Acetilazione• L’enzima N-acetiltransferasi (NAT) catalizza

l’acetilazione di ammine aromatiche ed idrazine riduzione dell’idrofilia.

• Esistono 2 forme di NAT (nell’uomo), NAT 1 (monomorfa?) e NAT2 (polimorfa).

• Il donatore di gruppi acetile è l’acetilCoA

• Detossificazione vs. attivazione metabolica

• La NAT può sia attivare che detossificare i suoi substrati

• Es.: idrazina acetilidrazina acetilidrazina NAT ossidata

diacetilidrazina

(stabile)

metabolita reattivo

tossico

•Ammine aromatiche•La NAT è detossificante perché impedisce l’ossidazione da parte di PHS ed altri enzimi (es. 2-naftilammina).

•Tuttavia, se l’ammina viene N-idrossilata (da CYP450) prima di essere acetilata, la NAT può, in questo caso, catalizzare una O-acetilazione.•Il gruppo acetossi che si forma è un buon ‘gruppo uscente’.•Si può formare uno ione nitrenio, elettrofilo altamente reattivo.

• La tossicità dei substrati delle NAT dipende quindi da:

struttura della molecola fenotipo acetilante attività degli enzimi ossidativi (es. CYP1A2)

Coniugazione con amminoacidi. Due tipi di reazione

1. Xenobiotico con gruppo acido carbossilico si legano al gruppo amminico degli a.a. (glicina, taurina, glutammina). La coniugazione può aumentare l’escrezione renale da parte dei sistemi di trasporto tubulari.

Questa reazione è sempre detossificante; alternativa alla glucuronidazione (che può portare ad acilglucuronidi reattivi; es. FANS, ibuprofen)

2. Idrossilammine aromatiche + gruppo acido di a.a. (serina, prolina) ammidi che possono formare gli ioni nitronio, fortemente reattivi.

Le idrossilammine che si formano per N-idrossilazione, da parte di CYP450, delle ammine aromatiche, possono essere attivate da diverse reazioni di fase II (glucuronidazione, O-acetilazione, O-solfatazione, coniugazione con a.c.)

Coniugazione con glutatione• Un ampio spettro di substrati da’ reazioni di

coniugazione con il glutatione, con meccanismi diversi:

• Elettrofili (carboni fenilici e allilici): R-X + GS- R-S-G (tioetere) + X- X = (Cl, NO2, SO4, PO4)

• GS- può anche addizionarsi a composti insaturi (alcheni, chetoni)

• La coniugazione con GSH può detossificare molti composti elettrofili formatisi in fase I (epossidi, chinoni, chinoneimmine ecc.)

• GS- può anche dare reazioni di sostituzione con eteroatomi (O, N, S); es., nitroglicerina

• Le reazioni possono avvenire spontaneamente (elevata concentrazione cellulare di GSH) oppure essere catalizzate (maggiore velocità) dalla Glutatione-S-transferasi (GST).

• La GST è un enzima ampiamente diffuso (fegato, reni, intestino, polmoni), molto abbondante nelle cellule (fino al 10% delle proteine totali).

• Esistono 4 classi solubili e 2 microsomiali di GST; almeno alcune di queste sono inducibili

• Molto importante nella detossificazione di metaboliti reattivi formatisi nelle reazioni di fase I e II.

• La resistenza a xenobiotici tossici è spesso associata a sovraespressione della GST:

insetti resistenti a DDTpiante resistenti ad atrazina cellule tumorali resistenti a chemioterapici

• Differenze interspecie nell’attività GST differenze interspecie nella tossicità

Es.: aflatossina B1 cancerogena nell’uomo e nel ratto ma non nel topo, che ha alti livelli di una forma di GST.

• Differenze interindividuali. Sono stati individuati polimorfismi genetici per due delle forme di GST umana (GST Mu1 e GST Tau1). Nei caucasici, circa metà della popolazione non esprime GST Mu1. Questi individui hanno un rischio più elevato di cancro colo-rettale e potrebbero essere più sensibili al tumore polmonare indotto dal fumo.

• Tossicità dei GSH coniugati4 meccanismi; 3 riguardano alogeno derivati

alchilici, che formano reattivi elettrofili formazione di cistein-derivati di chinoni

riduzione del potenziale redox facilitazione dell’ossidazione a chinoni e formazione di policistein-derivati dei chinoni ulteriore riduzione del potenziale di ossidazione alchilazione di proteine; ciclo redox, con formazione di ROS (radicale .OH) nefrotossicità: necrosi tubulare e cancerogenesi (es. bromobenzene, p-aminofenolo, idrochinone)

Induzione enzimatica

• Numerosi agenti (farmaci, xenobiotici di sintesi e naturali, alimenti) possono indurre l’aumento della sintesi degli enzimi metabolizzanti, sia di fase I che di fase II.

