85° CONVEGNO SIBS LA BIOLOGIA SPERIMENTALE · microtubuli e conseguentemente il periodo di...

SIBS – SOCIETA’ ITALIANA DI BIOLOGIA SPERIMENTALE

85° CONVEGNO SIBS

LA BIOLOGIA SPERIMENTALE:

DALLE MOLECOLE ALL’ORGANISMO

Aula Magna dell’Università di Parma

29 - 30 novembre 2012

2 |

Con il patrocinio di:

Università degli studi di Parma

Accademia ligure di scienze e lettere

Museo di storia naturale di Parma

Provincia di Parma

Comune di Parma

Si ringraziano:

Stardea S.r.l.

Physik Instrumente (PI) S.r.l.

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PRESIDENTE NAZIONALE

Emma Rabino Massa –Università degli studi di Torino

VICE PRESIDENTE

Proto Pippia – Università degli studi di Sassari

SEGRETARIO NAZIONALE

Giovanni Pizzuti – Università degli studi di Napoli Federico II

COMITATO ORGANIZZATORE

M. G. Bridelli - Università degli studi di Parma

R. Antolini - Università degli studi di Trento

M. Cocchi - Università degli studi di Bologna

M. A. Dessì - Università degli studi di Cagliari

L. Pane - Università degli studi di Genova

P. Pippia - Università degli studi di Sassari

G. Pizzuti - Università degli studi di Napoli Federico II

E. Rabino Massa - Università degli studi di Torino

COMITATO SCIENTIFICO

M. G. Bridelli

S. De Iasio

M. Miragoli

E. Polverini

M. Zaniboni

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Sommario

LETTURA MAGISTRALE “GAETANO QUAGLIARIELLO” ....................................... 7

Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione sociale ........................................ 7

COMUNICAZIONI ORALI .................................................................................................. 9

Sindrome metabolica .................................................................................................................... 11

Simmetrie e rotture di simmetrie tra biologia molecolare, disturbi dell’umore ed emergentismo

personalistico. ................................................................................................................................... 11

Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano ........................................................... 13

Sindrome metabolica ........................................................................................................................ 13

Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of ultrasonography.............................. 17

Fisiologia cardiaca ........................................................................................................................ 19

A protocol which combines current – and voltage-clamp provides a novel useful three-dimensional

representation of the cardiac action potential ................................................................................. 19

Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under modulation of two different

pacemaker mechanisms ................................................................................................................... 20

Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular arrhythmias in the normal heart .... 23

Antropologia ed evoluzione molecolare ........................................................................................ 25

Complementarietà di spettroscopia FT-IR ed analisi istologiche per lo studio del degrado della

pelle mummificata. ........................................................................................................................... 25

Stature estimation using mandibular morphometric parameters in Italian population: a

preliminary report............................................................................................................................. 26

Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane a diverso grado di isolamento ............ 28

Ancient DNA studies: new perspectives on old samples .................................................................. 28

Mine, yours, ours? sharing data on human genetic variation .......................................................... 29

Metodologie e tecniche della biologia sperimentale...................................................................... 30

Light regulated enzyme activities ..................................................................................................... 30

Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric analysis with scanning ion

conductance microscopy .................................................................................................................. 30

Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein science; retinoid-binding

proteins as an example ..................................................................................................................... 32

Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for environmental remediation .................. 33

A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-resolution microscopy ............ 35

Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by means of molecular dynamics

simulations ........................................................................................................................................ 36

Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by site-directed mutagenesis ....... 37

Aspetti non-algoritmici della biologia quantistica ............................................................................ 37

Verso un modello generale della dinamica del citoscheletro ........................................................... 39

Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di malta ................................................... 41

| 5

POSTER .............................................................................................................................. 44

P01-Qualitative comparision of olive oil mediterranean ................................................................. 44

P02-The control of abstinence in the treatment of alcohol dependence: the use of acamprosate in

relapse prevention. .......................................................................................................................... 45 P03-Relationship between maximal fat oxidation and oxygen uptake: comparison between patients

with type 2 diabetes and healthy sedentary subjects. ....................................................................... 47 P04-The influence of hypocaloric diet, associated with moderate physical activity and CBT

(cognitive behavioral therapy), on self-esteem and self-efficacy and their modulator role on

emotional eating. .............................................................................................................................. 49

P05-Cellular drug delivery system based on vaterite particles ....................................................... 50

P06-Modelli biologici di stress ossidativo per lo studio delle proprietà antiossidanti del carciofo . 50 P07-Cardiac regeneration by pharmacologically active microcarriers releasing growth factors

and/or transporting adipose-derived stem cells ................................................................................ 52

P08-Micro-Raman mapping of bio-carbonates and polyenic pigments in corals and shells ........... 54

P09-La popolazione del vergante attraverso lo studio dei cognomi ................................................ 55

P10-Ricerche sulla popolazione di Giaglione (TO) in epoca preunitaria .......................................... 56

P11-Distribution and phylogeny/distance-trees of prokaryotic photoreactive domains ................ 58

P12-Biomarcatori per la diagnosi precoce del tumore al polmone ................................................. 58

P13-Comparative analysis of cytotoxic effects INDUCED BY N4-ethylmorpholine

citronellalthiosemicabazone complexes in different human cancer cell lines ................................ 60

P14-Effetti citotossici degli ossidi di cobalto e di titanio su cellule A549. ....................................... 62

P15-Enzimatic biomarkers in the gilthead seabream juveniles fed with graded concentrations of

alchylphenols ................................................................................................................................... 63

P16-Hepatic activities in Sparus Aurata L. juveniles fed with bisphenol A enriched diet. ............... 64

P17-K:D-Rib un inibitore della proliferazione delle cellule tumorali ed un promotore del folding di

DNAzima. ......................................................................................................................................... 65

P18-Contenuto e mappa di distribuzione del magnesio intracellulare in cellule farmaco-resistenti e

-sensibili ........................................................................................................................................... 66

P19-Modificazioni del contenuto intracellulare di magnesio durante l’apoptosi mitocondrio-

mediata: studi degli eventi precoci correlati al potenziale mitocondriale....................................... 68

P20-Valutazione dell’efflusso di magnesio indotto da cAMP in cellule HL60 mediante un nuovo

chemosensore fluorescente derivato dall’8-idrossichinolina .......................................................... 69

P21-Nuove prospettive nella determinazione del magnesio intracellulare ..................................... 70

P22-La carenza di magnesio inibisce la progressione del ciclo cellulare in cellule di osteosarcoma

umano .............................................................................................................................................. 71

P23-Behavior of classical and non-classical soluble HLA class I molecules in patients with chronic

hepatitis C virus infection before and after pegylated interferon and ribavirin treatment: potential

role as markers of immune activation and response to antiviral treatment. .................................. 72

| 7

LETTURA MAGISTRALE “Gaetano Quagliariello”

Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione

sociale

Leonardo Fogassi

Dipartimento di Neuroscienze, Università di Parma

Nella concezione classica si considerava che le funzioni cognitive fossero il risultato di un livello

superiore di elaborazione sensoriale, lasciando alla corteccia motoria un ruolo prevalentemente

esecutivo. Gli studi neuroanatomici e neurofisiologici delle ultime due decadi hanno rivoluzionato

questo concetto, portando al riconoscimento che dal sistema motorio possano emergere numerose

capacità cognitive. Un ottimo esempio di tali capacità è il sistema dei neuroni mirror, originariamente

scoperti nella corteccia premotoria della scimmia. Questi neuroni si attivano sia quando una scimmia

esegue un atto motorio finalizzato (ad esempio afferrare un oggetto) sia quando osservano un altro

individuo svolgere lo stesso atto. Tale funzione è resa possibile dal fatto che la corteccia motoria

contiene le rappresentazioni degli atti motori contenuti nel repertorio della specie. Confrontando

quindi l’atto svolto da un altro individuo con la rappresentazione motoria dello stesso atto è possibile

comprendere automaticamente lo scopo del comportamento altrui. Se nella scimmia la comprensione

degli atti altrui è probabilmente la funzione preminente del sistema mirror, nell’uomo un sistema

omologo, dimostrato nella corteccia parieto-frontale, sottostà verosimilmente a svariate funzioni

sociali. Tra le funzioni proposte vi sono l’imitazione, la comprensione dell’intenzione altrui, la

comprensione del linguaggio e l’empatia. Numerosi studi ormai hanno dimostrato la presenza del

sistema mirror nell’uomo e il suo coinvolgimento nelle funzioni suddette. Per il futuro, tre nuovi

sviluppi della ricerca su tale sistema neuronale sembrano essere promettenti. Uno è l’investigazione di

come la funzione di “rispecchiamento” si sviluppi nel bambino e quale ne possa essere il ruolo. Studi

comportamentali, neurofisiologici e di neuroimmagine suggeriscono che il sistema mirror sia già

presente precocemente nell’ontogenesi e abbia un ruolo importante nello sviluppo della comprensione

dell’azione e, verosimilmente, nell’intersoggettività. Un secondo sviluppo riguarda lo studio delle

sindromi che possono coinvolgere il sistema mirror, quali, ad esempio, l’autismo. Negli ultimi anni

svariati lavori convergono nel proporre che un’anomalia nell’organizzazione del sistema mirror o del

sistema motorio ad esso soggiacente, possano spiegare alcuni degli aspetti sociali di tale sindrome. Il

terzo sviluppo rappresenta la possibilità di utilizzare le proprietà del sistema mirror per riabilitare

adulti e bambini con deficit motori, basandosi su terapie osservazionali. Alcuni studi di questi ultimi

anni sembrano suggerire un effetto positivo di queste terapie, in parallelo a modificazioni plastiche

delle aree contenenti il sistema mirror.

COMUNICAZIONI ORALI

| 11

Sindrome metabolica

Simmetrie e rotture di simmetrie tra biologia molecolare, disturbi

dell’umore ed emergentismo personalistico. 1,2

M. Cocchi, 1F. Gabrielli

1Istituto “Paolo Sotgiu” per la ricerca in Psichiatria e Cardiologia Quantitativa e Quantistica

2Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie

Il ruolo della membrana cellulare (neurone e piastrina)

La membrana delle cellule del cervello sembra offrire una via promettente verso una migliore

comprensione della psicopatologia nei suoi differenti aspetti: Depressione Maggiore, Disturbo

Bipolare e le loro conseguenze sul deficit cognitivo. Diversi approcci hanno fornito elementi di prova

a proposito di quest’argomento. In particolare, un'ampia letteratura scientifica supporta il

suggerimento del gruppo di Rasenick, cioè, che le piastrine umane servano come marcatori biologici

per la depressione.

Altri autori, vale a dire Cocchi e Tonello (1, 2, 3) hanno studiato le membrane delle piastrine di

soggetti depressi, evidenziando i profili degli acidi grassi come possibile misura dello stato di

membrana.

In particolare, hanno confrontato il profilo delle piastrine degli acidi grassi di membrana di un gruppo

di soggetti clinicamente depressi contro un gruppo di soggetti sani. I risultati ottenuti con l’impiego di

una Rete Neurale Artificiale, nei due gruppi, hanno evidenziato la possibilità di classificare i Disordini

dell’Umore dalla cosiddetta normalità e, all’interno dei Disordini dell’Umore, di distinguere i soggetti

con Depressione Maggiore da quelli con Disordine Bipolare. I risultati, inoltre, degli esperimenti degli

autori sembrano molto coerenti con quelli ottenuti sulle proteine-G e sulle zattere lipidiche di

membrana delineati dal gruppo di Rasenick.

La membrana cellulare vive, dunque, in una costante condizione di mobilità e, quando le oscillazioni

degli acidi grassi varcano gli intervalli di tolleranza della membrana, possono essere espressi

fenomeni patologici.

“The mechanical factors of membrane lipids constitute lipid dependent factors that can dramatically

affect protein functions or protein-protein interactions (4). In realtà la costante condizione di mobilità

della membrana, sia per livelli fisiologici sia sconfinando in conseguenze patologiche, si traduce in

una deformazione della stessa a diversi livelli d’intensità con conseguenze che coinvolgono il raft

lipidico di membrana, la proteina Gsα e il citoscheletro (5).

Adhesion between membrane and cytoskeleton is influenced by a number of factors, including the

lipid composition, cytoskeleton density and distribution, membrane surface area–to-volume ratio, and

internal cellular pressure (6).

In letteratura sono state ampiamente descritte le risposte alle modificazioni indotte sul citoscheletro da

forze di tipo meccanico (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) esercitate sulla membrana.

Tutte le conoscenze acquisite, lo studio delle ipotesi quantistiche della coscienza, l’opportunità del

dialogo che si è aperto all’interno del Quantum Paradigm Psychopathology Group (QPP), tutto questo

ha certamente contribuito alla costruzione di un nuovo tentativo d’ipotesi che parrebbe potere

conciliare quelle precedenti le quali, in realtà, sono solamente frutto di modi diversi di guardare allo

stesso fenomeno.

Lo stato di continuo rinnovo e scambio di acidi grassi da parte della membrana con conseguente

deformazione del bilayer lipidico, può essere pensato nei termini di una forza meccanica, sia in

condizioni fisiologiche sia patologiche, che si esercita sul citoscheletro con carattere di continuità

consentendo, quando sussistano condizioni fisiologiche per la membrana, periodi di decoerenza dei

microtubuli (500ms), che danno origine alla manifestazione cosciente che si tradurrà in coscienza

12 |

classica, neurocorrelata.

Il problema che si pone è di comprendere come, nelle diverse condizioni dei disordini dell’umore, la

decoerenza possa modificarsi allungando o accorciando il periodo (< o > di 500ms).

