as amostras OEBt comercial e

OEBt CPQBA. Baço

Rins

Fígado

Coração

Pulmões

ANOVA, Teste de Tukey, em relação ao veículo; resultados expressos como média ± erro padrão do grupo, n =

5 animais/grupo; camundongos Swiss fêmeas (6 a 8 semanas de idade); tratamento por via oral; jejum de 8 horas;

volume máximo administrado: 10 mL/kg.

Veículo: solução de tampão fosfato pH 7,0 em sol. de NaCl 0,9% e Tween 80 0,3%; OEBt CPQBA: óleo



A partir dos resultados obtidos de avaliação clínica, peso corporal e massa relativa

dos órgãos, foi possível concluir que para ambas as amostras (OEBt CPQBA e OEBt

comercial) a máxima dose única tolerável (sem sinais evidentes de toxicidade) correspondeu à

maior dose testada (MDT >800 mg/kg).

O E B t C P Q B A O E B t c o m e r c ia l

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

% d

e m

as

sa

re

lativ

a


0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

% d

e m

as

sa

re

lativ

a

V e íc u lo

2 0 0 m g /k g v .o .

4 0 0 m g /k g v .o .

8 0 0 m g /k g v .o .


0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

% d

e m

as

sa

re

lativ

a


0

2

4

6

8

% d

e m

as

sa

re

lativ

a


0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

% d

e m

as

sa

re

lativ

a


0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

% d

e m

as

sa

re

lativ

a

95

5.4.2 Mutagenicidade in vivo

A. Escolha das doses

Como o modelo de indução de micronúcleo in vivo (OECD 474/2014) propõe um

período de, pelo menos, 3 dias consecutivos de tratamento, a maior dose avaliada (300 mg/kg)

correspondeu a 40% da MDT (Mi et al., 2009), a fim de evitar a ocorrência de toxicidade em

função da exposição repetida às amostras de OEBts. As outras duas doses avaliadas (75 e 150

mg/kg) corresponderam à quarta parte e à metade, respectivamente, da maior dose

selecionada.

B. Avaliação da toxicidade das amostras

Assim como no teste de toxicidade oral aguda, no momento da eutanásia dos

animais foi realizada uma análise macroscópica do baço, fígado e rins seguida da avaliação de

massa relativa dos mesmos. Não foram observados quaisquer sinais de alteração

macroscópica, assim como não houve variação estatisticamente significativa na massa relativa

dos órgãos (Figura 34) em relação aos animais do grupo controle.

Figura 34: Massa relativa (%) dos órgãos baço, rins e fígado de camundongos Swiss após três

dias de tratamento com as amostras OEBt comercial e OEBt CPQBA. Baço

Rins

Fígado

ANOVA, Teste de Tukey, em relação ao veículo. Resultados expressos como média ± erro padrão do grupo, n = 6 animais/grupo; camundongos Swiss fêmeas (6 a 8 semanas de idade); volume máximo administrado: 10 mL/kg. Veículo: solução de tampão fosfato pH 7,0 em sol. de NaCl 0,9% e Tween 80 0,3%; OEBt CPQBA: óleo essencial de

Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; CPA: ciclofosfamida. Tratamento por via oral (veículo, OEBt CPQBA e OEBt comercial); tratamento por via intraperitoneal (CPA).


0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

% d

e m

as

sa

re

lativ

a

O E B t C P Q B A O E B t c o m e rc ia l0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

% d

e m

as

sa

re

lati

va

V e íc u lo

C P A 5 0 m g /k g

7 5 m g /k g

1 5 0 m g /k g

3 0 0 m g /k g


0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

% d

e m

as

sa

re

lativ

a


0

2

4

6

8

% d

e m

as

sa

re

lativ

a

96

Além disso, no primeiro e no quarto dia de experimento, os animais foram

submetidos à coleta de sangue para avaliação de parâmetros hematológicos. Novamente, não

foram evidenciadas diferenças significativas nos elementos sanguíneos, antes e após o

tratamento com as amostras, em relação ao grupo veículo (Tabela 10) e a maioria dos valores

encontra-se dentro dos limites de normalidade para a espécie (Souza, 2017) (Tabela 9).

Tabela 9: Valores de referência de hemograma proposto para camundongos Swiss fêmeas.

Parâmetros Limite Mínimo Limite Máximo

CGB (x103/µL) 1 4,7

CGV (x106/µL) 8,3 12,2

HGB (g/dL) 12,9 15,7

HTC (%) 43,2 54,9

VCM (fL) 45,0 50,7

HCM (pg) 11,9 15,8

CHCM (g/dL) 26,9 29,4

PLQ (x103/µL) 1280 2173

CGB: contagem de glóbulos brancos; CGV: contagem de glóbulos vermelhos;

HGB: hemoglobina; HTC: hematócrito; VCM: volume corpuscular médio, ou

seja, é o volume do eritrócito médio, sendo calculado a partir da concentração de

hemoglobina e eritrócitos totais; HCM: hemoglobina corpuscular média, ou seja,

concentração absoluta de hemoglobina por eritrócito; CHCM: concentração de

hemoglobina corpuscular média, ou seja, concentração média de hemoglobina em

um determinado volume de eritrócitos compactados; PLQ: plaquetas. Calculado a partir de n = 20 animais.

Animais oriundos do Biotério Central do Centro Multidisciplinar para

Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB),

com idade aproximada de 6 meses (Souza, 2017).