• Gli induttori possono essere suddivisi in classi, in dipendenza del pattern di induzione.

• Alcune classi inducono un aumento della sintesi di numerosi enzimi metabolici. Altre classi sono induttori più selettivi; in genere, comunque, un induttore stimola la sintesi di più di un enzima metabolizzante.

• Induttori ‘ad ampio spettro’ come il fenobarbital determinano un’ipertrofia epatica e proliferazione del reticolo endoplasmatico aumento generalizzato della sintesi proteica nel fegato (regione centro-lobulare) aumento di numerosi enzimi metabolizzanti.

• Idrocarburi policiclici aromatici (IPA): inducono l’aumento della sintesi di alcuni isozimi CYP450 (soprattutto CYP1A1), con elevata capacità catalitica verso gli induttori, e, in misura minore, di altri enzimi (epossido idrolasi, UDP-glucurunosiltransferasi, glutatione-S-transferasi).

• Altri induttori importanti sono: pesticidi alogenati (DDT, esaclorobenzene ecc.); policlorobifenili (PCB) e polibromobifenili (PBB); diossine clorurate (in particolare TCDD); steroidi.

• E’ stata proposta la classificazione degli induttori in 2 classi, in dipendenza degli enzimi indotti e del meccanismo dell’induzione:

1. Induttori bifunzionali (TCDD, IPA e altri): inducono sia enzimi di fase I che enzimi di fase II;

2. Induttori monofunzionali (difenoli, tiocarbammati, isotiocianati ed altri): inducono prevalentemente enzimi di fase II (glutatione-S-transferasi, UDP-glucuronosiltransferasi) e la DT diaforasi (o NADPH-chinone reduttasi, che viene assimilata agli enzimi di fase II per il suo effetto detossificante).

Meccanismi dell’induzione enzimatica

1. Induzione mediata da recettori intracellulari, denominati tipo Ah (Aromatic Hydrocarbon); questo recettore è un fattore di trascrizione capace di legare il DNA in una regione denominata XRE (Xenobiotic Responsive Element), che contiene i geni che codificano per diversi enzimi metabolizzanti. Il legame dell’induttore con il recettore Ah causa la sua dissociazione dalle HSPs e la traslocazione nel nucleo (mediata da una proteina chiamata ARNT, Ah Receptor Nuclear Translocation); il complesso induttore-Ah-ARNT si lega alla XRE modulazione della sintesi proteica.

• Gli induttori bifunzionali utilizzano questo meccanismo mediato dal recettore Ah

Meccanismo di induzione mediato dal recettore intracellulare Ah.

Alcuni isozimi CYP450 possono essere indotti in seguito all’attivazione di altri recettori intracellulari (PXR, Pregnane Xenobiotic Receptor)

• Gli induttori monofunzionali stimolano l’espressione genica indipendentemente dal recettore Ah. Il meccanismo di induzione dipende dalla presenza di centri elettrofili (che possono essere acquisiti con il metabolismo).

• Molte piante della famiglia delle Crucifere, in particolare il genere Brassica, sono induttori monofunzionali. Queste piante contengono glucosinati, i cui metaboliti (indoli, isotiocianati) sono induttori monofunzionali protezione dagli effetti genotossici di alcuni carcinogeni (IPA) negli animali da esperimento. Risultati contrastanti nell’uomo.

•Esistono altri meccanismi di induzione: ad es. aumenta la concentrazione epatica di CYP2E1, apparentemente tramite un rallentamento della sua degradazione.

Cinetica dell’induzione enzimatica• L’induzione richiede in genere l’esposizione

ripetuta all’induttore; l’effetto aumenta progressivamente.

• L’effetto di induttori che stimolano la sintesi degli enzimi si mantiene a lungo (giorni-settimane, dipende dal turn-over degli enzimi indotti) dopo la sospensione dell’esposizione, anche dopo che l’induttore è stato completamente eliminato dall’organismo.

Un farmaco induttore, il fenobarbital, causa la diminuzione della concentrazione plasmatica di un altro farmaco, il dicumarolo.

Notare che l’effetto del fenobarbital, dopo il primo periodo di trattamento, permane per circa 30 giorni

• Farmaci: aumento della velocità di inattivazione dell’induttore stesso (autoinduzione) e/o di altri farmaci, somministrati contemporaneamente diminuzione delle concentrazioni plasmatiche medie diminuzione dell’efficacia rischio di insuccesso terapeutico (es. autoinduzione degli antiepilettici; rifampicina-anticoncezionali; rifampicina-ciclosporina; iperico-inibitori proteasi virali ecc.)

Effetti dell’induzione enzimatica

Reproduced from: Reproduced from: TwumTwum--Barima Barima Y, Y, Carruthers Carruthers SG.SG. QuinidineQuinidine--rifampinrifampin interaction. interaction. NEJMNEJM 304:1466, 1981.304:1466, 1981.