Avendo avuto la possibilità di comprendere che una maggiore mobilità della membrana caratterizza

la DM e una minore il DB, si è percepito che esistono condizioni patologiche di deformazione della

membrana che possono esercitare differenti forze meccaniche sul citoscheletro dall’interno della

stessa membrana e che potrebbero compromettere il fisiologico fenomeno di superposition dei

microtubuli e conseguentemente il periodo di oscillazione.

Nel caso del DB ci sarebbe un accorciamento del periodo di decoerenza mentre nel caso della DM un

allungamento.

A questa eventualità potrebbero corrispondere, in casi di estrema criticità dei tempi di decoerenza,

profonde e decisive modificazioni dello stato cosciente.

Avendo dimostrato che fra DM e DB esiste una rottura di simmetria, tenendo sempre presenti le

caratteristiche di mobilità della membrana, che esiste un”domain wall” governata da forze

elettromagnetiche che sono verosimilmente l’unica forma di comunicazione fra i due fenomeni (DM e

DB) e che l’unica cosa, pertanto, che può accumunare le due condizioni è il suicidio, sembra coerente

pensare che tal evento possa realizzarsi per condizioni critiche dell’allungamento o accorciamento

dei periodi di decoerenza, quindi della capacità di coscienza.

Questa forza, che nel caso del neurone potrebbe essere definita “neuromeccanica”,

rappresenterebbe, di fatto, l’elemento condizionante la cabina di regia dei microtubuli e

condizionante il loro rapporto di criticità con le sinapsi, la corteccia e la serotonina (15).

L’accostamento ai processi di coscienza, nelle loro dinamiche normali e patologiche, non puó,

tuttavia, fissarsi su elementi e piani isolati, osservabili da un osservatore privilegiato e distaccato,

bensì pensando, e agendo operativamente, per connessioni, relazioni, reti. Il tutto, sempre nella

convinzione che la scienza è narrazione di un mondo espressivo di stati emergenti - per questo mai

riducibile alla semplice somma dei suoi ingredienti elementari - e in cui le rotture di simmetria

garantiscono molteplicità, creatività, vitalità, nel segno dell’autorganizzazione naturale, dell’evolversi

dei sistemi, grazie alle rotture spontanee di simmetrie, verso stati vieppiú complessi e imprevedibili,

tra cui la persona come relazione emergente.

Bibliografia

1. Cocchi M, Tonello L (2010). Bio molecular considerations in Major Depression and Ischemic Cardiovascular Disease.

Central Nervous System Agents in Medicinal Chemistry.10: 2, 97-107.

2. Cocchi M, Tonello L, Rasenick Mark M (2010) Human depression: a new approach in quantitative psychiatry. Annals of

General Psychiatry. 9:25.

3. Tonello L, Cocchi M. (2010). The Cell Membrane: Is it a Bridge from Psychiatry to Quantum Consciousness?

NeuroQuantology. 8: 1, 54-60.

4. McIntosh TJ, Simon SA (2006) Roles of bilayer material properties in function and distribution of membrane proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36:177–98.

5. Cocchi M, Gabrielli F, Tonello L, Pregnolato M (2010) The Interactome Hypothesis of Depression. NeuroQuantology, 4:

603-613).

6. Sheetz MP, Sable JE and Döbereiner HG (2006) Continuous Membrane-Cytoskeleton Adhesion Requires Continuous

Accommodation to Lipid and Cytoskeleton Dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35:417–34.

7. Chifflet S and Hernandez JA (2011) The PlasmaMembrane Potential and the Organization of the Actin Cytoskeleton of Epithelial Cells, International Journal of Cell Biology Volume 2012 Article ID 121424, 13 pages, doi:10.1155/2012/121424.

8. Sun M, Northup N, Marga F, Huber T, Byfiel dFJ, Levitan I and Forgacs G (2007) The effect of cellular cholesterol on

membrane cytoskeleton adhesion, J Cell Sci 120: 2223-31. 9. Yap B, Kamm RD (2005) Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow

channels. J Appl Physiol 99: 2323–2330.

10. Hoover RL, Fujiwara K, Klausner RD, Bhalla DK, Tucker R, Karnovsky MJ (1981) Effects of Free Fatty Acids on the Organization of Cytoskeletal Elements in Lymphocytes, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY 10: 939-948.

11. Apodaca G (2002) Modulation of membrane traffic by mechanical stimuli. AJP-Renal Physiol 282: F179-F190.

12. Namikoshi M, Suzuki S, Meguro S, Kobayashi H, Mine Y and Kasuga I (2002) Inhibitors of Microtubule Assembly Produced by the Marine Fungus Strain TUF 98F139 Collected in Palau. Journal of Tokyo University of Fisheries 88: 1-6.

13. Janmey P. (1995) Cell Membranes and the Cytoskeleton, Chapter 17, Handbook of Biological Physics, Volume 1, edited

by R. Lipowsky and E. Sackmann, Elsevier Science B.V. 14. Janmey PA, and McCulloch CA (2007) Cell Mechanics: Integrating Cell Responses to Mechanical Stimuli, Annu. Rev.

Biomed. Eng 9:1–34.

| 13

15. Cocchi M, Tonello L, Gabrielli F, Pregnolato M. & Pessa E. (2011). Quantum Human & Animal Consciousness: A

Concept Embracing Philosophy, Quantitative Molecular Biology & Mathematics. Journal of Consciousness Exploration &

Research, 2: 547-574).

Corresponding Author: Massimo Cocchi e-mail [email protected]

Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano

Marianna Rinaldi (1)

, Giuseppe Graffi (2)

, Salvatore Gallone (3)

, Emma Rabino Massa.(1)

(1) Laboratorio di Antropologia, Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo, Università degli

Studi di Torino, Via Accademia Albertina 13, 10123 Torino, (2)

ASL TO3, Distretto di Susa, piazza

San Francesco 4, 10059, Susa (TO), (3)

Laboratorio di Neurogenetica, Dipartimento di Neuroscienze,

Via Cherasco 15, 10126 Torino.

La Sindrome Metabolica (MetS) è un insieme di alterazioni ognuna delle quali rappresenta di per sé

un fattore di rischio cardiovascolare (obesità di tipo centrale, iperglicemia, dislipidemia ed

ipertensione). In diversi studi recenti la MetS è stata correlata ad un accelerato declino cognitivo in età

senile. Il nostro studio si è proposto di analizzare la relazione tra MetS e performance cognitiva in un

gruppo di anziani appartenenti ad alcune comunità rurali della Val Cenischia (Piemonte).

È stato reclutato un campione di 199 persone (111 donne e 88 uomini) di età superiore ai 60 anni in

cui è stata valutata la presenza di MetS secondo i criteri diagnostici previsti dal NCEP ATP III

aggiornato (2004). Inoltre ad ogni paziente è stato somministrato il Mini Mental State Examination

(MMSE) per valutarne lo stato cognitivo.

La prevalenza della MetS nel campione esaminato è pari al 50,3% (donne: 49,5%; uomini: 51,3%). I

dati relativi al MMSE rivelano un declino cognitivo nel 10,1% del campione (MMSE 23,9). Il 6,6%

del campione presenta risultati borderline (MMSE tra 24,0 e 24,9), mentre l’83,3% ottiene un

punteggio normale (MMSE 25,0).

I risultati confermano il legame esistente tra sindrome metabolica e peggiori performance cognitive

nell’anziano in quanto dall’elaborazione dei dati emerge che esiste una associazione significativa tra

punteggi borderline al test MMSE e presenza di sindrome metabolica (OR=3,78; IC95%: 1,0-14,3).

La ricerca ha ricevuto l’approvazione del Comitato di Bioetica d’Ateneo dell’Università di Torino.

Corresponding Author: Marianna Rinaldi e-mail [email protected]

Sindrome metabolica

Massimo Gualerzi (Fondazione Don Gnocchi – Parma)

Il termine “sindrome metabolica” descrive un insieme di fattori di rischio metabolici che aumentano la

possibilità di sviluppare malattie cardiache, ictus e diabete. La causa della sindrome metabolica risiede

principalmente nelle cattive abitudini di vitacee a loro volta conducono all’affermarsi di quelle

condizioni che determineranno la sindrome stessa come l’ipertensione la dislipidemia l’obesita e il

diabete. Tra i fattori acquisiti predisponesti quello di maggiore interesse è presenza di una eccessiva

quantità di grasso corporeo, specie a livello dell’addome, determinata dalle cattive abitudini alimentari

e dallo scarso esercizio fisico.

La sindrome metabolica viene diagnosticata quando sono presenti tre o più dei seguenti fattori di

rischio:

mailto:[email protected]


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elevata quantità di tessuto adiposo addominale (valutata mediante la misurazione della

circonferenza della vita): sono considerati patologici valori superiori a 94 cm nell’ uomo e

superiori a 80 cm nella donna)

basso colesterolo HDL (il cosiddetto “colesterolo buono”): meno di 40 mg/dl nell’uomo e meno

di 50 mg/dL nella donna)

elevati livelli di trigliceridi: valori superiori a 150 mg/dL

elevati valori di pressione arteriosa: superiore a 135/85 mmHg o qualora sia già in corso una

terapia antipertensiva)

elevati livelli di glicemia: glicemia a digiuno superiore a 100 mg/dL.

La presenza di tre o più di questi fattori di rischio è un segno che l’organismo è resistente all’azione

dell’ insulina, un importante ormone prodotto dal pancreas. Quando è presente una condizione di

resistenza all’insulina è necessaria una quantità di insulina maggiore rispetto alla norma per mantenere

normali livelli di glicemia. Il riscontro di valori elevati di insulina nel sangue a fronte di valori normali

di glicemia rappresenta un indice indiretto di tale condizione.

Chi corre il rischio di sviluppare la sindrome metabolica?

La sindrome metabolica è molto frequente nella popolazione, e il rischio di sviluppare la sindrome

cresce con l’aumentare dell’età.

Una persona può considerarsi a rischio per lo sviluppo della sindrome metabolica se non svolge

attività fisica e se:

-è aumentato di peso, specie a livello della circonferenza della vita (questa semplice misurazione è un

indice di eccessiva espansione del tessuto adiposo viscerale, quello, cioè, che si trova all’interno

dell’addome e circonda i visceri)

-ha una storia di diabete

-ha elevati livelli di trigliceridi nel sangue

-ha elevati valori di pressione arteriosa

La maggior parte delle persone che ha la sindrome metabolica si sente bene e frequentemente non

presenta sintomi; tuttavia queste persone hanno un rischio maggiore di sviluppare in futuro malattie

gravi come diabete e patologie cardiovascolari, soprattutto in presenza di familiarità positiva e sono

chiamate quindi a modificare fortemente le proprie abitudini alimentari e iniziare un trattamento.

Come si cura la sindrome metabolica?

Il modo migliore per curare la sindrome metabolica è aumentare l’attività fisica e ridurre il peso

corporeo; è oggi inoltre possibile agire associando alla dieta nutraceutici, prodotti che, sfruttando

l’effetto, noto, di alcune componenti naturali, agiscono in modo deciso e sostanziale in associazione

alla modifica dello stile di vita nel ridurre il rischio e nel riequilibrare le alterazioni biochimiche

presenti. Stiamo parlando principalmente degli Omega 3 e del riso rosso fermentato Monascus

purpureus come elementi in grado di sfiammare, ridurre i trigliceridi il colesterolo e quindi di ridurre

notevolmente il rischio cardiometabolico.

Conclusioni

Ricordare che la perdita di peso e l’attività fisica sono le armi migliori per prevenire e trattare la

sindrome metabolica; è importante sapere se si è affetti o meno dalla sindrome metabolica per poter

mettere in atto cambiamenti nello stile e iniziare ad assumere adiuvanti nutraceutici prima che

compaiano severe complicazioni.

Corresponding Author: Massimo Gualerzi Specialista in Cardiologia, U.O. Prevenzione e Riabilitazione Cardiovascolare,

Fondazione Don Gnocchi – Parma

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Synthesis and antimicrobial activity of new 1-R-3-(2-PIRiDYL)- 4-

nitroso- 5-carboxiethyl-1H-pyrazoles.

S. Aielloa , C. Massimo Maida

b, F. Venturella

b, D. Planeta,

cM. Giammanco

d, M.Milici

b

a Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo

bDipartimento di Scienze per la Promozione della Salute

G. D’ Alessandro, Università degli Studi di

Palermo, cDipartimento dei Sistemi Agro-Abientali, Università degli Studi di Palermo,

dDipartimednto

di Studi Giuridici, Economici, Biomedici e Psicosociopedagogici delle Scienze Motorie e Sportive,

Università degli Studi di Palermo

In recent years, epidemiological studies confirm the significant impact on human health by infections

caused by pathogenic fungi. In fact, although the Candida genus is commensal and a constituent of the

normal gut flora, it is responsible for opportunistic infections and can become pathogenic secondary to

predisposing factors related to the host, like a comprimised immune system (AIDS, anti-cancer

therapy, transplants), excessive prophylaxis with antimicrobial agents, and use of invasive catheters.

Large-scale surveillance for fungal infections has demonstrated an increasing incidence of drug-

resistant fungal pathogens. As a matter of fact, a significant number of fungi species (especially

Candida glabrata and Candida krusei) exhibited primary resistance to Fluconazole or were less

susceptible to Amphotericin B.

Furthermore, as a consequence of the toxicity of the currently used polyene antifungal drugs, which

leads to interrupt the therapy, and the emergence of Candida species resistance to azole-based agents,

there is an urgent need for developing alternative drug therapies.

In our previous study we have disclosed the synthesis and antifungal activity of a series of 4-

nitrosopyrazoles that mainly displayed in vitro potent antifungal activity at no cytotoxic

concentrations and that some of these compounds were 4 times more potent than Amphotericine B

and Fluconazole respectively against Cryptococcus neoformans and Candida Krusei [1-4]

As part of our Structure Activity Relationships studies, we were interested in learning the influence of

the steric and electronic effects of the substituent in position 5 of the 4-nitrosopyrazoles which had

already showed powerful antimycotic activity.