Para a contagem de glóbulos brancos, embora o grupo referente à dose de 75

mg/kg do OEBt comercial tenha apresentado valor um pouco acima do limite descrito na

Tabela 9, o mesmo foi normalizado após o tratamento; com exceção do grupo que recebeu a

dose de 75 mg/kg do OEBt CPQBA, embora este aumento não tenha sido significativo em

relação ao grupo controle. Antes do tratamento, os animais referentes às duas menores doses

do OEBt comercial apresentaram um ligeiro aumento na porcentagem de hematócritos,

porém, o aumento não foi estatisticamente significativo em relação à porcentagem verificada

para o grupo controle. Embora o parâmetro referente ao volume corpuscular médio da maioria

dos grupos, antes e após o tratamento, tenha sido superior ao limite máximo descrito por

Souza (2017) e a concentração de hemoglobina corpuscular média tenha sido inferior ao

limite mínimo, para a maior parte dos grupos, essas diferenças não provocaram alterações

significativas no hemograma dos animais.

97

Tabela 10: Parâmetros hematológicos avaliados antes a após o tratamento de camundongos Swiss fêmeas com OEBts.

CGB

(x103/µL)

CGV

(x106/µL)

HGB

(g/dL)

HTC

(%)

Antes Após Antes Após Antes Após Antes Após

Grupo Controle

(veículo) 4,45 ± 0,57 5,43 ± 1,03 10,67 ± 0,20 9,65 ± 0,84 14,75 ± 0,22 13,37 ± 1,13 55,92 ± 0,93 50,52 ± 4,33

OEBt CPQBA

75 mg/mL 4,67 ± 0,88 6,03 ± 0,87 10,24 ± 0,10 10,43 ± 0,13 14,02 ± 0,27 14,13 ± 0,26 53,78 ± 0,60 55,02 ± 0,83

OEBt CPQBA

150 mg/mL 4,18 ± 0,20 3,75 ± 0,33 10,09 ± 0,24 10,88 ± 0,45 13,90 ± 0,31 14,63 ± 0,35 52,72 ± 0,94 55,98 ± 1,29

OEBt CPQBA

300 mg/mL 4,00 ± 0,24 4,12 ± 0,68 10,42 ± 0,25 10,85 ± 0,34 13,82 ± 0,29 14,30 ± 0,17 53,42 ± 0,96 55,22 ± 0,88

OEBt Comercial

75 mg/mL 5,47 ± 0,34 3,93 ±0,47 10,83 ± 0,08 9,99 ± 0,16 15,05 ± 0,26 14,08 ± 0,30 56,28 ± 0,24 52,63 ± 0,79

OEBt Comercial

150 mg/mL 5,03 ±0,71 3,75 ± 0,25 10,67 ± 0,04 10,04 ± 0,09 14,93 ± 0,25 14,20 ± 0,18 55,73 ± 0,18 53,02 ± 0,44

OEBt Comercial

300 mg/mL 4,50 ± 0,33 3,57 ± 0,22 10,38 ± 0,13 9,78 ± 0,51 14,43 ± 0,27 13,74 ± 0,86 54,19 ± 0,48 51,54 ± 3,12

Ciclofosfamida

50 mg/mL 5,12 ± 0,44 3,98 ±0,67 10,65 ± 0,29 10,20 ± 0,16 14,75 ±0,28 14,33 ± 0,27 55,32 ± 1,25 54,07 ± 0,80

ANOVA, Teste de Tukey; resultados expressos como média ± erro padrão do grupo; n = 6 animais/grupo; camundongos Swiss fêmeas (6 a 8 semanas de idade); tratamento

por via oral durante 3 dias; volume máximo administrado: 10 mL/kg.

Grupo Controle: veículo (solução de tampão fosfato pH 7,0 em sol. de NaCl 0,9% e Tween 80 0,3%); OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1,

coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; CPA: ciclofosfamida.

CGB: contagem de glóbulos brancos; CGV: contagem de glóbulos vermelhos; HGB: hemoglobina; HTC: hematócrito. Dados destacados referem-se aos valores que não estão dentro dos limites de normalidade descrito por Souza, 2017.

98

Tabela 10 (continuação): Parâmetros hematológicos avaliados antes a após o tratamento de camundongos Swiss fêmeas com OEBts.

VCM

(fL)

HCM

(pg)

CHCM

(g/dL)

PLQ

(x103/µL)

Antes Após Antes Após Antes Após Antes Após

Grupo Controle

(veículo) 52,43 ± 0,40 52,42 ± 0,26 13,83 ± 0,12 13,88 ± 0,10 26,38 ± 0,21 26,50 ± 0,15 1427 ± 37,73 1389 ± 168,40

OEBt CPQBA

75 mg/mL 52,57 ± 0,60 52,75 ± 0,50 13,68 ± 0,23 13,55 ± 0,17 26,02 ± 0,23 25,68 ± 0,23 1351 ± 109,90 1724 ± 78,43

OEBt CPQBA

150 mg/mL 52,28 ± 0,41 51,67 ± 1,08 13,77 ± 0,07 13,52 ± 0,35 26,33 ± 0,13 26,13 ± 0,18 1389 ± 40,78 1818 ± 152,70

OEBt CPQBA

300 mg/mL 51,32 ± 0,84 51,05 ± 1,06 13,28 ± 0,31 13,23 ± 0,31 25,87 ± 0,21 25,88 ± 0,15 1477 ± 57,36 1833 ± 174,90

OEBt Comercial

75 mg/mL 51,98 ± 0,19 52,68 ± 0,41 13,92 ± 0,19 14,10 ± 0,25 26,73 ± 0,40 26,75 ± 0,26 1487 ± 88,51 1409 ± 76,96

OEBt Comercial

150 mg/mL 52,23 ± 0,16 52,78 ± 0,36 13,98 ± 0,22 14,15 ± 0,22 26,80 ± 0,44 26,78 ± 0,28 1384 ± 69,72 1445 ± 67,24

OEBt Comercial

300 mg/mL 52,34 ± 0,38 52,54 ± 0,67 13,94 ± 0,22 14,00 ± 0,26 26,63 ± 0,34 26,66 ± 0,23 1348 ± 99,65 1445 ± 55,44

Ciclofosfamida

50 mg/mL 52,40 ± 0,53 53,03 ± 0,38 13,98 ± 0,18 14,05 ± 0,19 26,70 ± 0,26 26,52 ± 0,20 1292 ± 111,10 1446 ± 79,14

ANOVA, Teste de Tukey; resultados expressos como média ± desvio padrão do grupo; n = 6 animais/grupo; camundongos Swiss fêmeas (6 a 8 semanas de idade); tratamento

por via oral durante 3 dias; volume máximo administrado: 10 mL/kg.

