COLTURE CELLULARI

Popolazione omogenea di cellule singole più o meno aggregate traloro che si riproducono e si accrescono in substrato liquido o solido

Applicazioni colture cellulari:

- industriali- ricerca

morfologiabiochimicapatologiagenetica

Applicazioni industriali

Produzione di sostanze varie

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Vantaggi delle colture cellulari rispetto ai metoditradizionali di coltivazione:

- Indipendenza da fattori ambientali (clima, parassiti,terreno, ecc)

- sistema ben definito, dovuto all'omogeneità dellapopolazione (si evitano fluttuazioni nelle produzioni)

- migliore qualità e quantità nelle produzioni

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RICERCA

Morfologia: primo uso delle colture cellulari

- eventi morfologici differenziazione cellulare

- eventi morfologici formazione di organi

- eventi morfologici dedifferenzazione (sviluppo callo)

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Biochimica:

uso industriale delle colture cellulariper la produzione di sostanze

"metaboliti secondari" di alto valoreeconomico

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Patologia:

nell'eliminazione dei virus (colturein vitro) (meristema: assenza di virus)

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Genetica:

- variabilità genetica (somaclonal variation)(Colture in vitro) relazione alla instabilitàcariologica, numero cromosomico, aneuploidia

-variabilità genetica: individuazione di nuovi e positivi caratteri

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-ibridazione da fusione di protoplasti:

pianta ibrida spesso non fertile, superamento delle barriere di incompatibilitàsessuali (grosso ostacolo nel trasferimento di geni utili da genetipo a genotipo)

- trasferimento di DNA: trasformazione genetica

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Studio stress abiotici

Ruolo fondamentale delle colture cellulari:

Limiti:

- informazioni su processi biochimici-fisiologici-molecolari, ma meccanismi dirisposta allo stress dipendeno dalle funzioni estruttura dell'intera pianta (interazione cellula-cellula della struttura rigida della pianta èpersa, il turgore cellulare e altri meccanismifisici di risposta allo stress non possono esserevalutati)

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-composizione substrato colture cellularimolto diverso da quello in cui le radicicrescono normalmente

-se un carattere è definito a livello cellulare èessenziale che l'impatto di questo si trasmettaall'intera pianta, ereditato e trasferito allesuccessive generazioni

-fondamentale è quindi la rigenerazione dacellula a pianta

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Vantaggi:

-tutte le cellule sono esposte ad un uniforme potenziale idrico che può essere modificato per l'intera popolazione di cellule (stress idrico, salino)

-cellule sono uniformi nello sviluppo ed accrescimento => qualsiasi cambiamento biochimico-fisiologico dovuto a stress riguarderà tutte le cellule; mentre le piante sono popolazioni di cellule eterogenee, lo stress può influenzare solo parti di pianta (stress idrico, salino, metalli, freddo, caldo)

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-può essere facilmente valutata la relazione tra potenziale idrico e osmotico indipendentemente dall'interazione cellula-cellula che si ha nella pianta (stress idrico, salino)

sistema permette facilmente il dosaggio dello stress:

FREDDO - CALDO : si agisce sulla regolazione temperaturacamera di crescita (tutte le cellule saranno stressate)

IDRICO: uso di agenti osmotici da aggiungere al sustrato:glicerolo: penetra nella cellulamannitolo: penetra solo la parete cellularePEG: non penetra(diminuisce disponibilità acqua intra-extracellulare)

SALINO- METALLI: somministrazione diretta nel substrato c o r sformazione GenHORT

Ottenimento colture cellulari

CALLO

-Essenziale passare da questo stadio

Che cos’è?

-E' essenzialmente tessuto indifferenziato capacepiù o meno di proliferazione indefinita quandoporzioni dello stesso sono propagate a intervalliregolari su substrato fresco in condizioni di sterilità

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Come si ottiene?