Therefore, we synthetized title compounds and evaluated their antimycotic activity (fig1).

Fig 1. Synthetized compoundsN

NN

COOC2H5ON

R

R: a=H, b= CH3, c=C2H5

The 5-carboxiethylester group has made the antimycotic actity dramatically decay, confirming the

necessity, for a good antimicotic activity, of derivatives in which the position 5 is free or substituted

with little groups as a methyl shown the best antifungal activity.

Bibliography

[1] E. Aiello, S. Aiello, F. Mingoia, A. Bacchi, G. Pelizzi, C. Musiu, M. G. Setzu, A. Pani, P. La Colla and M. E. Marongiu.

Synthesis and Antimicrobial activity of New 3-(1-R -3-methyl-4-nitroso-1H-5-pyrazolyl)-5-methylisoxazole derivatives,

Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2000, 8, 2719-2728

[2] Stefania Aiello; Enrico Aiello, Marica Orioli, Marina Carini, 3-(1-R-3-methyl-4-nitroso-1H-5-pyrazolyl)-5-

methylisoxazoles: a new class of antifungal compounds. In vitro metabolism by rat liver:LC and LC-MS studies. Convegno

Nazionale, Sorrento 18-22 Settembre 2002.

[3] S. Aiello, E. Aiello and M. Milici: “Synthesis and Antifungal Activity of new 3(5)-methyl-5(3)-(2-thiophenyl) and -(2-

quinolyl)-1H-1-R-4-nitrosopyrazoles.Part V”. Polish-Austrian-German-Hungarian-Italian Joint Meeting on Medicinal

Chemistry, Krakow, October 15-18, 2003

[4] Stefania Aiello, Antonio Macchiarulo, Maria Milici and Enrico Aiello, Sintesi e studi QSAR di nuovi derivati 3(5)-(2-X)-

1R-1H-4-nitrosopirazoli: una classe di composti con potente attività antifungina in vitro. Parte VI XVII Convegno Nazionale

16 |

della Divisione di Chimica Farmaceutica della SCI, Pisa 6-10 settembre 2004.

Corresponding author: Stefania Aiello, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli

Studi di Palermo, Via Archirafi 32, 90123 Palermo, Italy; tel:+39.091 23896802; email: [email protected]

From the role of intestine in metabolic syndrome to neurological

diseases. A think of the past .

P.Mainardi, M. Mainardi and P.Striano (DINOGMI Università di Genova)

Metabolic syndrome (MS) could be defined as a combination of symptoms that are increasing the risk

of cardiovascular pathologies and diabetes. Several metabolic aspects, as obesity, insulin resistance,

hypertension, dyslipidemia, are considered to make a diagnosis, they put in evidence an altered food

metabolism.

The incidence of MS is about 25% of total population and it is reported to increase with aging. Often

the diet is unable to treat symptoms and to reestablish a correct metabolic response. Intestinal flora is

reported to play a role in the pathogenic mechanisms of MS1, this is supported by the elevated

incidence of MS in patients with inflammatory bowel diseases or ulcerative colitis, moreover if they

have an insulin resistance, too.

Recently a decreasing in toll like receptors-5 (TLR-5) has been reported in MS, these receptors play a

control role of intestinal flora. The lacking of this control function allow to understand why the diets

are inefficacy. In fact, even if in standard diet, TLR-5 deficient mice increase adiposity, while

develop hallmark features of metabolic syndrome, including hyperlipidemia, hypertension, insulin

resistance, too2.

On the other hand, TLR-2 deficient mice exhibit sub-clinical inflammation, insulin resistance,

glucose intolerance and obesity3.

Other than TLR, peroxisomes are involved in glucose metabolism, insulin resistance and obesity,

too4,5

. Drugs modulating the peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) are able to decrease

insulin resistance and improve related sympotms .

It is interessant to note as TLRs are involved in neurodegeneration process6, as well as a decreasing in

peroxisomes can lead to severe neurological disorders7.

These common factors between MS and neurological disorders allow us to reevaluate the role of

intestine, that until ‘30s was considered to play a pivot role in the pathogenic mechanisms of

neurological disorders. In fact, in 20s epilepsy, depression and schizophrenia are included in

metabolic disorders, together with diabetes and gout.

Confirming the role of intestine, in neurological diseases is reported an elevated incidence of insulin

resistance, an elevated glucose response and often neurological patients report intestinal diseases,

too8, 9,10

.

Ketogenic diet (KD) is reported to be able to improve several neurological symptoms, this could be

linked to its intestinal prebiotic effect11

. Also Curcumin shows to be a neuroprotective agent, in fact, it

has been reported it freely cross from blood to brain, but Curcumin is not even absorbed from

intestine. Curcumin has an anti-inflammatory and anti-bacterial intestinal action12

. Furthermore,

curcumin inhibits gluconeogenesis, ROS production, and ameliorates mitochondrial functions13

.

It is well known that to induce intestinal inflammation decreases epileptogenic threshold14

and

produces anxiety, then intestinal anti-inflammation actions could be helpful to decrease anxiety and to

improve seizures control. Moreover, an altered intestinal flora, dysbiosis, could play a role in the

intestinal adsorption of essential amino acids, that are the only precursor of important

neurotransmitters. In fact, an intestinal dysbiosis is reported in epileptic patients, it is responsible of an

excessive tryptophan decarboxylation in indole and skatole. In this way dysbiosis decreases

tryptophan brain uptake and its brain transformation in serotonin. But intestinal tryptophan controls


| 17

brain neuropetide-Y (NPY) synthesis, too. Brain NPY controls epileptogenic threshold and pain

threshold, not only it controls the neurogenesis and synaptogenesis, that are the tools of

neuroplasticity.

Also the anticonvulsant results of alpha-lactalbumin (ALAC)15,16,17

, that we suggest as anticonvulsive

agent, could be linked to its intestinal actions to decrease intestinal permeability, inflammation and

dysbiosis. In fact, the main role of ALAC in human colostrums is to activate in newborn the intestinal

absorptive and protective process, in this way, by its specific prebiotic effects, it modulates the brain

development.

It is interessant to note that both KD and ALAC increase insulin response.

To treat intestine could be an ancient but also a revolutionary therapeutic strategy to improve

neurological disorders, that can be included again in metabolic syndromes.

References

1. Burcelin R, Garidou L, Pomié C. Immuno-microbiota cross and talk: the new paradigm of metabolic diseases. Semin Immunol. 2012 Feb;24(1):67-74.

2. M. Vijay-Kumar et al. Altered Gut Microbiota in Toll-Like Receptor-5 (TLR5) Deficient Mice Results in Metabolic

Syndrome. Science, 2010;

3. Caricilli AM, Picardi PK, de Abreu LL, Ueno M, Prada PO, et al. (2011) Gut Microbiota Is a Key Modulator of Insulin

Resistance in TLR 2 Knockout Mice. PLoSBiol 9(12): e1001212

4. Robert C. Noland, et al.Peroxisomal-mitochondrial oxidation in a rodent model of obesity-associated insulin resistance Am J Physiol Endocrinol Metab October 2007 293:(4) E986-E1001

5. Olefsky JM, Saltiel AR. PPAR gamma and the treatment of insulin resistance. Trends Endocrinol Metab. 2000

Nov;11(9):362-8. 6. Eitan Okun et al. Toll-like receptors in neurodegeneration, Brain Research Reviews, Volume 59, Issue 2, March 2009,

Pages 278-292

7. Sheikh FG, Pahan K, Khan M, Barbosa E, Singh I. Abnormality in catalase import into peroxisomes leads to severe neurological disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Mar 17;95(6):2961-6.

8. T. Matsuzaki, et al. Insulin resistance is associated with the pathology of Alzheimer disease: The Hisayama

StudyNeurology August 31, 2010 75:764-770;

9. Aviles-Olmos I, Limousin P, Lees A, Foltynie T. Parkinson's disease, insulin resistance and novel agents of

neuroprotection. Brain. 2012 Feb 17.

10. Riederer P, Bartl J, Laux G, Grünblatt E. Diabetes type II: a risk factor for depression-Parkinson-Alzheimer? Neurotox Res.

2011 Feb;19(2):253-65. Epub 2010 Jun 15.

11. Mainardi P, Albano C. Is the antiepileptic effect of the ketogenic diet due to ketones? Med Hypotheses. 2008;70(3):536-9.

12. Bereswill S, et al. Anti-inflammatory effects of resveratrol, curcumin and simvastatin in acute small intestinal

inflammation. PLoS One. 2010 Dec 3;5(12):e15099 .

13. Kuo JJ, Chang HH, Tsai TH, Lee TY. Curcumin ameliorates mitochondrial dysfunction associated with inhibition of

gluconeogenesis in free fatty acid-mediated hepatic lipoapoptosis. Int J Mol Med. 2012 Sep;30(3):643-9. doi:

10.3892/ijmm.2012.1020. Epub 2012 Jun 11.

14. Riazi K, Honar H, Homayoun H, Demehri S, Bahadori M, Dehpour AR. Intestinal inflammation alters the susceptibility to

pentylenetetrazole-induced seizure in mice. Gastroenterol Hepatol. 2004 Mar;19(3):270-7.

15. Russo E, Scicchitano F, Citraro R, Aiello R, Camastra C, Mainardi P, Chimirri S, Perucca E, Donato G, De Sarro G.

Protective activity of α-lactoalbumin (ALAC), a whey protein rich in tryptophan, in rodent models of epileptogenesis.

Neuroscience. 2012 Sep 19. 16. Errichiello L, Pezzella M, Santulli L, Striano S, Zara F, Minetti C, Mainardi P, Striano P. A proof-of-concept trial of the

whey protein alfa-lactalbumin in chronic cortical myoclonus. Mov Disord. 2011 Dec;26(14):2573-5.

17. Citraro R, Scicchitano F, De Fazio S, Raggio R, Mainardi P, Perucca E, De Sarro G, Russo E. Preclinical activity profile of α-lactoalbumin, a whey protein rich in tryptophan, in rodent models of seizures and epilepsy. Epilepsy Res. 2011 Jun;95(1-

2):60-9.

Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of

ultrasonography

Santovito D., Graziano G.(*), Moschetta A., Minerva F., Sacco C., Pontrelli D., Palmieri V.O.,

Palasciano G.

Clinica Medica “A. Murri” – Dipartimento di Scienze Biomediche ed Oncologia Umana – Università

degli Studi di Bari, (*) Istituto Mario Negri Sud - Chieti

Background and aims: Metabolic syndrome (MetS) is a term used to explain the co-occurrence of

several conditions related to central obesity and insulin resistance that also includes impaired glucose

metabolism, dyslipidemia, and high blood pressure. The presence of MetS increases the

18 |

cardiovascular risk. The distribution of regional fat as well as the presence and the severity of steatosis

and the intima media thickness are believed to have a specific role as cardiovascular risk factors.

Ultrasonography may play a unique role in this context since it allows to evaluate in a single clinical

session most of these factors and therefore to give specific information on the prognosis of patients

affected by MetS and diabetes.

The aim of this work is therefore to evaluate the contribution of ultrasonograpghy to the study of

MetS and the cardiovascular risk.

Patients and methods: we enclosed in the study 404 patients (F 203, mean age 56,9; M 201, mean

age 53,6) admitted in our department for the evaluation of MetS. The diagnosis of MetS on the basis

of the NCEP ATP III criteria (2001) was confirmed in 309 patients (F 165, mean age 57,3, M 144,

mean age 53,8). All patients underwent a complete clinical and biochemical standard evaluation for

each component of MetS; abdominal ultrasonography was performed and the presence and severity of

steatosis as well as the thickness of subcutaneous, preperitoneal and visceral fat were recorded; the

cardiac ultrasonography revealed ventricular mass and interventricular septum thickness; intima media

thickness was finally evaluated. Data are expressed as M+SD. Comparison between means and

frequency and multivariate logistic analysis were ruled out for the statistical evaluation.