Grupo Controle: veículo (solução de tampão fosfato pH 7,0 em sol. de NaCl 0,9% e Tween 80 0,3%); OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA

01, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; CPA: ciclofosfamida.

VCM: volume corpuscular médio; HCM: hemoglobina corpuscular média; CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média; PLQ: plaquetas.

Dados destacados referem-se aos valores que não estão dentro dos limites de normalidade descrito por Souza, 2017.

99

C. Avaliação de indução de micronúcleo in vivo

Esfregaços das medulas ósseas coletadas de cada animal foram preparados para a

contagem da frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos (%MNPCE ± EP)

(Figuras 35 e 36).

Figura 35: Fotomicrografia representiva das células analisadas no teste do micronúcleo in

vivo.

Células oriundas da medula óssea de camundongos, coloração Leishman. (A) Eritrócito policromático; (B)

Eritrócito policromático micronucleado e (C) Eritrócito normocromático. MN destacado na seta.

Foto obtida a partir da observação das lâminas ao microscópio óptico (Leica, Modelo SME), na objetiva de 100x, acompanhado de sistema de fotomicroscopia digital (Optikam B3 Digital Camera, OptikaView 7.1).


Figura 36: Frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos (%MNPCE ± EP) em

camundongos Swiss, após três dias de tratamento com as amostras OEBt comercial e OEBt

CPQBA.

0 ,0

0 ,5

1 ,0

1 ,5

2 ,0

2 ,5a

b ,c a ,c

a ,c

a ,ca ,c

V e ícu lo

C P A 5 0 m g /k g

O E B t C P Q B A 7 5 m g /k g



O E B t co m erc ia l 7 5 m g /k g

O E B t co m erc ia l 1 5 0 m g /kg

O E B t co m erc ia l 3 0 0 m g /kg% M

NP

CE

c

ANOVA, Teste de Tukey; resultados expressos como média ± erro padrão; a = p<0,001 e b = p<0,01, em relação

ao veículo e c = p<0,001, em relação à ciclofosfamida.

Camundongos fêmeas Swiss (6 a 8 semanas, n = 6 animais por grupo); veículo: solução de tampão fosfato pH

7,0 em sol. de NaCl 0,9% e Tween 80 0,3%; OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar

CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível

comercialmente; CPA: ciclofosfamida; tratamento por via oral (veículo, OEBt CPQBA e OEBt comercial);

tratamento por via intraperitoneal (CPA).

A B

C

100

Os animais tratados com o veículo (solução de tampão fosfato pH 7,0 em sol. de

NaCl 0,9% e Tween 80 0,3%), na dose de 10 mL/kg, apresentaram valor médio de MNPCE

de 0,238 ± 0,147% enquanto a ciclofosfamida (50 mg/kg, i.p.) elevou a frequência de MNs

para 2,119 ± 0,074% (p<0,001). Por sua vez, o OEBt comercial (75, 150 e 300 mg/kg)

induziu um aumento, significativo e dependente da dose, na frequência de MNPCE’s (0,691 ±

0,095%, 1,003 ± 0,202% e 1,216 ± 0,140%, respectivamente) em relação ao controle negativo

(p<0,001). Já a amostra OEBt CPQBA também induziu um aumento na frequência de

micronúcleos, de maneira dependente das doses empregadas, porém apenas os valores de

MNPCE nas doses de 150 e 300 mg/kg (0,6263 ± 0,151% e 0,9437 ± 0,095%,

respectivamente) foram significativamente diferentes dos valores observados para o grupo

veículo (Figura 36).

De acordo com o guia da OECD 474 (2014), uma amostra é considerada

mutagênica quando ao menos um dos grupos de tratamento exibir um aumento

estatisticamente significativo na frequência de eritrócitos imaturos micronucleados em

comparação com o controle negativo. Neste caso, somente o grupo que recebeu a dose de 75

mg/kg do OEBt CPQBA não apresentou aumento na %MNPCE em relação ao grupo veículo.

Além disso, o aumento na frequência de MNs induzido por ambos os OEs, em

relação ao veículo, foi inferior àquele observado para a ciclofosfamida; na maior dose (300

mg/kg), o OEBt comercial apresentou uma incidência de MNPCE correspondente a 56%

daquela induzida por CPA, enquanto o aumento da frequência induzida por OEBt CPQBA foi

equivalente a cerca de 45% de MNPCE observados no controle positivo. Mais ainda, a

diferença observada na indução de MNs entre as duas amostras de OEs (OEBt comercial

induziu uma frequência maior de MNs do que OEBt CPQBA) foi estatisticamente

significativa entre si, o que pode estar relacionado à diferença da composição química dos

mesmos.

Este resultado in vivo de indução de micronúcleos corroborou os achados do teste

Cometa in vitro, sugerindo que o óleo essencial de B. trimera comercial (com alto teor de

acetato de carquejila) apresenta um efeito genotóxico/mutagênico maior (Figura 36) do que o

óleo essencial obtido a partir do cultivar de B. trimera CPQBA 1 (teores similares de

biciclogermacreno, E-cariofileno e germacreno D).