-Teoricamente da qualsiasi parte di pianta, è comunque preferibile tessuto giovane (foglie a quadrato, stelo capovolto), messa su un particolare substrato solido al buio (bianco-giallino) o alla luce (giallo-verdino)

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-Il sito di inizio della crescita, proliferazione, è la superficie tagliata => massimizzare la superficie di contatto col substrato

-Microscopicamente un tipico callo si presenta con grossi vacuoli, sottile strato di citoplasma, nucleo pressato contro la parete

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Continue subcolture:

-perdita o riduzione organogenesi e embriogenesi, correlato cambiamento di ploidia (predominano poliploidi ed aneuploidi), cambiamento di natura fisiologica ma nongenetica

-comparsa di tessuto con tessitura diversa ⇒ aumenta la friabilità (utile per ottenere cellule, non per organogenesi)

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Per ottenere le colture cellulari:

-ottenuto il callo, subclonarlo molti cicli (5-10 volte) per avere callo friabile

-si sfrantuma il callo friabile in un mezzo liquido ⇒ si ottengono cellule più o meno aggregate, poche singole

-in agitazione continua al buio, 25-28ｰC

- diversi cicli per stabilizzazione coltura: inizio coltura crescita lenta, spesso non partono, degenerazione, poi crescita rapida e stabilizzata

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Per le piante in natura tre fonti di nutrizione:

- nutrienti minerali, dal suolo via radici- CO2 atmosferica per la fotosintesi, fonte dicarbonio- prodotti della fissazione di C e minerali =>sostanze di riserva, ormoni, vitamine ecc.

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Per le colture in vitro stesse richieste:calli (solido) e cellule (liquido)

-per le colture cellulari: no luce, no CO2 -somministrazione esogena di nutrienti

minerali, nutrienti organici, vitamine, ormoni

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NUTRIENTI MINERALI: MS 4.7 g/lNUTRIENTI ORGANICI: Saccarosio 30 g/lVitamine: tiamina 9.9 mg/l

piridossina 9.5 mg/lAc.nicotinico4.5 mg/l

ESTRATTI NATURALI: come supplementi(acqua di cocco, estratto di lievito, estratto di malto,caseina idrolizzata, succo di arancia e di pomodoro,aminoacidi: caseina idrol. 2.0 g/lORMONI (specificità del substrato):

2,4 D 5.0 mg/ldopo autoclave

Kinetina 1.0 mg/lAgar(solido) 8.0 g/l

pH 5.8 con HCl

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Citochinine: KinetinaBenzil-aminopurina (BAP)

- Molto attive sulle colture cellulari

stimolano continua crescita e divisione cellulare

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Auxine: Acido indol-acetico (IIA)Acido dicloro fenolacetico (2,4 D)Acido naftalenacetico (NAA)

-stimolano:

divisione cellulareallungamento cellularedifferenziamento

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FASI CICLO CELLULARE

-Singola popolazione è omogenea (stesso substrato, origine, condizioni di crescita, trattamento, ecc.);

- ma differenze in: misura, struttura-aggregazione, forma, cariotipo tra le cellule => eterogeneità spaziale

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Eterogeneità temporale:

analisi ciclo colturale (7-10 giorni):

1 - Lag-fase: subito dopo trasferimento (diluizione) cellule su substrato fresco: cambiamento metabolico che prepara le cellule alla divisione; incrementa livello di: NADPH, ATP, RNA cellulare, proteine totali

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2 - Esponenziale o lineare:

fase di intensa divisione cellulare =>rapido aumento del numero di cellule, diminuzione dei nutrienti, sintesi di metaboliti primari

diluizione cellulare (più diluite, maggior substrato fresco, => maggiore sarà la divisione

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3 - Stazionaria:

diminuzione fino alla cessazione divisione cellulare, diminiusce metabolismo in genere, fenomeno di affamamento (scarsa disponibilità di nutrienti), differenziazione, produzione di metaboliti secondari

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MANTENIMENTO COLTURA

Agitazione 100-120 rpm, al buio (12 ore di sopravvivenza)

Temperatura 26-28ｰC costante

Beute da 100ml (20) - 250ml (50) sterili con tappo cotone più alluminio

Subcoltura: 7-10 giorni: 1:1 fino a 1:4

Filtrazione: uso di siringhe, filtri

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Controllo sterilità:- colore- pH- odore- chiarezza menisco- vetrino microscopio- crescita su brodo colturale

Controllo vitalità: uso di fluoresceina diacetato(50mg/ml acetone)1:1 con la coltura cellulare

Misura crescita (curva di crescita):P.C.V.Peso secco (o fresco)Misura corda

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