Results: Patients with and without MetS differed for ALT [53.71 (26.26)vs50.98 (29.33)], BMI

[32.93 (5.75)vs30.36 (6.70)], waist circumference [110.62 (11.71)vs102.78 (13.14)], HDL chol [40.61

(9.69)vs52.35 (11.10)], GGT [53.98 (50.60)vs42.89 (43.44)], glycemia [119.88 (41.68)vs95.22

(21.15)], steatosis grade [1.27 (0.69)vs0.92 (0.74)], US visceral fat (mm) [84.60 (85.07)vs64.71

(28.81)], HbA1C [6.56 (1.53)vs5.90 (1.33)], HOMA test [7.55 (6.42)vs3.43 (2.99)], insulin [26.87

(19.39)vs15.48 (14.14)], microalbuminuria [74.62 (277.64)vs24.94 (51.14)], systolic pressure [136.53

(15.65)vs130.18 (15.99)], cardiovascular risk (PROCAM) [16.47 (16.39)vs8.24 (7.66)], tryglicerides

[185.62 (163.61)vs101.92 (39.37)]. Patients with (n=368) and without (n=36) steatosis differed for

BMI [32.76 (5.98)vs27.86 (5.32)], waist circumference [109.88 (12.02)vs97.46 (11.73)], HDL chol

[42.64 (10.42)vs50.83 (15.56)], LDL chol [131.12 (35.10)vs110.06 (33.77)], GGT [52.97

(50.77)vs34.53 (21.00)], glycemia [115.90 (39.93)vs95.53 (25.68)], US preperitoneal fat [14.46

(13.24)vs12.01 (6.19)], US subcutaneous fat [17.17 (12.83)vs13.60 (4.73)], US visceral fat [82.85

(78.86)vs50.51 (26.24)], HOMA test [6.93 (6.13)vs1.86 (1.42)], n criteria MetS [3.30 (1.11)vs2.14

(1.17)], tryglicerides [171.51 (153.21)vs109.03 (67.05)].Patients with (n=107) or without (n=297)

microalbuminuria differed for ALT [54.58 (24.77)vs52.53 (27.77)], HDL chol [40.60 (10.00)vs44.34

(11.44)], Ejection fraction [56.73 (2.85)vs57.36 (3.03)], GGT [58.17 (40.42)vs48.96 (51.85)],

glycemia [129.43 (44.16)vs108.64 (35.91)], US steatosis grade [1.38 (0.72)vs1.11 (0.70)], US visceral

fat [81.07 (25.63)vs79.57 (87.48)], HOMA test [8.81 (7.25)vs5.80 (5.37)], n. criteria for MetS [3.50

(1.05)vs3.09 (1.19)], systolic pressure [138.50 (17.74)vs133.79 (15.08)], PROCAM risk [19.00

(16.87)vs12.95 (14.28)], tryglicerides [189.03 (198.88)vs157.62 (125.06)], visceral/subcutaneous ratio

[6.08 (3.30)vs5.05 (2.62)]. Multivariate logistic analysis (O.R., 95% OR CI) showed for: MetS a

correlation with systolic pressure (1.04, 1.01-1.06), PROCAM risk (1.06, 1.02-1.11), glycemia (1.04,

1.02-1.07), tryglicerides (1.01, 1.01-1.02), HDL chol (0.92, 0.88-0.95); steatosis a correlation with

HDL chol (0.96, 0.92-1.00), LDL chol (1.03, 1.01-1.05), US visceral fat (1.03, 1.01-1.06), insulin

levels (1.14, 1.04-1.24); microalbuminuria a correlation with RCV PROCAM (1.02, 1.00-1.03) and

the diagnosis of MetS (1); cardiovascular risk a correlation with HDL chol (0.91, 0.88-0.94), LDL

chol (1.02, 1.01-1.03), age (1.15, 1.10-1.19), smoking (1.06, 1.04-1.09), subcutaneous fat (0.91, 0.86-

0.96), diabetes (4.80, 2.52-9.14).

Conclusions: a complete evaluation of MetS and of the related cardiovascular risk seems to need the

execution of ultrasonography not only for the detection of well known conditions associated to the

MetS (e.g. biliary litiasis, steatosis, PCOS) but also in order to gain important information for the

prognosis of this syndrome. Our data show that US regional fat distribution study has a predictive

value for steatosis, microalbuminuria and cardiovascular risk higher than the waist circumference in

patients with MetS.

| 19

Fisiologia cardiaca

A protocol which combines current – and voltage-clamp provides a

novel useful three-dimensional representation of the cardiac action

potential

M. Zaniboni*#, F. Cacciani

*

* Department of Biosciences, University of Parma, Italy,

# Center of Excellence for Toxicological

Research, University of Parma, Italy

The cardiac cellular action potential (AP) describes the electrical

activity of heart cells by means of a function (membrane potential

Vm) of a single variable (time). Though invaluable for the study of

cardiac electrophysiology, this type of representation is

intrinsically limited by the fact that substantially different

membranes can display very similar or even identical APs (1,2),

endowed with quite different dynamical properties. A compact

representation of cardiac AP properties in terms of current source,

would be beneficial for cardiac electrophysiological research.

Based on previous patch

clamp (3) and modelling (1,4-

6) studies, we present here a

protocol which combines

current- and voltage-clamp in order to measure instantaneous

current-voltage relationships during AP repolarization, and

generates three-dimensional time-voltage-current surfaces, which

compactly describe several key dynamic features of the

corresponding membrane. A preliminary and incomplete version

of the procedure has been applied on real enzymatically isolated

guinea pig cardiac ventricular myocytes (Figure 1). During the

repolarization of an electrically elicited (current clamp) AP, and

at different time delays after AP overshoot (see arrows in Figure

1), the membrane was voltage clamped for 50 ms at the Vm

occupied by AP trajectory at that time (Vmt), and, in subsequent

runs, at Vmt -10 mV, and at Vmt +10 mV. The ion current (Iion)

flowing during each step was recorded (bottom panel of Figure 1) and allowed to draw instantaneous

current-voltage relations at each repolarization time. The “in silico” version of the protocol allows

higher time and voltage (and therefore current) – resolution, and is applied here on a human

ventricular AP model (7). Voltage clamp steps were applied every 1 ms during AP repolarization

(only 5 representative examples are reported in Figure 2A), and Vm clamped, at each time, every 1 mV

starting from - 120 mV up to + 40 mV. From the Iion density generated by the models equation system

during each step (Figure 2B), the Iion value (measured 1 ms after the onset of the step) was taken to

construct an instantaneous Iion-Vm curve at any given time of AP repolarization (Figure 2C).

Furthermore, the capacitive current (IC) density (-dV/dt), flowing at each time during AP

repolarization, was added to Iion for each Iion-Vm curve, leading to a collection of Im-Vm curves, where

Im is membrane current (Im = IC + Iion) density. The collection of Im-Vm plots (see representative

examples in panel D) generates a 3D surface (panel E) where x is time, y is Vm and z is Im. The AP

20 |

profile lies on the region where such surface intersects the Im = 0 plane. The model was recompiled in

its Matlab version by means of COR facility at “http://cor.physiol.ox.ac.uk”. The three-dimensional

AP representation allows to easily estimate membrane resistance (the inverse of the slope of Im-Vm

slices) during repolarization, which is a key factor involved in its electrotonic modulation. The 3D

surface also shows that, during late repolarization phase, membrane conductance becomes negative

(white arrow in figure 2E), which leads to the novel finding that, at this time, repolarization is auto-

regenerative, i.e. the ventricular membrane acts as a repolarizing source of current. An additional

number of relevant features concerning repolarization dynamics are compactly contained in the 3D

AP representation that we present here, and which we propose therefore as a new useful tool for both

in vivo and in silico cardiac cellular electrophysiological investigations.

Reference

1. M. Zaniboni, I. Riva, F. Cacciani, and M. Groppi, “How different two almost identical action potentials can be: a model

study on cardiac repolarization”, Math. Biosci. vol. 228(1), pp. 56-70. 2010.

2. E.M. Cherry and F.H. Fenton, “A tale of two dogs: analyzing two models of canine ventricular electrophysiology.” Am J Physiol Heart Circ Physiol. vol. 292:H43-55, 2007.

3. M. Zaniboni, A.E. Pollard, L. Yang, and K.W. Spitzer, “Beat-to-beat repolarization variability in ventricular myocytes and

its suppression by electrical coupling”, Am J Physiol Heart Circ Physiol. vol. 278, pp. H677-87, 2000. 4. M. Zaniboni, “3D current-voltage-time surfaces unveil critical repolarization differences underlying similar cardiac action

potentials: A model study”, Math Biosci. Vol. 233, pp.98-110. 2011. 5. M. Zaniboni, “Late phase of repolarization is autoregenerative and scales linearly with action potential duration in

mammals ventricular myocytes: a model study” IEEE Trans Biomed Eng 2012 Jan;59(1):226-33.

6. M. Zaniboni, “Heterogeneity of Intrinsic Repolarization Properties within the Human Heart: New Insights from Simulated Three-Dimensional Current Surfaces” IEEE Trans Biomed Eng. 2012 Jun 15. in press.

7. L. Priebe and D.J. Beuckelmann, “Simulation study of cellular electric properties in heart failure”. Circ Res. vol. 82, pp.

1206-23, 1998.

Corresponding Author: Dott. Massimiliano Zaniboni – Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Parma, Tel 0521

905623 , e-mail: [email protected]

Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under

modulation of two different pacemaker mechanisms

M. Zaniboni*#, F. Cacciani

*

* Department of Biosciences, University of Parma, Italy,

# Center of Excellence for Toxicological

Research, University of Parma, Italy

Spontaneous electrical activity of cardiac pacemaker cells is caused by two main mechanisms (1): one

related to voltage-gated membrane channels, mainly the hyperpolarization-activated cationic current If

(2), the other linked to the intracellular calcium handling via the Na+/Ca

2+ exchanger, which, activated

by the release of calcium by sarcoplasmic reticulum, provides a cyclic source of inward current (3).

The relative contribution of these two mechanisms to cardiac pacemaking is still object of debate, and

their regulation is of great clinic and pharmacological interest. The aim of our study was to compare

the effect of 3µM Ivabradine (specific If blocker (4)) and of the same concentration of Ryanodine

(blocker of sarcoplamic calcium release channels (5)) on action potential (AP) parameters of single

cells isolated from guinea-pig sinoatrial node. Analogous studies have been performed previously on

different species (6).

Sinoatrial pacemaker cells, enzimatically isolated from guinea-pig hearts (male Dunkin Harley

weighing 300-400 gr) (2) were transferred in the cell chamber of an inverted microscope, and perfused

in physiological Normal Tyrode (NT) solution at 36°C. Only cells displaying spontaneous and regular

contractions were brought in patch-clamp whole cell configuration, and underwent membrane

potential recordings.

For each of these cells, a sequence of spontaneous APs was recorded for 2-3 minutes, until a steady-

state AP waveform was reached; perfusion solution was then rapidly switched, by means of an

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9633920


| 21

electrovalve, to Ivabradine solution (IVA), and spontaneous APs recorded until a new steady-state

was gained (usually 3 to 5 minutes), then again to NT until recovery of the starting intrinsic

configuration. This protocol was applied on 20 cells; on seven of these, the whole cell patch clamp

configuration lasted enough time to allow testing of Ryanodine solution (RYA) as well.

Data analysis was performed by means of a dedicated software (Scaldyn), which we developed in

collaboration with the University of Utah (7). The software automatically calculates, for each beat, the

following parameters: maximum diastolic potential (MDP, mV), AP peak (Vpeak, mV), AP amplitude

(APA, mV) and duration (APD, ms), take-off potential (TOP, mV), and the diastolic depolarization

rate (DDR, V/s). Also, cycle length (the inverse of the pacing frequency, CL, ms) and its coefficient of

variability (CV, %) are calculated. Fig. 1 shows representative examples of the effect of IVA (top) and

RYA (bottom) on APs (left column) and on CL (right column). Though the time taken to reach the

new steady state is quite different in the examples shown, no stastical difference in this parameter was

found between IVA and RYA.

IVA significantly changed all parameters of AP (n = 20), increasing CL, CV and APD, depolarizing

MDP and TOP and decreasing Vpeak, APA and DDR. On the 7 cells treated with both IVA and RYA,

blockers displayed, with respect to NT, comparable effects on every AP parameter (as shown in the

hystogram in Fig. 2). In particular, both blockers increased CL (by 27 and 30% respectively), and

APD (by 31 e 26%), decreased DDR (by 34 and 42%), depolarized TOP (by 7 and 10%). The only

difference recorded was that IVA increased CV of CL much more than RYA (+59% and +16%

respectively). These results, though incomplete, suggest a possible interest in new pharmacological

modulators of cardiac sinus rhythm, which could be used in addition or as substitutes of the molecules

(e.g. Ivabradine, β-blockers) presently in use.

Fig. 1: Left column: representative examples of the effect of Ivabradine (top) and Ryanodine (bottom)

on steady state AP sequences of guinea-pig sinoatrial cells; controls in black, and blockers in red.

Right column: representative example of time-course of changes of CL secondary to blockers

application.

Fig.1 Fig.2

Fig. 2: Hystogram of the overall effects of blockers on action potential parameters. Data are

normalized to the mean value in NT.

References:

1) Eisner DA & Cerbai E (2009). Beating to time: calcium clocks, voltage clocks, and cardiac pacemaker activity. Am J Physiol

Heart Circ Physiol 296, H561-H562.

2) DiFrancesco D, Ferroni A, Mazzanti M, & Tromba C (1986). Properties of the hyperpolarizing-activated current (If) in cells isolated from the rabbit sino-atrial node. J Physiol 377, 61–88.

3) Bogdanov KY, Vinogradova TM & Lakatta EG (2001). Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger:

molecular partners in pacemaker regulation. Circ Res 88, 1254-1258. 4) Bucchi A, Baruscotti M & DiFrancesco D (2002). Current-dependent block of rabbit sino-atrial node If channels by Ivabradine.

J Gen Physiol 120, 1-13.

5) Rousseau E, Smith JS & Meissner G (1987). Ryanodine modifies conductance and gating behavior of single Ca2+ release channel. Am J Physiol 253, C364-C368.

6) Bucchi A, Baruscotti M, Robinson RB, & DiFrancesco D (2007). Modulation of rate by autonomic agonists in SAN cells

involves changes in diastolic depolarization and the pacemaker current. J Mol Cell Cardiol 43, 39-48. 7) Lux RL & Ershler PR (2003). Cycle length sequence dependent repolarization dynamics. J Electrocardiol 36, Suppl:205-208.

Corresponding Author: Dott.ssa Francesca Cacciani – Dip. Bioscienze, Università degli Studi di Parma Tel 0521 906119 e-

mail [email protected]

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=









22 |

Arrhythmia susceptibility in senescent rat hearts

S. Rossi1, S. Baruffi

1, D. Corradi

2,3, S. Callegari

4, E. Musso

1, A. Sgoifo

5, L. Carnevali

5, M. Miragoli

3

and E. Macchi1,3

1 Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi, Parma;

2 Dipartimento di Scienze Biomediche,

Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli Studi, Parma; 3 Centro di Eccellenza di Ricerca

Tossicologica, Università degli Studi, Parma; 4 Reparto di Cardiologia, Ospedale di Vaio, Fidenza;

5 Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi, Parma.

Background.