Os resultados obtidos no experimento in vivo permitiram determinar para o OE B.

trimera CPQBA 1 que a dose que não produz efeito mutagênico (NOEL = no observed effect

level) (COM, 2010) foi a dose de 75 mg/kg. Segundo Reagan-Shaw e colaboradores (2007),

101

esta dose pode ser extrapolada para humanos considerando-se a área da superfície corporal;

desta forma, a dose não mutagênica equivalente para humanos adultos seria:

DoseOEBt CPQBA = 75 mg/kg × (3 37)⁄

∴ DoseOEBt CPQBA ≅ 6 mg/kg

Sendo 75 mg/kg (NOEL em camundongos), 3 (fator de conversão para

camundongos) e 37 (fator de conversão para humano adulto de 60 kg). Os fatores de

conversão são obtidos a partir do peso corporal (kg) dividido pela área da superfície corporal

(m2) (Reagan-Shaw et al., 2007).

Assim, estudos complementares de atividade antiparasitária são necessários a fim

de evidenciar se a dose NOEL estimada para humanos permite o uso seguro para o tratamento

de infecções por Schistosoma.

5.5 Estudos da metabolização do óleo essencial

5.5.1 Análise por ESI-MS de alta resolução

Na análise da composição química do óleo essencial por espectrometria de massas

foram identificadas as respectivas massas dos compostos analisados previamente por CG para

as respectivas amostras listadas na Tabela 11.

102

Tabela 11: Compostos identificados nos óleos essenciais de B. trimera (Less.) DC.

Compostos Massa

Neutra

OEBt

CPQBA

OEBt

comercial

α-pineno 136,1252 + -

sabineno 136,1252 - +

β-pineno 136,1252 + +

Mirceno 136,1252 + -

Limoneno 136,1252 - +

(E)-β-ocimeno 136,1252 + +

Acetato de carquejila 192,2542 - +

β-elemeno 204,1878 + +

cariofileno 204,1878 + -

α-guaieno 204,1878 + -

α-humuleno 204,1878 + -

α-Muuroleno 204,1878 + -

γ-muuroleno 204,1878 + +

(-)-Germacreno D 204,1878 + +

Biciclogermacreno 204,1878 + -

(+)-δ-Cadineno 204,1878 + -

Palustrol 222,3663 - +

espatulenol 220,1827 + -

Globulol 222,1984 + -

τ-Muurolol 222,3663 + -

(-)-α-Cadinol 222,3663 + -

(+) composto presente; (-) composto ausente; OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar

CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível

comercialmente.

Após a análise por ESI-MS, os perfis químicos (full scan) das amostras (meio de

cultura, OEBt CPQBA e comercial sem e com tratamento com enzimas S9) foram analisados

por um método de reconhecimento de padrões, o qual se destina a agrupar as amostras com

características semelhantes e distingui-las das demais que, por sua vez, poderão vir a formar

outro grupo; no presente estudo foi utilizada a análise discriminante com calibração

multivariada por mínimos quadrados parciais com VIP score (do inglês, Partial Least

Squares for Discriminant Analysis - PLS-DA; Variable Importance in Projection - VIP

score). O PLS-DA é classificado como um método supervisionado, pois é desenvolvido

mediante o conhecimento prévio das classes do conjunto de calibração (Naes et al., 2002). A

partir da lista de VIP score gerada pela análise de PLS-DA, foram selecionados os marcadores

químicos (Tabelas 12 e 13) que mais contribuíram para a formação do modelo de

clusterização apresentado nas Figuras 37, 38 e 39. Todos os marcadores foram selecionados

103

com base no ponto de corte de 1,5 do VIP score gerado pelos respectivos modelos de

clusterização apresentados (Figuras 37, 38 e 39).

Assim, a análise estatística do perfil químico (full scan) das amostras de OEBt

CPQBA e OEBt comercial por PLS-DA com VIP score (Figura 37), antes do processo de

metabolização confirmou que há diferenças entre as duas amostras e os marcadores

característicos responsáveis por essas diferenças são apresentados na Tabela 12. Foi realizado

também análise de full scan após o processo de metabolização pelas enzimas da fração S9,

através de PLS-DA com VIP score, o que possibilitou visualizar (Figuras 38 e 39) que o

tratamento com o mix S9 promoveu alterações (metabolização) nos componentes dos óleos

essenciais, corroborando a hipótese postulada a partir do teste in vitro de indução de

micronúcleos, no qual a redução do potencial mutagênico poderia ser explicada pela

conversão de compostos hidrocarbonetos em derivados oxidados a partir da metabolização

dos mesmos (Della Torre, 2013).

Figura 37: Classificação das amostras de óleo essencial de Baccharis trimera pelo modelo de

PLS-DA.

A B

(A) Modo negativo; (B) Modo positivo. Score plot em vermelho: OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis

trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; Score plot em verde: OEBt comercial: óleo essencial de

Baccharis trimera disponível comercialmente. Substâncias identificadas nestas amostras estão descritas na Tabela 11.

104


partir de 1,5, na comparação entre OEBt CPQBA e OEBt comercial.