Effetto dell’induttore enzimatico rifampicina sulle concentrazioni plasmatiche di chinidina.

• Tossici che agiscono con meccanismo specifico, mediato dall’interazione con recettori diminuzione della tossicità (es. riduzione della tossicità degli inibitori organofosforici dell’AChE).

• Composti attivati a metaboliti tossici (che agiscono con meccanismo non specifico) l’induzione può aumentare o diminuire la tossicità, in dipendenza dell’effetto complessivo dell’induttore sull’attività degli enzimi attivatori e degli enzimi detossificanti.

• Composti endogeni: aumento dell’eliminazione possibili stati

carenziali. Es., osteomalacia da antiepilettici per aumento della formazione del 25-idrossiderivato della vitamina D, inattivo.

possibile risposta omeostatica dell’organismo con conseguenze dannose. Es. aumento dell’eliminazione della tiroxina per aumento della sua coniugazione con acido glucuronico aumento dei livelli di TSH neoplasie follicolari (nel ratto).

Inibizione enzimatica

• Gli inibitori enzimatici agiscono diminuendo la trasformazione metabolica di altri xenobiotici da parte dell’enzima inibito, senza modificare la sintesi proteica*.

• Gli inibitori sono in genere più selettivi degli induttori poiché inibiscono solo un enzima (o un isozima) o isozimi strettamente correlati.

* gli inibitori della sintesi proteica (in generale) possono essere considerati inibitori enzimatici

• Esistono diversi meccanismi di inibizione: Inibitori reversibili: sono substrati dell’enzima ed

inibiscono quindi la metabolizzazione di altri composti per competizione (inibitori competitivi). Alcuni inibitori modificano l’attività catalitica dell’enzima legandosi a siti allosterici (inibitori non competitivi).

Inibitori irreversibili: sono in genere inibitori suicidi, che vengono trasformati dall’enzima in composti che si legano in modo covalente all’enzima, inattivandolo permanentemente.

Altri inibitori irreversibili non necessitano di attivazione da parte dell’enzima ma formano complessi inattivi con l’enzima (es. triacetiloleandomicina)

Meccanismo dell’inibizione suicida

• Inibizione delle reazioni di fase II per impoverimento dei cofattori.

Alcuni composti causano un impoverimento dei cofattori necessari alle reazioni di fase II. Ad es., alcune sulfoximine si coniugano con il glutatione riducendone i depositi tissutali inibizione della reazione di coniugazione con GSH.

• Cinetiche dell’inibizione enzimatica (inibitori reversibili)

L’inibizione si instaura immediatamente, in seguito alla prima somministrazione dell’inibitore.

L’inibizione scompare quando l’inibitore viene eliminato dall’organismo.

• Conseguenze dell’inibizione enzimaticaFarmaci: diminuzione dell’eliminazione

metabolica aumento della concentrazione plasmatica del farmaco ‘inibito’ possibile raggiungimento di livelli tossici (es. ketoconazolo-terfenadina).

Tossicità cardiaca (aritmie)

Effetto dell’inibitore enzimatico Ritonavir sulla concentrazione plasmatica di Saquinavir

Analogamente, gli inibitori aumentano la tossicità di sostanze tossiche di per sé (tossici ‘diretti’).

Nel caso di formazione di metaboliti reattivi tossici, l’inibizione enzimatica riduce la tossicità dovuta ai metaboliti. Es., gli inibitori del CYP2E1 (es. disulfiram) riducono la tossicità di CCl4 e paracetamolo.

Altri fattori che influenzano la capacità metabolica individuale

• Età: la capacità metabolica (in generale) è bassa alla nascita, aumenta fino ad un massimo nell’età adulta per poi decrescere in vecchiaia.

• Fattori patologici. Malattie epatiche (cirrosi, epatopatia alcolica, apatiti, epatomi): due effetti contrastanti: 1) diminuzione della capacità metabolizzante, soprattutto del metabolismo ossidativo (anche per alterazioni del flusso ematico); 2) ipoalbuminemia (l’albumina viene prodotta nel fegato) aumento della quota di farmaco non legata aumento della velocità del metabolismo. L’effetto globale dipende dall’entità del legame all’albumina e dal coefficiente di estrazione epatico effetto poco prevedibile.

• Dieta. Presenza di induttori (es. IPA da combustione,

Brassicacee ecc.) o inibitori (es. flavonoidi del succo di pompelmo).

Stati carenziali di minerali presenti negli enzimi (Fe, Cu, Zn) o che ne regolano l’attività (Ca, Mg).

Stati carenziali di vitamine (C, E, gruppo B): diminuzione di cofattori enzimatici; alterazione dello status energetico e redox delle cellule.