Cardiovascular disease increases with age. Significant alterations of cardiac electrophysiological

properties occur during the normal aging process as a result of structural remodeling of the

extracellular matrix, modifications of cell-to-cell connection between neighboring cardiac myocytes

(gap junctions) and changes in active membrane properties. Even if advanced age appears to be a risk

factor for increased susceptibility to ventricular arrhythmia, a detailed knowledge about changes in

cardiac electrophysiology relevant to arrhythmogenesis in the elderly is relatively lacking.

Objective.

Thus the aim of the study was to determine specific age-related changes in electrophysiological

properties and myocardial structure of the ventricles which can be related to a structural-functional

arrhythmogenic substrate.

Methods.

Multiple epicardial electrograms were recorded on the ventricular surface of in vivo control (10

months) and aged (24 months) rats during normal sinus rhythm and ventricular pacing. Arrhythmia

inducibility was tested by premature stimulation and burst pacing. Fiber architecture, connexin43

(Cx43), connexin40 (Cx40), interstitial fibrosis and tissue collagen content were determined by

(immune)histology, while proteins content was performed by Western blotting.

Fig.1 Different cycles of arrhythmia events in aged heart characterized either by slow propagating wavefronts circulating around a functionally refractory region or by multiple wavefronts (A). Subsequent cycles of the arrhythmia were characterized

by slow circus movement of reentrant activation sequences around the same region of functional block or by focal activation

spreading with slow anisotropic conduction velocity (B). Subsequently some of the cycles displayed the same focal origin as in previous arrhythmic episodes and interestingly the focal activation is localized in the same point of the BTP during sinus

rhythm (C). The arrhythmia terminated with a 5 Hz monomorphic sequence characterized by wavefronts circulating counter-

clockwise around an obstacle in the lower right area of the electrode array (D). Arrhythmia terminates with spontaneous ventricular activation characterized by low heart rate (E). During a II episode of VT few beats of focal activation spreading with

slow anisotropic conduction velocity were observed (F).

| 23

Results.

Spontaneous supraventricular and ventricular rhythm disturbances were frequently observed in aged

hearts1. Ectopic beats during premature stimulation and sustained ventricular arrhythmias during

burst pacing were frequently induced in aged hearts but not in control hearts (Fig.1).

Electrophysiological analysis in aged hearts revealed that PQ duration and total ventricular activation

time (QRS duration) were significantly delayed as compared to control hearts while anisotropic

conduction velocity did not change significantly2. Ventricular activation patterns displayed variable

number, location and time of appearance of epicardial breakthrough points1.

Morphological analysis in aged hearts revealed that heart weight and myocyte transverse diameter

increased significantly, scattered microfoci of interstitial fibrosis were mostly present in the

ventricular subendocardium and gap junction Cx43 and Cx40 expression decreased significantly in

ventricular myocardium, as compared to controls2.

Conclusion.

Delayed QRS duration, abnormal activation patterns and unchanged ventricular conduction velocity in

aged hearts suggest the occurrence of impaired impulse conduction through the Purkinje system

leading to uncoordinated myocardial excitation despite structural changes. Impaired interaction

between Purkinje system and ventricular myocardium might create a potential reentry substrate,

contributing to higher vulnerability to ventricular arrhythmias observed in aged hearts. This is

consistent with the occurrence of intermittent focal anisotropic activations, possibly originating from

Purkinje-ventricular junctions, among sequences of wide wavefront circus movements around a

functionally refractory region.

References 1 Rossi S, Baruffi S, Bertuzzi A, Mastorci F, Sgoifo A, Musso E, Corradi D, Maestri R, Brisinda D, Fenici R, Macchi E. Susceptibility to ventricular arrhythmias in aged hearts. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007; 2007: 410-414. 2 Rossi S, Baruffi S, Bertuzzi A, Miragoli M, Corradi D, Maestri R, Alinovi R, Mutti A, Musso E, Sgoifo A, Brisinda D, Fenici

R, Macchi E. Ventricular activation is impaired in aged rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008; 295: H2336-2347. Corresponding Author: Stefano Rossi; Address: Dipartimento di Bioscienze, Parco Area delle Scienze 11/A, 43124, Parma; Tel

Number: 0521905621; e-mail: [email protected]

Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular

arrhythmias in the normal heart

S. Rossi1, S. Baruffi

1, S. Callegari

2, L. Carnevali

3, D. Corradi

4,5, M. Miragoli

5, E. Musso

1, A. Sgoifo

3,

M. Trombini1, E. Macchi

1,5

1Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi, Parma,

2Reparto di Cardiologia, Ospedale di

Vaio, Fidenza, 3Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi, Parma,

4Dipartimento di

Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli Studi, Parma, 5Centro di

Eccellenza di Ricerca Tossicologica, INAIL, ex-ISPESL, Università degli Studi, Parma

Background

It is very unusual for single low-intensity premature stimuli to induce ventricular arrhythmias in

the normal heart, even when delivered in succession, whereas strong electrical stimuli, when properly

timed, usually do [1, 2, 3]. Still, we observed that a single low-intensity premature stimulus could

occasionally induce ectopic beats in normal rat hearts. Surprisingly, by repeating the premature

stimulation at the same ventricular location and with the same coupling interval, the ectopic beats

were consistently induced. Based on these observations, possible hypothesis for the arrhythmogenesis

is that the premature beat can encounter a zone of unidirectional conduction block to initiate reentry

[4]. However, enhanced dispersion of refractoriness, a necessary condition for initiation of reentry, is

unlikely to be present in normal myocardium [5, 6, 7]. Accordingly, the mechanisms underlying the

origin of the ectopic beats induced by single low-intensity premature stimuli are not definitely

manifest.

Objective

The main objective of the present study was to characterize pacing sites and critical premature

intervals which can induce ectopic beats in the normal heart and to identify their arrhytmogenic

substrate. Therefore we performed high spatial resolution potential mapping while pacing numerous


24 |

epicardial sites in normal rats with a view to identify temporal and spatial properties of possible

reentrant excitations. To evaluate whether spatial dispersion in recovery of excitability might be

important for the occurrence of unidirectional block, we also measured the effective refractory period

(ERP) at each pacing site. These measurements were then related with the spread of excitation during

the onset of the arrhythmia.

Methods

Unipolar electrograms (EGs) were recorded from the anterior ventricular surface of 20 in vivo

adult rats using a 8x8, 1 mm resolution, epicardial electrode array during sinus rhythm (SR) and

premature stimulation. At 18 evenly distributed array electrodes, regular trains of low-intensity stimuli

(two times diastolic threshold) were followed by a premature stimulus (eight times diastolic threshold)

at progressively shorter coupling intervals, until ERP was reached.

Results

Gradual increase in stimulus prematurity determined a corresponding increase in latency in

impulse initiation as well as decrease in anisotropic conduction velocity. Ectopic beats were induced

when pacing was performed at well-defined sites of right (RV) and left ventricle (LV) and the

premature intervals were almost equal to ERP values. Ectopic activation patterns were characterized

by the appearance on the paced ventricle of epicardial breakthrough points (BTPs) which gave rise to

wavefronts rapidly propagating in all directions. The location of BTPs was either coincident with SR

BTPs or new BTPs could appear. When the pacing sites were located on the epicardial projection of

the septum, BTPs appeared, in the proximity of the pacing sites, either on the RV or LV. Regions of

critical degree of conduction and reentry were not observed on the epicardial surface, consistent with

the measured uniform ERP spatial distribution.

Conclusion

The appearance of BTPs during the ectopic activation patterns is the epicardial manifestation of

wavefronts originating from underlying Purkinje fiber-ventricular muscle junctions (PVJs). Thus, our

findings suggest that a critically premature beat can encounter an appropriate substrate for

unidirectional block and reentrant excitation at underlying PVJs where intrinsically different action

potential durations are normally present at the two sides of the PVJ due to appreciably longer

repolarization time of Purkinje fibers [8, 9].

Exactly the same issue would face a local spontaneous excitation in normal myocardium, such as a

premature ventricular complex eventually caused by an early afterdepolarization, originating at a

critical time during the repolarization phase of a sinus beat. Although in the normal myocardium

ventricular arrhythmias rarely occur spontaneously, their incidence might be favored by the presence

of reentrant ectopic beats especially when dispersion of refractoriness is increased, such as during

enhanced activity of the sympathetic nervous system [10].

References

1) Winfree AT. Electrical instability in cardiac muscle: phase singularities and rotors. J Theor Biol. 1989; 138: 353-405.

2) Gotoh M, Uchida T, Mandel WJ, Fishbein MC, Chen PS, Karagueuzian HS. Cellular graded responses and ventricular vulnerability to reentry by a premature stimulus in isolated canine ventricle. Circulation. 1997; 95: 2141–2154.

3) Janse MJ. Vulnerability to ventricular fibrillation. Chaos. 1998; 8: 149-156.

4) Kléber AG, Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias. Physiol Rev. 2004; 84: 431-88.

5) Allessie MA, Bonke FI, Schopman FJ. Circus movement in rabbit atrial muscle as a mechanism of tachycardia. II. The

role of nonuniform recovery of excitability in the occurrence of unidirectional block, as studied with multiple microelectrodes. Circ Res. 1976; 39: 168-177.

6) Burton FL, Cobbe SM. Dispersion of ventricular repolarization and refractory period. Cardiovasc Res. 2001; 50: 10-23.

7) Coronel R, Wilms-Schopman FJ, Opthof T, Janse MJ. Dispersion of repolarization and arrhythmogenesis. Heart Rhythm. 2009; 6: 537-43.

8) Myerburg RJ, Stewart JW, Hoffman BF. Electrophysiological properties of the canine peripheral A-V conducting system.

Circ Res. 1970; 26: 361-378. 9) Mendez C, Mueller WJ, Merideth J, Moe GK. Interaction of transmembrane potentials in canine Purkinje fibers and at

Purkinje fiber–muscle functions. Circ Res 1969;24:361-372.

10) Schwartz PJ, Stone HL. The role of the autonomic nervous system in sudden coronary death. Ann N Y Acad Sci. 1982;

382: 162-80.

Corresponding author: Emilio Macchi; address: Dipartimento di Bioscienze, Viale Parco Area delle Scienze 11/A, Università

degli Studi, Parma; telephone: 0521 906 116; e-mail: [email protected]

| 25

Antropologia ed evoluzione molecolare

Complementarietà di spettroscopia FT-IR ed analisi istologiche per

lo studio del degrado della pelle mummificata.

M. Stani1, A. Baraldi

1, R. Boano

2, R. Cinquetti

3, M. G. Bridelli

1

1Dipartimento di Fisica e Scienze della Terra, Università di Parma,

2Dipartimento di Biologia Animale

ed Umana, Università di Torino, 3Dipartimento di Bioscienze, Università di Parma.

La collezione di mummie egiziane del museo di Antropologia ed Etnografia Giovanni Marro

dell’Università degli Studi di Torino rappresenta un patrimonio di informazioni preziosissime per

poter comprendere quali fossero le antiche tecniche di mummificazione. La presenza sia di mummie

naturali (di epoca predinastica) che di mummie sottoposte a procedimenti di imbalsamazione (tipici

delle epoche dinastiche) permette, utilizzando specifiche tecniche diagnostiche, di stabilire quale sia

lo stato di conservazione di questi reperti sia in riferimento al diverso procedimento di

mummificazione subito, sia in relazione alle diverse condizioni di seppellimento a cui furono

sottoposte. E’ inoltre possibile monitorarne costantemente i processi di invecchiamento e di

deterioramento da parte di fattori endogeni ed esogeni al fine di stilare specifici protocolli di

conservazione. Le tecniche utilizzate in questo studio sono state la Spettroscopia Infrarossa a

Trasformata di Fourier (FT-IR) e una serie di analisi istologiche. Tutti i campioni antichi sono stati

messi a confronto con campioni di riferimento di pelle moderna analizzati con le medesime tecniche.

La pelle è costituita da una serie di strati che è possibile distinguere sommariamente in epidermide,

derma ed ipoderma. L’epidermide a sua volta è costituita da differenti strati di cellule che si

differenziano fra loro per un progressivo accumulo, dall’interno verso l’esterno, di cheratina. Il derma

è costituito invece prevalentemente da fasci di fibre collagene, intervallati da sottili fibre elastiche, il

tutto immerso insieme ad una serie di altri elementi come ghiandole e bulbi piliferi in una matrice di

glicosaminoglicani. Infine l’ipoderma è costituito prevalentemente da tessuto adiposo.

Dallo spettro infrarosso della pelle è possibile ottenere informazioni che riguardano tutte le classi di

composti che costituiscono questo tessuto ma in particolare le proteine. Nell’intervallo di frequenze

compreso tra 1650 cm-1

e 1550 cm-1

infatti si riscontrano gli assorbimenti della banda Amide I, dovuta

allo stretching del legame C=O, e della banda Amide II dovuta al bending del legame N-H ed allo

stretching del legame peptidico C-N (1). Attraverso un procedimento di curve fitting iterativo eseguito

sulla banda Amide I, si possono ottenere informazioni sulla struttura secondaria delle proteine. Il

risultato generale delle misure suggerisce una diminuzione del quantitativo di struttura ad alfa elica a

favore di un incremento della struttura beta (2, 3), con notevole variabilità da un campione all’altro, in

dipendenza dal trattamento di imbalsamazione subito. Questo dato è indicativo di una modificazione

conformazionale delle proteine presenti dovuta a fenomeni di degrado occorsi nel tempo. Le

informazioni ottenute dall’analisi degli spettri FTIR possono essere correlate alle diverse classi di

proteine della pelle quali cheratina, elastina e collagene, mediante studi istologici dei campioni.