Número

Modo Positivo* Modo Negativo*

OEBt

CPQBA

OEBt

comercial

OEBt

CPQBA

OEBt

comercial

1 58,5408 107,0480 85,1862 91,1771

2 172,9116 119,0481 111,1179 105,1414

3 183,1024 121,0280 125,0970 113,0607

4 184,1024 121,1805 127,1125 116,1116

5 197,1138 125,0280 143,1097 131,1138

6 198,8460 131,0472 153,1302 132,1026

7 203,7194 133,0638 171,1392 133,1046

8 208,0587 133,0638 174,2596 133,3117

9 208,0929 133,1337 186,2000 134,1075

10 223,1289 135,0429 191,1464 136,1226

11 223,1332 136,0142 195,2481 139,1148

12 257,7970 136,2058 200,2833 145,0677

13 263,1265 137,0218 202,2042 151,1151

14 269,1737 147,1076 203,1838 152,1159

15 277,2151 148,1297 213,2039 165,1286

16 279,2308 151,0735 217,1991 182,2219

17 285,1685 161,1840 219,2114 193,1236

18 299,1847 162,1511 221,1937 210,2059

19 310,7979 163,0724 233,1911 211,1343

20 315,2111 163,1087 234,1949 223,1705

21 336,7042 165,1246 236,2026 224,1299

22 339,1919 179,1040 238,2178 225,1135

23 458,2973 217,5947 239,2020 226,1452

24 475,6095 223,0235 249,2110 227,167

25

240,1626 270,2078 231,1005

26

287,1101 271,2433 241,1087

27

297,0450 284,2239 241,2176

28

307,2952 286,2037 242,1404

29

315,3000 287,2398 258,2446

30

371,1850 289,3342 265,2003

31

485,1526 302,2349 274,2412

32 303,2344

33 338,3432

34 371,1019

35 372,1000

* marcadores descritos em unidades de massa atômica (u.m.a); as análises foram feitas a partir do full scan por

espectrometria de massas por ionização por electrospray, nos modos positivo e negativo, conforme plot

apresentado na Figura 37.


comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente.

105


partir de 1,5, na comparação entre OEBts CPQBA e comercial metabolizada pela fração S9.

Número

OEBt CPQBA S9+ OEBt comercial S9+

Modo

Negativo*

Modo

Positivo*

Modo

Negativo*

Modo

Positivo*

1 116,4821 158,9760 93,0280 116,0794

2 130,1243 177,1770 94,0280 120,9752

3 132,6076 178,1207 98,0178 131,0802

4 178,2271 184,7028 115,1627 137,0703

5 182,1471 204,9340 121,0210 142,9587

6 191,0943 223,1131 122,0210 145,0968

7 192,5077 223,1131 129,1174 178,1206

8 194,7441 224,1131 130,1695 184,1469

9 204,4023 240,9429 138,2669 185,2036

10 209,6553 245,0967 151,0294 186,2354

11 220,0463 246,1001 151,0295 195,0323

12 225,1085 283,0403 152,0294 200,1880

13 226,1026 300,3121 176,1138 202,1954

14 242,1591 323,0356 178,0384 204,9340

15 258,0414 349,2070 182,1058 209,0126

16 260,4461 389,1409 194,1322 216,2124

17 277,1250 390,2261 203,7829 226,2046

18 293,2000 394,1126 220,9461 234,2244

19 309,8226 395,1091 222,0327 236,1307

20 336,6373 404,2499 225,1086 241,2341

21 369,8454 432,4386 226,1118 243,2136

22 376,3765 437,3201 242,1591 244,2089

23 431,2711 438,3201 253,1995 258,3100

24 458,2006 513,9478 257,8036 269,3080

25 593,2021 260,2295 294,2283

26 594,2021 267,1414 296,2418

27 610,2299 267,1414 308,2174

28 612,2299 268,1414 323,0355

29 659,3371 274,1381 335,1318

30 275,1459 384,3769

31 291,1396 424,3145

32 292,1396 425,3184

33 294,1477 453,2962

34 462,2043

35 536,2055

*marcadores descritos em unidades de massa atômica (u.m.a); as análises foram feitas a partir do full scan por

espectrometria de massas por ionização por electrospray, nos modos positivo e negativo, conforme plot

apresentado nas Figuras 38 e 39.


comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; S9+: presença de enzimas.

106

Figura 38: Classificação da amostra de óleo essencial de Baccharis trimera obtida a partir do

cultivar CPQBA 1 pelo modelo de PLS-DA.

A B

(A) Modo negativo; (B) Modo positivo. Score plot em vermelho: OEBt CPQBA (25 µg/mL) em meio de cultura;

score plot em verde: OEBt CPQBA (25 µg/mL) em meio de cultura com S9; score plot em azul: meio de cultura;

score plot em ciano: meio de cultura com S9; score plot em rosa: OEBt CPQBA.

OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; meio de

cultura: RPMI 1640 + 5% de soro fetal bovino; S9: mix de enzimas hepáticas humanas.

Figura 39: Classificação da amostra de óleo essencial de Baccharis trimera obtida

comercialmente pelo modelo de PLS-DA.

A B

(A) Modo negativo; (B) Modo positivo. Score plot em vermelho: OEBt comercial (25 µg/mL) em meio de

cultura; score plot em verde: OEBt comercial (25 µg/mL) em meio de cultura com S9; score plot em azul: meio

de cultura; score plot em ciano: meio de cultura com S9; score plot em rosa: OEBt comercial. OEBt comercial: óleo essencial de B. trimera disponível comercialmente; meio de cultura: RPMI 1640 + 5% de

soro fetal bovino; S9: mix de enzimas hepáticas humanas.

107

Desta forma, através da abordagem metabolômica de fingerprint (análise

qualitativa global e rápida da amostra) (Ulrich-Merzenich et al., 2007), as comparações

realizadas tanto no modo positivo como no modo negativo consideraram como marcadores

apenas os compostos que se destacaram nas respectivas amostras. Assim, foi possível

evidenciar, a partir da análise de PLS-DA com VIP score, que há diferenças nos compostos

existentes nos OEBt CPQBA e comercial após o processo de metabolização com as enzimas

da fração S9 (Figuras 38 e 39), uma vez que ambas amostras de OEBt metabolizadas

apresentam-se claramente separadas das demais amostras. Adicionalmente, a lista dos

marcadores apontados como metabólitos de OEBt CPQBA e comercial (Tabelas 12 e 13)

apresentaram marcadores com massas completamente diferentes em si, o que mostra que os

produtos da metabolização dessas duas amostras são diferentes e podem estar relacionados às

diferentes atividades biológicas encontradas para ambas as amostras de OEBts.

A técnica empregada de análise por espectrometria de massas de alta resolução

apresenta uma limitação, que consiste na impossibilidade de diferenciação de isômeros

constitucionais (mesma fórmula molecular para diferentes fórmulas estruturais), como

observado para os monoterpenos e sesquiterpenos identificados nos óleos essenciais de B.

trimera (Tabela 11). Portanto, o método utilizado possibilitou verificar que, após o processo

de metabolização, houve formação de metabólitos e que os mesmos diferem entre as

amostras. Porém, como os compostos identificados apresentaram valores de massa muito

próximos, não foi possível, neste primeiro momento, a identificação da origem desses

metabólitos.

5.5.2 Microextração em fase sólida - Headspace dinâmico

Na tentativa de identificar os compostos responsáveis pelas alterações nos efeitos

mutagênicos/genotóxicos promovidas pelas enzimas da fração S9 nas amostras de OEBt e

evidenciadas pela técnica de fingerprint, utilizou-se a técnica de microextração em fase sólida

de voláteis dispersos em headspace. O termo headspace descreve a fase gasosa (substâncias

voláteis) acima de uma amostra, líquida ou sólida, contida em um recipiente fechado; a

amostragem desse material pode ser feita com ou sem o auxílio de um gás de arraste e os

voláteis podem ser adsorvidos em uma fibra (microextração em fase sólida), para então serem

dessorvidos no injetor do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector seletivo de massas. Esta

técnica é sensível, permite a análise direta da amostra sem adição de solventes e é

amplamente utilizada para análise de substâncias voláteis produzidas por plantas e

108

microrganismos (Stashenko e Martínez, 2008; Jerković e Marijanović, 2009; Soria et al.,

2015).

Assim, foram analisadas as amostras de OEBt CPQBA (Figura 40) e comercial

(Figura 41) diluídas em meio de cultura, sem e com a adição de fração S9. Os compostos

identificados, por comparação com padrões de fragmentação e por cálculo de índice de

retenção relativo, estão listados na Tabela 14.

Figura 40: Cromatogramas por CG/EM do OEBt CPQBA após técnica de microextração em

fase sólida.

OEBt CPQBA OEBt CPQBA + S9

Condições utilizadas: amostra na concentração de 50 µg/mL, agitação de 500 rpm, 40°C, 10 minutos de pré-

equilíbrio; extração em fibra PDMS-DVB por 30 minutos, dessorção por 10 minutos e análise por cromatografia

gasosa com detecção por espectrometria de massas CG/EM.

OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera, cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014; S9:

enzimas hepáticas.

Figura 41: Cromatogramas por CG/EM do OEBt comercial após técnica de microextração

em fase sólida.

OEBt comercial OEBt comercial + S9

Condições utilizadas: amostra na concentração de 50 µg/mL, agitação de 500 rpm, 40°C, 10 minutos de pré-

equilíbrio; extração em fibra PDMS-DVB por 30 minutos, dessorção por 10 minutos e análise por cromatografia

gasosa com detecção por espectrometria de massas CG/EM.

OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera disponível comercialmente; S9: enzimas hepáticas.

Verificou-se que, tanto para a amostra de OEBt CPQBA como para a amostra

comercial, o processo de metabolização resultou em diferenças nas porcentagens relativas de

alguns compostos, bem como na presença e ausência de alguns compostos (Tabela 14).

109

Tabela 14: Compostos identificados por CG/EM após técnica de microextração em fase

sólida.

tr

(min) Compostos IRRCal IRRLit

% área relativa

OEBt

comercial OEBt CPQBA

S9- S9+ S9- S9+

5,96 α-pineno 932 932 - - 0,73 0,35

6,82 sabineno 964 969 1,11 0,65 - - 7,14 β-pineno 976 974 0,64 0,70 2,69 2,60

7,50 β-mirceno 990 988 - - 0,31 0,78

8,29 limoneno 1014 1024 4,45 4,21 - -

8,81 AO n.i.I 1029 n.d. 1,68 3,06 4,40 5,26

9,17 E-β-ocimeno 1039 1044 5,94 5,81 - -

11,28 linalol 1098 1095 - - 2,19 0,40

11,39 tetrahidrolinalool 1101 1098 - - 1,08 2,63

12,69 dihidrolinalool 1133 1131 - - 2,20 0,95

13,86 MO n.i. II 1162 n.d. - 3,92 - -

14,90 MO n.i. III 1187 n.d. 0,23 1,26 - -

18,87 MO n.i. IV 1281 n.d. 2,33 2,15 - -

19,95 acetato de carquejila 1307 1298 52,17 43,26 - -

20,29 MO n.i. V 1315 n.d. 3,98 3,19 - -

20,56 MO n.i. VI 1321 n.d. 4,29 3,82 - -

20,70 MO n.i. VII 1325 n.d. 1,25 1,06 - -

21,07 MO n.i. VIII 1333 n.d. 1,13 1,00 - - 21,40 MO n.i. IX 1341 n.d. 1,67 1,46 - -