L’analisi istologica ha permesso l’osservazione morfologica dei tessuti mummificati, l’identificazione

dei diversi strati costituenti la pelle e il loro stato di conservazione. È stato infatti possibile notare che,

oltre alla totale assenza dell’epidermide, sono presenti sostanziali differenze fra reperti sottoposti ai

due differenti processi di mummificazione, evidenziabili in particolare nel diverso aspetto

morfologico e livello di conservazione delle fibre collagene (4-5).

L’accostamento delle due tecniche di indagine, in conclusione, si è rivelato estremamente utile perché

è stato possibile confrontare i dati ottenuti separatamente mediante le due metodologie e constatare

che questi risultano complementari ed integrativi gli uni degli altri.

26 |

FIG. 1: a – Confronto spettri FT-IR delle pelle moderna e della pelle di mummia predinastica; b – Fitting della banda Amide I

della pelle moderna; c – Fitting della banda Amide I della pelle di mummia predinastica; Tabella: Confronto tra le percentuali

delle strutture secondarie.

FIG 2: a – Immagine al microscopio ottico della pelle di mummia predinastica; b – Immagine al microscopio ottico della pelle

di mummia imbalsamata.

Bibliografia:

1. Torii, H., Tasumi, M. (1996). Theoretical analyses of the Amide I infrared bands of globular proteins, in Infrared

Spectroscopy of Biomolecules. H. H. Mantsch and D. Chapman eds., J. Wiley & sons, inc. NY. Pp. 1-18.

2. Byler, D. M., and Susi, H. (1986). Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra.

Biopolymers, 25(3): 469 – 487.

3. Bridelli, M. G., Dell’Anna, A., Stani, C., Baraldi, A., Boano, R., De Iasio, S. FT-IR spectroscopy and microspectroscopy of

ancient Egyptian embalmed heads from the Museum of Anthropology and Ethnography of the University of Turin. 2nd

Bolzano Mummy Congress – Mummies from the ice (Bolzano, Italy, 20 – 22 October 2011). Proceedings pp. 51.

4. Byung Soo Chang, Chang Sub Uhm, Chang Hyun Park et al. (2006). Preserved skin structure of a recently found fifteenth-

century mummy in Daejeon, Korea. Journal of Anatomy 209: 671- 680.

5. Montes, G.S., Kriszta´n, R.M., Junqueira, L.C., (1985). Preservation of elastic system fibers and of collagen molecular

arrangement and stainability in an Egyptian mummy. Histochemistry 83:117–119.

Stature estimation using mandibular morphometric parameters in

Italian population: a preliminary report

C. Milani, R. Milani, G. L. Panattoni.

Department of Neurosciences, University of Turin.

INTRODUCTION

Stature estimation is one of the most important parameters in personal identification. Physical and

forensic anthropologists can extimate stature from human remains in order to define a general profile

of the victims [1-5]. It often occurs that fragmented or incomplete human remains are found by

investigators. In literature, anatomical methods based on measurements of the whole skeleton or

mathematical methods based on measurements of single bones, have been developed. By these

methods regression formulae for calculating the stature were obtained. Since abnormal development

| 27

of the mandible is involved in growth disorders [6-8], we investigated possible correlations between

some mandibular morphometric parameters and stature in normal subjects of Italian population in

relation to personal identification in anthropologic or forensic practice.

MATERIALS AND METHODS

Measures were acquired in 41 individuals of both sexes (31 males ranging from 20 to 56 years old, 10

females ranging from 20 to 61 years old) from Caucasian Italian population (born in Italy and with

Italian parents). Stature and distances between the following cephalometric landmarks of both

mandibular sides were measured: co-co (bicondylar distance); go-go (bigonial distance); co-go

(condylion-gonion distance); go-gn (gonion-gnathion distance). The stature of the subjects was

measured in standing position to the vertex by using a non-stretch, retractable anthropometric tape.

The mandibular parameters were measured by a digital anthropometric head caliper. Mandible

dimension (MD) were considered as the sum of the co-go-gn distances of both sides. The possible

statistical relationships between MD and the measured living stature (MLS) were investigated by

Pearson correlation analysis (r coefficient) in order to obtain the estimated living stature (ELS).

RESULTS

Mean age and MLS of the specimens are reported in Table 1.

MEAN AGE

(in years)

MEAN MLS

(in cm)

MALES 30.5 176

FEMALES 29.8 161.6

Table 1. Mean age and MLS of the observed specimens.

In the whole sample, ELS is expressed by the regression formula: ELS= 2.6965 x P + 89.879

with Standard Deviation = 4% and Standard Error = 5%.

The r coefficient between MD and MLS is 0.63.

DISCUSSION

As the estimated living stature obtained by mathematical method is population-specific, in this

preliminary report we examined in particular a sample of Caucasian Italian population. We choose the

sum of bilateral co-go-gn distances as a reference dimension of the mandible because these values

seem to be the most significant for representing mandibular growth. In fact, the mandible grows with

a progressive posterior increase in length of the body and in height of the rami. In literature, some

researches [9-11] show a very low correlation between mandibular morphometry and stature, while in

other works [12] the correlation is moderate like the one showed by our data; these differences could

be due to the various factors that affect the mandibular growth (e.g., orthodontic treatments).

References:

1) Fully G., Pineau H. Détermination de la stature au moyen du squelette. Ann. Med. Leg., 1960, 40: 145–154. 2) Raxter M.H., Auerbach B.M., Ruff C.B. Revision of the Fully technique for estimating statures. Am. J. Phys. Anthropol.,

2006,130: 374-84.

3) Krogman W.M., İşcan M.Y. Calculation of stature. In: Human skeleton in forensic medicine (W.M. Krogman, M.Y. İşcan, Eds.), Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, U.S.A., 1986, 302–351.

4) Trotter M., Gleser G. A re-evaluation of estimation of stature based on measurements of stature taken during life and of long

bones after death. Am. J. Phys. Anthropol., 1958, 16: 79-123. 5) Wilson R.J., Herrmann N.P., Jantz L.M. Evaluation of stature estimation from the database for forensic anthropology. J.

Forensic Sci., 2010, 55: 684-689.

6) Takakura M., Kuroda T. Morphologic analysis of dentofacial structure in patients with acromegaly. Int. J. Adult Orthodon. Orthognath. Surg., 1998, 13: 277-288.

7) Dostálová s., Sonka K., Amahel Z., Weiss v., Marek J. Cephalometric assessment of cranial abnormalities in patients with

acromegaly. J. Craniomaxillofac Surg., 2003, 31: 80-87. 8) Kjellberg H, Wikland K.A. A longitudinal study of craniofacial growth in idiopathic short stature and growth hormone-

deficient boys treated with growth hormone. Eur. J. Orthod., 2007, 29: 243-250.

9) Agnihotri A.K., Kachhwaha S., Googoolye K., Allock A. Estimation of stature from cephalo-facial dimensions by regression analysis in Indo-Mauritian population. J. Forensic Leg. Med., 2011, 18: 167-172.

10) Pelin C., Zağyapan R., Yazici C., Kürkçüoğlu A. Body height estimation from head and face dimensions: a different

method. J. Forensic Sci. 2010, 55: 1326-1330. 11) Sahni D., Sanjeev, Sharma P., Harjeet, Kaur G., Aggarwal A. Estimation of stature from facial measurements in northwest

Indians. Leg. Med., 2010, 12: 23-27.

12) Kalia S., Shetty S.K., Patil K., Mahima V.G. Stature estimation using odontometry and skull anthropometry. Indian J. Dent. Res., 2008, 19: 150:154.

Corresponding author: Gian Luigi Panattoni. Dipartimento di Neuroscienze, Università di Torino, Corso M. D’Azeglio 52,

10126 – Torino. Tel: 011-6707726 / 333-3825517. E-mail: [email protected]


28 |

Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane a

diverso grado di isolamento

A. Boattini, S. Sarno, D. Luiselli, D. Pettener

Dipartimento di Scienze Biologiche, Geologiche e Ambientali, Laboratorio di Antropologia

Molecolare, Università di Bologna,

Lo studio di marcatori uniparentali del cromosoma Y – accoppiato ad una adeguata strategia di

campionamento basata su variabili biodemografiche (ad es. cognomi) – consente di ricostruire

strutture genetiche di popolazioni umane rivelatrici dei processi storici che hanno condotto alla

situazione attuale. Presentiamo alcuni risultati preliminari di ricerche di antropologia molecolare in

corso presso il nostro laboratorio. Il caso della Partecipanza di S. Giovanni in Persiceto – un peculiare

isolato socio-culturale di origine medioevale legato all'eredità patrilineare della terra – è di particolare

interesse in quanto consente di effettuare inferenze sulla storia del popolamento dell'area padana e di

ricostruire tassi di mutazione per alcuni marcatori all'interno di genealogie documentate. Uno studio

che coinvolge popolazioni non isolate dell'intero territorio italiano ha invece rivelato la presenza di

discontinuità genetiche (legate alla geografia) la cui origine risale probabilmente al tardo Neolitico e

alle successive Età dei Metalli.

Ancient DNA studies: new perspectives on old samples

D. Caramelli

Dipartimento di Biologia Evoluzionistica, Università di Firenze, Firenze, Italy

In spite of past controversies, the field of ancient DNA is now a reliable research area due to recent

methodological improvements. A series of recent large-scale studies have revealed the true potential

of ancient DNA samples to study the processes of evolution and to test models and assumptions

commonly used to reconstruct patterns of evolution and to analyze population genetics and

palaeoecological changes. Recent advances in DNA technologies, such as next-generation sequencing

make it possible to recover DNA information from archaeological and paleontological remains

allowing us to go back in time and study the genetic relationships between extinct organisms and their

contemporary relatives. With the next-generation sequencing methodologies, DNA sequences can be

retrieved even from samples (for example human remains) for which the technical pitfalls of classical

methodologies required stringent criteria to guaranty the reliability of the results. In this paper, we

review the methodologies applied to ancient DNA analysis and the perspectives that next-generation

sequencing applications provide in this field.

| 29

Mine, yours, ours? sharing data on human genetic variation

N.Milia1,3, A.Congiu1,3, P.Anagnostou1,2, F.Montinaro2, M.Capocasa2, E.Sanna3,G.Destro

Bisol1,2

1 Università di Roma “La Sapienza”, Dipartimento di Biologia Ambientale, Roma Italy, 2Istituto

Italiano di Antropologia, Roma, Italy, 3Università di Cagliari, Dipartimento di Biologia Sperimentale,

Cagliari, Italy

The achievement of a robust, effective and responsible form of data sharing is currently regarded as a

priority for biological and bio-medical research. However, it has been argued that its possible

advantages in terms of better exploitation of data and optimized use of resources may be counteracted

by the time and economic costs required, by underlying ethical concerns, and conflicts of interest with

patenting discoveries. In this contrasting scenario, empirical evaluations of data sharing may be

regarded as an indispensable first step in the identification of critical aspects and the development of

strategies aimed at increasing availability of research data for the scientific community as a whole.

Research concerning human genetic variation represents a potential forerunner in the establishment of

widespread sharing of primary datasets. However, no specific analysis has been conducted to date in

order to ascertain whether the sharing of primary datasets is common-practice in this research field.

To this aim, we analyzed a total of 543 mitochondrial and Y chromosomal datasets reported in 508

papers indexed in the Pubmed database from 2008 to 2011. A substantial portion of datasets (21.9%)

was found to have been withheld, while neither strong editorial policies nor high impact factor proved

to be effective in increasing the sharing rate beyond the current figure of 80.5%. Disaggregating

datasets for research fields, we could observe a substantially lower sharing in medical than

evolutionary and forensic genetics, more evident for whole mtDNA sequences (15.0% vs 99.6%). The

low rate of positive responses to e-mail requests sent to corresponding authors of withheld datasets

(28.6%) suggests that sharing should be regarded as a prerequisite for final paper acceptance, while

making authors deposit their results in open online databases which provide data quality control seems

to provide the best-practice standard. Finally, we estimated that 29.8% to 32.9% of total resources are

used to generate withheld datasets, implying that an important portion of research funding does not

produce shared knowledge. By making the scientific community and the public aware of this

important aspect, we may help popularize a more effective culture of data sharing.

30 |

Metodologie e tecniche della biologia sperimentale

Light regulated enzyme activities

A. Losi1, W. Gärtner

2*

1, Physics department, University Parma, Italy;

2, Max-Planck-Institute for Chemical Energy

Conversion, Mülheim, Germany

In collaboration with G. Nagel, Univ. Würzburg, Germany, P. Hegemann, Humboldt-Univ. Berlin,

Germany

Biological photoreceptors fulfill a double duty in (i) receiving information by absorption of light and

(ii) transmitting information by generating and transducing a biological signal (which eventually will

enable the organism to adjust its lifestyle according to the environmental conditions). In many cases,

both functions are located in distinct protein domains that are fused to each other through a

“connector” peptide. Genome-wide screens reveal that often one type of sensing domain is connected

to different types of signaling domains and vice versa, i.e., the same type of signaling domain is fused

to different types of sensing functions.(1) The fact that photoreceptors are instantaneously activated or

de-activated in a non-invasive manner (light activation!), and the demonstration by nature that

combinations of various domains yield functional receptors, has triggered activities to employ

naturally occurring or synthetically formed hybrid photoreceptors in biotechnological

applications.(2,3)

In this presentation, two types of naturally occurring nucleotide cyclases will be discussed: AMP-

cyclases(4) and c-di-GMP cyclases/hydrolases.(5,6) Their function in the natural environment is well

documented, as cAMP is an important second messenger in many (micro)organisms, and c-di-GMP is

identified as a molecule that can regulate pathogenicity, biofilm formation, or motility.

Literature cited:

(1) Losi, A. and Gärtner, W. (2008) Photochem. Photobiol.. Sci. 7, 1168-1178.

(2) Christie, J.M., et al. (2012) Molecular Plant 5, 533-544.