23,45 β-elemeno 1390 1389 1,94 2,45 0,69 1,11

24,54 E-cariofileno 1417 1417 - - 8,73 12,76

25,12 SH n.i. X 1432 n.d. - - 1,60 1,08

25,31 α-guaieno 1437 1437 - - 3,61 5,33

25,39 aromadendreno 1439 1439 - - 2,18 -

25,88 α-humuleno 1451 1452 - - 1,16 1,54

26,19 aloaromadendreno 1459 1458 - - 1,16 1,57

26,83 γ-muuroleno 1475 1478 - - 2,05 2,31

27,01 germacreno D 1479 1484 - - 2,27 3,95

27,66 biciclogermacreno 1495 1500 - - 7,66 10,78

27,77 α-muuroleno 1498 1500 - - 1,87 1,91

28,68 δ-cadineno 1523 1522 - - 5,25 5,80

30,35 espatulenol 1568 1577 - - 1,19 1,02

30,41 palustrol 1570 1567 2,04 2,92 - -

30,96 globulol 1585 1590 - - 4,33 3,94 31,21 viridiflorol 1592 1592 - - 2,67 2,44

31,53 ledol 1601 1602 - - 1,06 0,80

32,63 τ-muurolol 1646 1640 - - 0,64 0,57

32,96 α-cadinol 1659 1652 - - 0,40 0,39

Monoterpenos hidrocarbonetos (MH) 12,14 11,37 3,73 3,73

Substâncias alquílicas oxigenadas (AO) 1,68 3,06 4,4 5,26

Monoterpenos oxigenados (MO) 14,88 17,86 5,47 3,98

Sesquiterpenos hidrocarbonetos (SH) 1,94 2,45 38,23 48,14

Sesquiterpenos oxigenados (SO) 54,21 46,18 10,29 9,16

Total 84,85 80,92 62,12 70,27 tR: tempo de retenção (min); IRRcal: índice de retenção relativa calculado; IRRlit; índice de retenção relativa descrito na literatura (Adams,

2007); n.d. = não determinado; n.i. = não identificado; AO n.i. I = C8H18O [P.M.: 130; m/z (%): 130 (<5), 70 (24), 57 (100), 43 (37)]; MO

n.i. II = C10H14O [P.M.: 150; m/z (%): 150 (<5), 135 (47), 117 (38), 91 (77), 79 (100)]; MO n.i. III = C10H12O [P.M.: 148; m/z (%): 148 (87),

133 (73), 105 (100), 77 (30)]; MO n.i. IV = C12H20O2 [P.M.: 196; m/z (%): 196 (<5), 136 (16), 121 (14), 93 (15), 67 (11), 43 (100)]; MO n.i.

V = C12H18O2 [P.M.: 194; m/z (%): 194 (<5), 119 (31), 91 (27), 79 (15), 43 (100)]; MO n.i. VI = C12H18O2 [P.M.: 194; m/z (%): 194 (<5),

134 (35), 119 (46), 93 (55), 79 (17), 43 (100)]; MO n.i. VII = C12H18O2 [P.M.: 194; m/z (%): 194 (<5), 134 (22), 119 (34), 91 (27), 84 (55),

43 (100)]; MO n.i. VIII = C12H20O2 [P.M.: 196; m/z (%): 196 (<5), 136 (13), 121 (17), 93 (18), 81 (13), 43 (100)]; MO n.i. IX = C12H20O2

[P.M.: 196; m/z (%): 196 (<5), 136 (28), 121 (37), 93 (99), 79 (37), 43 (100)]; SH n.i. X = C15H24 [P.M.: 204; m/z (%): 204 (15), 161 (64),

135 (15), 122 (71), 107 (100), 81 (95), 41 (89)]; (-): substância não detectada na amostra em estudo.

110

Analisando os resultados obtidos para as amostras de OEBts (CPQBA e

comercial), foi possível observar que a análise por microextração em fase sólida do headspace

da amostra de óleo essencial dispersa em meio de cultura, sem adição de enzimas de

metabolização, resultou na identificação de um número um pouco maior de compostos (17

substâncias identificadas para OEBt CPQBA e 9 para OEBt comercial, por inserção direta,

Tabela 3; 25 substâncias identificadas para OEBt CPQBA e 15 para OEBt comercial, por

microextração, Tabela 14). Ainda assim, considerando-se a somatória das áreas relativas dos

compostos identificados, observou uma diminuição na identificação após microextração em

fase sólida de headspace (62,12 e 84,85% para OEBts CPQBA e comercial, respectivamente,

Tabela 14) em relação à análise por inserção direta da solução de cada óleo essencial (87,25 e

89,49% para OEBts CPQBA e comercial, respectivamente, Tabela 3) (Figura 42).


Baccharis trimera, antes e depois do tratamento com fração S9.

Comercial S9- Comercial S9+ CPQBA S9- CPQBA S9+

0

25

50

75

100

Área

rela

tiv

a (

%)

OEBt

não determinado

sesquiterpenos oxigenados

sesquiterpenos hidrocarbonetos

monoterpenos oxigenados

substâncias alquílicas oxigenadas

monoterpenos hidrocarbonetos

Amostras de OEBts analisadas por CG/EM após microextração em fase sólida de headspace dinâmico.

S9-: antes do tratamento com fração S9; S9+: depois do tratamento com fração S9; Comercial: óleo essencial das partes aéreas de B. trimera oriundo do Rio Grande do Sul; CPQBA: óleo essencial das partes aéreas de B.

trimera cultivar CPQBA 1.

111

Com relação à metabolização promovida pela fração S9, observou-se uma redução

nos teores relativos totais de monoterpenos (-27%) e sesquiterpenos (-11%) oxigenados na

amostra de OEBt CPQBA acompanhada por um aumento nos teores totais de sesquiterpenos

hidrocarbonetos (+26%) e de substâncias alquílicas oxigenadas (+20%), sem grandes

alterações no teor total de monoterpenos hidrocarbonetos (Figura 42). Por sua vez, a amostra

de OEBt comercial apresentou uma redução no teor total de sesquiterpenos oxigenados (-

15%) e um aumento nos teores de substâncias alquílicas oxigenadas (+82%), monoterpenos

oxigenados (+20%) e sesquiterpenos hidrocarbonetos (+26%) (Figura 42).