(3) Olson, E.J. and Tabor J.J. (2012) Curr. Op. Chem. Biol. 16, 300-306.

(4) Stierl, M., et al. (2011) J. Biol. Chem. 286, 1181-1188.

(5) Wu, Y.I., et al. (2009) Nature 461, 104-108.

(6) Cao, Z., Livoti, E., Losi, A., and Gärtner, W. (2010) Photochem. Photobiol 86, 606-611.

Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric

analysis with scanning ion conductance microscopy

M. Miragoli1,4

, S. Rossi2, M. J. Lab

3, J. Gorelik

3

1Centro di Eccellenza per la Ricerca Tossicologica, CERT, INAIL ex-ISPESL, Universita’ degli studi

di Parma, 2Dipartimento di Bioscienze, Universita’ degli studi di Parma,

3NHLI, Myocardial Function,

Functional Microscopy Unit, Imperial College London, 4Humanitas Clinical and Research Center,

Rozzano, Milano

Nanotechnologies has opened new avenues for the comprehension of physiological processes at nano-

scale levels. Indeed, atomic force microscopy, scanning probe microscopy and scanning tunneling

microscopy provide details of imaging surface and physiological processes at the atomic range.

Notwithstanding, that those techniques provide insights into various cellular function, they necessary

require manipulation, contact or destruction of the samples. In the context of the complex nature of

| 31

cell disease, in addition to the use of multiple conventional methods that address individual questions,

it would be extremely useful to develop a novel universal technique capable of correlating cell

function with morphology, macroscopic structural remodeling in intact tissue, and spatial-temporal

aspects of intracellular signalling or ion channel activity measured in single cells and subcellular

compartments. We have modified scanning ion conductance microscopy invented by Hansma et al . in

hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) to image and analyze surface topography of live

cells without contact with the samples. HPICM and a battery of associated innovative methods are

unique among current imaging techniques, not only in spatial resolution, but also in the rich

combination of imaging modalities with other functional and dynamic methods. Here we describe

HPICM technique as a converging technology to perform highly resolved dynamic and integrative

analysis of cell structure, nanophysiology and mechanisms of cardio and vascular diseases. We have

combined HPICM with i) surface confocal microscopy to study nanoparticles-cell membrane

interaction in lung and cardiac cells[1], with ii) FRET for receptors localization [2] and with localized

intracellular electrode impalement for study myofibroblast membrane potential in the presence of anti-

arrhythmic drugs [3]. Using this technique, we show that the physicochemical nature of nanoparticles

play a pivotal role in modification of cardiac membrane excitability and ion trafficking (Figure 1) by

leading to arrhythmia in clusters of neonatal rat ventricular myocytes. We also describe how 2-

receptors are de-localized from T-tubules to crest in heart failure cells and how in such pathological

conditions it is possible to study the role of myofibroblasts as target cell for cardiac arrhythmia. In

conclusion, HPICM provides a highly informative multimodal imaging platform for functional

analysis of the mechanisms of cell diseases, which should facilitate identification of novel therapeutic

strategies.

Figure1. Topographical height-coded images, obtained by HPICM, of neonatal rat ventricular

myocyte affected by 50 nm carboxyl-modified latex nanoparticles. A. 50 nm nanoparticles induced

life-compatible nanopores in the membrane. B. Zoom in the square area in A (yellow) identifies three

nanopores (a,b,c) with a 50nm profile.

Reference:

M.Miragoli, P.Novak, P. Ruenraroengsak, A.I. Shevchuk, Y.E. Korchev, M.J. Lab, T.Tedley and J. Gorelik. Functional interaction between charged nanoparticles and cardiac tissue: a new paradigm for cardiac arrhythmia? Nanomedicine UK, in

press. M.Miragoli, A.Moshkov, P.Novak, A.Shevchuk, V.O. Nikolaev I.El-Hamamsy, C.M.F. Potter, A.R. Lyon, S.E. Harding. J.A.

Mitchell, A.H Chester, M.J. Lab, Y.E. Korchev, J. Gorelik. Scanning Ion Conductance Microscopy: A Convergent High-

resolution Technology for Multiparametric Analysis of Living Cardiovascular Cells. Journal of Royal Society of Interface. J R Soc Interface. 2011 Jul 6;8(60):913-25. Epub 2011 Feb 16.

Miragoli M, Kadir SH, Sheppard MN, Salvarani N, Virta M, Wells S, Lab MJ, Nikolaev VO, Moshkov A, Hague WM, Rohr S,

Williamson C, Gorelik J. A protective antiarrhythmic role of ursodeoxycholic acid in an in vitro rat model of the cholestatic fetal heart. Hepatology. 2011 Oct;54(4):1282-92.

Corresponding author: Michele Miragoli, CERT c/o Dipartimento di Bioscienze, Address: Viale G.P Usberti 11/A 43124

Parma Tel: 0521905665 Email: [email protected]


32 |

Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein

science; retinoid-binding proteins as an example

L. Franzoni1, F. Baroni

1, D. Cavazzini

2, G. L. Rossi

2, C. Lücke

3

1Department of Biomedical, Biotechnological and Translational Sciences and

2Department of

Biosciences, University of Parma, Italy; 3Max Planck Research Unit for Enzymology of Protein

Folding, Halle (Saale), Germany; 1Plesso Biotecnologico, via Volturno 39, 43125 Parma

Protein science stands at the heart of modern life sciences because it unravels fundamental biological

mechanisms and forms the basis for rapid advances in biomedicine and biotechnology. NMR

spectroscopy is uniquely suited to study various aspects of protein structure, dynamics, molecular

interactions and function, because information for individual residues can be obtained; moreover,

kinetic data, low-populated states and the possible formation of intermediates on the reaction pathway

can be determined.

The case of retinoid-binding proteins is discussed here, as an example. Vitamin A has diverse

biological functions and is essential for human survival. It circulates in blood bound to serum retinol

binding protein (RBP) and is transported into cells by a membrane receptor termed STRA6 (1). The

cellular trafficking and metabolism of vitamin A are regulated primarily by specific high-affinity

carriers called CRBP-I and CRBP-II. They represent an interesting case where structure determination

as well as the study of fast dynamics (ps-ns time scale) (2) failed to elucidate the mode of retinol

binding and thus to explain their diverse tissue distribution, functional roles and different ligand

affinities.

The highly similar structure of the apo and holo forms (a b-

barrel with two short a-helices, see the cartoon) exhibits a

closed conformation in both proteins, that seemingly offer no

access for the ligand. Given the biological relevance of

retinoids, the characterization of their protein interactions and

targeted release is of special interest. To tackle this challenging

subject we have employed a suite of NMR techniques: 15

N

relaxation dispersion experiments to investigate the proteins

dynamics in the slower ms-ms timescale, line-shape analysis of 15

N-HSQC spectra recorded during a retinol titration to get

insights into the mechanism of ligand binding and H/D

exchange experiments to investigate conformational stability.

The results allowed to derive a model of retinol uptake, which

is different for CRBP-I and CRBP-II (3, 4); moreover, a

distinct local flexibility was found to modulate their binding properties (5).

The two proteins deliver retinol to microsomal membrane-bound enzymes, either for esterification

with fatty acids (LRAT) (6, 7) or for oxidation to retinaldehyde (RDH) (8). Our current understanding

of these processes remains incomplete, but there is evidence that the membrane microenvironment

plays a role in the interactions of holo CRBPs with enzymes (8). To address this hypothesis, we have

performed a series of NMR experiments with retinol-bound CRBP-I and CRBP-II in the presence of

model membranes composed of either anionic or zwitterionic phospholipids, at varying protein:lipid

molar ratios and ionic strength.

Both homologues interact with liposomes of anionic phospholipids, but in a significantly different

way (9). A conformational rearrangement of the portal region, coupled to a change in protein

dynamics, are required for retinol exchange; these processes seem to be triggered by a membrane-

collision.

All the differences between CRBP-I and CRBP-II, when dissolved either in buffer or in the presence

| 33

of biomembrane mimetic systems, may account for their distinct functional roles in the modulation of

intracellular retinoid metabolism. Further experiments are in progress to better describe the ongoing

processes in a biological context.

References

(1) Kawaguchi R., Yu J., Honda J., Hu J., Whitelegge J., Ping P., Wiita P., Bok D., Sun H. (2007) Science, 315, 820-825.

(2) Franzoni L., Lücke C., Pérez C., Cavazzini D., Rademacher M., Ludwig C., Spisni A., Rossi G.L., Rüterjans H. (2002) J. Biol. Chem., 277, 21983-21997.

(3) Mittag T., Franzoni L., Cavazzini D., Schaffhausen B., Rossi G.L., Günther U.L. (2006) J. Am. Chem. Soc., 128, 9844-

9848. (4) Franzoni L., Reed M., Cavazzini D., Rossi G.L., Günther U.L., in preparation.

(5) Franzoni L., Cavazzini D., Rossi G.L., Lücke C. (2010) J. Lipid Res., 51, 1332-1343.

(6) Amengual J., Golczak M., Palczewski K., von Lintig J. (2012) J. Biol. Chem., 287, 24216-24227. (7) Jiang W., Napoli J.L. (2012) Biochim. Biophys. Acta, 1820, 859-869.

(8) Napoli J.L. (2012) Biochim. Biophys. Acta, 1821, 152-167.

(9) Franzoni L., Baroni F., Cavazzini D., Rossi G.L., Lücke C., in preparation.

0521-033823; [email protected]

Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for

environmental remediation

L. Pane, E. Giacco, G. L. Mariottini

Department of Earth, Environment and Life Sciences (DISTAV), University of Genova,

In the framework of the “Risk Assessment” procedure for the ecotoxicological evaluation of

compounds used in the aquatic environment, tests with target species have been carried out. This

paper reports the results concerning the evaluation on cladocerans Daphnia magna of the acute

toxicity of F-500 micelle encapsulator (Hazard Control Inc., USA), a mixture of ionic and non-ionic

surfactants based on fatty acid esters with aliphatic polyalcohols in watery solution used as fire fighter

agent as well as dispersant against hydrocarbon pollution, with the purpose to verify its compatibility

for the aquatic environment and its potential usefulness for the remediation of soils polluted with

hydrocarbons. F-500 has been indicated to be able to reduce hydrocarbon concentrations within the

soil environment and therefore to be active for soil remediation [1]. As a matter of fact, F-500 has

high affinity for soil particles and was demonstrated that 0.1% F.500 solutions are adsorbed almost

completely (>99%) in soils; furthermore, after elution of soil with water less than 1% of F-500 was

found into the eluate [2]. For ecotoxicological tests the artificial soil was prepared according to

standardized procedures [3]. Soil constituents were previously dried and subsequently dampened with

deionized water in order to obtain 40-60% of the maximum water retention. The artificial soil was

treated with commercial diesel and with F-500 at the concentration (1.5%) known to be non-toxic for

the organisms [4], packed up in 5 cm diameter glass columns and subsequently eluted with deionized

water to obtain the eluate, according to the EPA method [5]. The elutriate was obtained placing soil

aliquots and deionized water (1:4) in glass beakers and stirring them for 1 hour [5, 6]. For both eluate

and elutriate testings the following four samples were prepared and subsequently tested: 1) control

(only soil), 2) soil + diesel, 3) soil + 1.5% F-500, 4) soil + diesel + 1.5% F-500. Two different tests

were carried out with the eluate using two different amounts of both compounds (Test A: Diesel 10

ml, F-500 5 ml. Test B: Diesel 20 ml, F-500 10 ml), thus maintaining unchanged the Diesel/F-500 rate

(2:1). Four different tests were carried out with the elutriate maintaining unchanged the diesel amount

and varying the diesel:F-500 rate, namely 2:1 (A), 1:1 (B), 1:2 (C), 1:4(D). Daphnia magna

specimens have been obtained from Daphtoxokit ephippia (Microtox, Milano, Italy; batch

DM281009) and maintained at 25 2°C in aerated and properly screened mineral water supplemented

with 0.45 m-filtered 1:100 CaCl2 solution and 0.45 m-filtered 1:100 NaHCO3 solution. Before the

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17255476&ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum


34 |

test 30 Daphnia magna females were isolated and maintained starved for 24 hours; the offspring born

during this period were used in the test and exposed for 24 hours at 20±2°C, 16:8 light:dark period, to

the eluates and to the elutriates in multiwell plates with polyethilene inserts provided with 74 mm

porosity basal membrane (NetwellTM

Corning, NY, USA). Five organisms per test in quadruplicate

against control test were utilized. The tested F-500 concentrations were chosen considering the results

of preliminary assays. The acute toxicity was evaluated estimating as end-point the percent

immobilization of treated newborn specimens after 10 sec. according to OECD [7].

The results of tests are shown in table 1 (a, b). The data confirm that F-500 is not toxic to daphnids

and show clearly that mixing F-500 to a soil pollutant (commercial diesel) the acute toxicity induced

by eluates and elutriates on cladocerans decreases remarkably. This allows to confirm the

ecocompatibility of F-500 and its suitability for soil remediation.

F-500 is an easy-to-use compound useful for the remediation of soils and effective mainly under

aerobic conditions; it is able to improve the biological degradation of contaminants by natural

microbial populations as well as to stimulate the biodegradation reducing the toxicity of the

environmental pollutants or making them innocuous. F F-500 allows to restore the usage of the treated

areas accelerating the self-regeneration of contaminated soils and restoring rapidly the ecological

equilibrium (http://www.fctservices.co.uk/F-500-land-application/).

a

Test Control F-500 1.5% Diesel Diesel + F-500 1.5%

A 6.0 8.9 0 31.8 24.4 12.7 20.0

B 0 5.0 0 46.7 17.5 16.7 12.5

b

A 0 0 70.0 14.1 70.0 14.1

B 0 0 30.0 14.1 40.0 28.2

C 2.0 4.5 0 70.0 7.0 31.8 23.5

D 2.0 4.5 0 70.0 7.0 16.0 14.0 Table 1. Percent immobilization of Daphnia magna exposed to different amounts of contaminated soil eluate (a)

and elutriate (b).