Considerando-se os compostos identificados individualmente, as maiores

alterações (acima de 25% de variação) após o tratamento com fração S9 foram, para o OEBt

CPQBA, a não detecção de aromadendreno juntamente com a redução nos teores de linalol (-

72%), diidrolinalol (-57%), -pineno (-52%) e do sesquiterpeno hidrocarboneto não

identificado n.i. X (-32%) e o incremento nos teores de β-mirceno (+2,5x), tetraidrolinalol

(+2,5x), germacreno D (+74%), β-elemeno (+61%), α-guaieno (+48%), E-cariofileno (+46%),

biciclogermacreno (+41%), aloaromadendreno (+35%) e α-humuleno (+33%) (Tabela 14).

Finalmente, para o OEBt comercial, o tratamento com fração S9 resultou na

detecção de um monoterpeno oxigenado n.i. II juntamente com a redução no teor de sabineno

(-41%) e incrementos nos teores relativos de monoterpeno oxigenado n.i. III (+5,5x),

substância alquílica oxigenda n.i. I (+82%), palustrol (+43%) e β-elemeno (+26%) (Tabela

14).

112

6. CONCLUSÕES

Foi possível evidenciar uma grande diferença na composição química entre os

OEs obtidos das partes aéreas de B. trimera cultivar CPQBA 1 (OE rico em sesquiterpenos

hidrocarbonetos) e a amostra comercial, proveniente do Rio Grande do Sul (OE rico em

sesquiterpenos oxigenados).

Essa variação química refletiu-se em variações no efeito antioxidante, sendo o

OEBt comercial um pouco mais ativo quanto à capacidade de sequestrar radicais ABTS•+

e o

OEBt CPQBA mais ativo quanto à capacidade de neutralizar radicais peroxila (ORAC). Não

foram observadas diferenças quanto à capacidade de sequestrar radicais DPPH• nem com

relação à atividade antiproliferativa (efeito citostático fraco), em painel de células tumorais e

não tumorais.

Os estudos de mutagenicidade in vitro sugerem que ambas as amostras de OEBt

são capazes de induzir um aumento significativo na frequência de MNs e que enzimas

metabólicas revertem esse efeito mutagênico. Já com relação ao efeito genotóxico, o OEBt

comercial induziu um dano ao DNA mais intenso do que o OEBt CPQBA; novamente esse

dano foi revertido pela adição do sistema de metabolização exógena (fração S9).

Quando administrado por via oral, em dose única, ambos OEBts apresentaram

máxima dose tolerável superior a 800 mg/kg. A avaliação de mutagenicidade in vivo, através

da avaliação da frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos (MNPCE), indicou

que o OEBt CPQBA foi menos mutagênico do que o OEBt comercial. Esses resultados

corroboraram os achados do teste Cometa in vitro, sugerindo que o OEBt comercial (com alto

teor de acetato de carquejila) apresenta um efeito genotóxico/mutagênico maior do que o

OEBt CPQBA (com teores similares de biciclogermacreno, E-cariofileno e germacreno D).

Finalmente, tanto a análise por ESI-MS quanto a análise por CG/EM após a

técnica de microextração em fase sólida de voláteis dispersos em headspace das amostras de

OEBt CPQBA e OEBt comercial antes e após o tratamento com fração S9, permitiram

evidenciar a existência de diferenças químicas significativas entre as amostras, que

explicariam as variações nos efeitos mutagênico/genotóxico in vitro.

Assim, os resultados obtidos sugerem que o OEBt CPQBA, além de menos

genotóxico/mutagênico do que OEBt comercial, também apresenta um efeito antioxidante

mais evidente e que essas diferenças podem estar relacionadas com as variações encontradas

na composição química. Estes resultados indicam uma potencial segurança no uso terapêutico

de OEBt CPQBA, o que poderá ser comprovado em estudos complementares.

113

7. REFERÊNCIAS

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136

ANEXO 1 - Certificado de Registro no Cadastro Nacional de Biodiversidade.

138

ANEXO 2 - Cromatogramas dos óleos essenciais de Baccharis trimera cv. CPQBA 1, obtidos

por CG/EM.

A

B

C

D

Cromatogramas referentes aos óleos essenciais extraídos em (A) Jan/14, (B) Fev/14, (C) Mar/14 e (D) Abr/14.

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - j a n - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - f e v - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - m a r - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - a b r - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

139

E

F

G

H

Cromatogramas referentes aos óleos essenciais extraídos em (E) Maio/14, (F) Jun/14, (G) Jul/14 e (H) Ago/14.

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - m a i - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - j u n - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - j u l - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

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A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - a g o - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

140

I

J

K

L

Cromatogramas referentes aos óleos essenciais extraídos em (I) Set/14, (J) Out/14, (K) Nov/14 e (L) Dez/14.

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - s e t - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

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A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - o u t - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - n o v - 1 4 . D \ d a t a . m s ( * )

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

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A b u n d a n c e

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141

M

N

Cromatogramas referentes aos óleos essenciais: (M) OEBt CPQBA: óleo essencial de Baccharis trimera,

cultivar CPQBA 1, coletado de Jan a Dez/2014 e (N) OEBt comercial: óleo essencial de Baccharis trimera

disponível comercialmente.

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

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A b u n d a n c e

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5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

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A b u n d a n c e

T I C : O E - B t r i m - L A S Z L O . D \ d a t a . m s ( * )

142

ANEXO 3 - Certificados da Comissão de Ética no Uso de Animais.

144

ANEXO 4 - Declaração de Direitos Autorais

Unicamprepositorio.unicamp.br/jspui/bitstream/REPOSIP/... · ADRIANA DELLA TORRE ÓLEO ESSENCIAL DE...

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