Furthermore, the overall ecocompatibility [4, 9] and the low toxicity against marine crustaceans and

fish [4, 10, 11] of F-500, evaluated through standardized parameters [8], are known. The tests carried

out in this study have shown an evident decrease of the toxicity in soils treated with diesel + F-500 in

comparison to those treated with only diesel. This result is supposed to be due to the power of the

compound to encapsulate the hydrocarbon molecules maintaining them in watery solution and

consequently making them more accessible for the remediation process and decreasing both their

toxicity and bio-availability. Like this, the hydrocarbons could be made less available to the

organisms thus resulting less toxic. Therefore, the results show a potential protective effect of F-500

against the damage exerted by pollution on aquatic organisms and, as recently reported [1], the

suitability of this compound to counteract the hydrocarbon contamination of soil.

References

[1] Alberta Environment and Patch H2S Services Limited 2010. F-500: Canadian Testing. Case Study Testing. Details of

tests completed in Canada utilising F-500 in various contaminated land scenarios. http://www.fctservices.co.uk/docs/Alberta-and-Patch-tests.pdf

[2] National Industrial Chemicals Notification and Assessment Scheme (NICNAS) 2004. Full public report. Chemical in F-

500. Australian Government Publishing Service, Canberra. File No: EX/42(NA/976): 23 pp. http://www.nicnas.gov.au/publications/car/new/ex/exfullr/ex0000fr/ex42fr.pdf

[3] OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) 1984. Guidelines for testing of chemicals No. 207.

Earthworm, acute toxicity test. OECD, Paris.

[4] Giacco E., Mariottini G.L., Pane L. 2008. Valutazione ecotossicologica del prodotto estinguente F-500 su organismi

d’acqua dolce appartenenti a diversi livelli trofici. XVIII Congresso della Società Italiana di Ecologia, “Ecologia,

emergenza, pianificazione”. Riassunti (a cura di G. Benassi, G. Giordani, P. Viaroli), Parma 1-3 settembre 2008. P.10.5 144-145.

[5] EPA 2001. Methods for collection, storage and manipulation of sediments for chemical and toxicological analyses:

Technical Manual. EPA-823-B-01-002 Oct. 2001. Chapter 5, Pp. 14-15. [6] APAT 2002. Guida tecnica su metodi di analisi per il suolo e i siti contaminati. Utilizzo di indicatori ecotossicologici e

biologici. P. Nappi, C. Jacomini (APAT)RTI CTN_SSC 2/2002.

[7] OECD (2004). Guideline for testing of chemicals. "Daphnia sp., acute immobilisation test and reproduction test". Guideline 202.

[8] GESAMP 2002. The revised GESAMP hazard evaluation procedure, Report and Studies n. 64.

http://www.fctservices.co.uk/F-500-land-application/

http://www.fctservices.co.uk/docs/Alberta-and-Patch-tests.pdf

http://www.nicnas.gov.au/publications/car/new/ex/exfullr/ex0000fr/ex42fr.pdf

| 35

[9] Clemson Final Report: Tiwet-Project – 09440 1997. A study of the physical properties, biological effects and possible

usages of F-500 in environmental protection and restoration. The Institute of Wildlife and Environmental Toxicology

Clemson University Pendleton, SC 29670 George P. Cobb, Section Leader Analytical Toxicology.

[10] EPA 2002. Oil Program Center. Technical Product Bulletin sw-30. [11] ARPA Ferrara 2005. Rapporto di prova 002971/05/FE.

Corresponding author: Luigi Pane - Department of Earth, Environment and Life Sciences (DISTAV), University of Genova,

Viale Benedetto XV 5, 16132 Genova, Italy. Tel. +390103538071; email: [email protected]

A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-

resolution microscopy

C. Mandalari1,*

, A. Losi1, W. Gärtner

2, S. Raffelberg

2, F. Cella Zanacchi

3, P. Bianchini

3, A. Diaspro

3,

S. Abbruzzetti1,4

, C. Viappiani1,4

1Dipartimento di Fisica, Parma,

2Max-Planck-Institute for Bioinorganic Chemistry, Mülheim a.d.

Ruhr, Germany, 3Istituto Italiano di Tecnologia, Genova,

4NEST, Istituto Nanoscienze-CNR

We introduce a novel fluorescent reporter for super-resolution microscopy, based on the bacterial

photoreceptor YtvA [1]. YtvA (from Bacillus subtilis) comprises a photosensitive flavin based LOV

domain, efficiently photo-switchable between fluorescent and non fluorescent states [2]. The

remarkable thermal and photochemical stability of YtvA and its excellently suited properties for

imaging make flavin-binding LOV domains a powerful new class of autofluorescent proteins, which

adds to the already available GFPs toolbox. We demonstrate FPALM studies of live Escherichia coli

cells, expressing YtvA molecules (Figura 1).

Figura 1: A comparison between the conventional wide-field fluorescence image (Fig. 1a,b) and the FPALM image (Fig. 1c)

shows the remarkable resolution improvement and clearly demonstrates the suitability of YtvA for super-resolution applications

in cells.

References:

1. A. Losi, A. and W. Gärtner, Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in LOV and BLUF photoreceptors. Photochem. Photobiol., 2011, 87, 491 510.

2. The LOV2 domain of phototropin: a reversible photochromic switch. J.T.M. Kennis, I.H.M. van Stokkum, S. Crosson, M.

Gauden, K. Moffat, and R. van Grondelle, J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 4512 4513.

*Corresponding author: University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics and Earth Sciences, viale G.P. Usberti

7/A, 43100-Parma (I) Tel: +39-0521905256, e-mail: [email protected]



36 |

Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by

means of molecular dynamics simulations

E. Polverini1*

, M. De Donatis1 and G. Harauz

2

1Department of Physics and Earth Science - University of Parma, Parma, Italy,

2Department of

Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada.

Myelin basic protein (MBP) is a highly basic multifunctional protein of the central nervous system,

whose principal role is to maintain the compactness and integrity of the myelin sheath, acting as a

“biological glue”. Because of its involvement in human demyelinating diseases, the investigation of

the interaction of MBP with membrane is particularly relevant. The three-dimensional structure of

MBP is still unknown, due to its intrinsic flexibility and dependence of conformation on environment

and on its multiple biological roles. However, three regions of the protein can potentially be

amphipathic alpha-helices [1] and, therefore, are good candidates as interaction sites with membranes.

In this study, we investigate the first, N-terminal region, ranging from residue R29 to G48 (murine

sequence numbering), which also contains a double Phe-Phe site that can strongly contribute to anchor

this segment to the membrane. Molecular dynamics (MD) simulations were performed on this peptide

in the presence of both neutral (DMPC) and mixed neutral-negatively charged (DMPC-DMPS) lipid

bilayer, to explore the effects of the electrostatic driving force. The results show a tilt and a deep

penetration of the amphipathic helix into the DMPC membrane, anchored by its hydrophobic surface.

In the mixed DMPC-DMPS bilayer, instead, the peptide remains more at the membrane surface, due

to the stronger electrostatic interaction of MBP charged residues with the charges of the lipidic

headgroups. In both cases, the helix conformation is very stable and strongly anchors the peptide to

the membrane.

Several post-translational modifications (PTMs) are known to be present all along the whole protein,

acting as a “molecular barcode” that modulates the interaction of MBP with membrane or with

signaling proteins. Among these, the more studied are the arginine deimination and the

serine/threonine phosphorylation, also present in R29-G48 peptide. In particular, deimination seems to

limits MBP’s ability to maintain compact myelin and correlates strongly with disease severity. In this

context, the effect of R31 deimination on the conformation and membrane interaction of R29-G48

fragment was investigated by MD, both in the neutral and in the mixed bilayer system. While in

neutral lipids the arginine modification does not influence the depth and the tilt of the helix in respect

of the unmodified peptide, in the DMPC-DMPS mixed bilayer it causes the exposition to the solvent

of the region around the deimination itself and, at the same time, the tilt of the N-terminal side of the

helix, that consequently becomes less deeply inserted.

The exposition by deimination was already experimentally observed for the second putative

-helix region (V83-T92), that is the primary immunodominant epitope, and this effect

was supposed to trigger the initiation of autoimmune response in MS patients [2]. Our results are in

agreement with this behavior and not only support the hypothesis of R29-G48 as a membrane

interaction site in MBP, but also underline the importance of simulating the negative charges present

at the membrane surface to take into account the effect of the electrostatic driving force. This is

particularly relevant for studying the post-translational modifications that, like the deimination,

change the net charge of the molecule.

References

[1] G. Harauz, V. Ladizhansky, J.M. Boggs, Structural polymorphism and multifunctionality of Myelin Basic Protein,

Biochemistry, 2009, 48: 8094-8104. [2] A.A. Musse, J.M. Boggs, G. Harauz, Deimination of membrane-bound myelin basic protein in multiple sclerosis exposes an

immunodominant epitope, PNAS, 2006, 103: 4422-4427.

* Corresponding author: Eugenia Polverini, Dipartimento di Fisica e Scienze della Terra, Parco Area delle scienze 7/A, 43124

Parma, Italia. Phone: +39 0521 905254. E-mail: [email protected]


| 37

Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by

site-directed mutagenesis

A. Losi1,*

, S. Raffelberg2, C. Mandalari

1, W. Gärtner

2, C. Viappiani

1, S. Abbruzzetti

1

1: Dept. of Physics and Earth Sciences, Univ. of Parma (Italy), www.unipr.it, 2

: Max Planck Institute

for Chemical Energy Conversion, Mülheim (Germany)

The non-covalently bound flavin chromophore in blue light-sensing LOV domain proteins is

stabilized through an extended hydrogen-bonding network. Preferential interactions take place

between the C(2)=O, N(3)H, C(4)=O, and N(5) groups and a conserved bunch of glutamine and

asparagine residues (1). Less conserved aminoacids establish interactions with the apolar part of the

isoalloxazine ring. This extended network of weak interactions renders the chromophore cavity

extremely rigid and may affect both spectral properties and dynamics of the photocycle that involve

the reversible formation of a covalent FMN-cysteine adduct. In this work we studied the influence of

the network of weak interactions on the efficiency, kinetics, and energetics of a LOV protein

photocycle, specifically the protein YtvA from Bacillus subtilis. By means of site-directed

mutagenesis, aimed to change the interactions at the polar and/or apolar sides of the flavin

chromophore, and an array of biophysical techniques, we show that it is possible to modulate the

fluorescence and photocycle quantum yields, the spectral properties in the UVA region, the dynamics

of excited states and the thermal relaxation to the dark-adapted state. All mutated proteins investigated

exhibit blue-light driven formation of the FMN-cys adduct, but can be driven into a dark/adduct

photoequilibrium by illumination with UVA/violet light. The results reported here have implications

for understanding the mechanisms underlying thermal recovery and for advanced biophysical

applications such as super-resolution fluorescence microscopy (nanoscopy, Losi et al., 2012).

References

1. S. Raffelberg, M. Mansurova, W. Gärtner and A. Losi, Modulation of the photocycle of a LOV domain photoreceptor by the

hydrogen bonding network, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 5346-5356.

2. A. Losi, W. Gärtner, S. Raffelberg, F. Cella Zanacchi, P.Bianchini, A. Diaspro, C. Mandalari, S. Abbruzzetti and C.

Viappiani, A photochromic bacterial photoreceptor with potential for super-resolution microscopy, Photochem. Photobiol. Sci,

2012, DOI: 10.1039/c2pp25254f

*Corresponding author: University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics and Earth Sciences, viale G.P. Usberti

7/A, 43100-Parma (I), Tel: +39-0521905293, e-mail: [email protected]

Aspetti non-algoritmici della biologia quantistica

P. Zizzi (Dipartimento di Psicologia, Università di Pavia)

I sistemi biologici sono sistemi complessi particolari: la complessità biologica è basata

sull’informazione [1]. La Biologia Quantistica [2] studia i fenomeni quantistici che avvengono a

livello molecolare, quali, ad esempio, la sovrapposizione quantistica e l’effetto tunnel [ 3], e

l’entanglement [4].

Pertanto, un sistema biologico quantistico sarà un sistema con una complessità basata sull’

informazione quantistica, e sarà quindi possibile sede di processi quanto-computazionali. .

I fenomeni quantistici prettamente quanto-computazionali come la sovrapposizione quantistica e l’

entanglement, sono descrivibili da una speciale logica quantistica del qubit, denominata Lq [5].

Quest’ ultima è stata utilizzata per descrivere formalmente i processi mentali quantistici dell’

inconscio [6] nell’ ambito della teoria quantistica della mente di Penrose-Hameroff [7], dove le unità

fondamentali di computazione quantistica (i qubits) sono le tubuline del cervello.

http://www.unipr.it/


38 |

Come ogni logica dotata di interpretazione (semantica) anche Lq ha un suo metalinguaggio, che in più

è quantistico (QML = Quantum Meta-Language) [5].

E’ noto che tramite un metalinguaggio, è possibile formulare una proposizione di Goedel G: “ G è

vera ma non dimostrabile”.

Come suggerito da Penrose [8], G indica la presenza di un aspetto non-algoritmico della mente

umana. Infatti il matematico, tramite l’ intuito matematico, riesce a cogliere la verità di G anche senza

doverla dimostrare, mentre un computer non può. Quello che cambia a livello quantistico è che Gq è

vera con una certa probabilità e indimostrabile con una certa probabilità [9].

In altri termini, la mente umana a livello quantistico (e dunque inconscio) ha alcuni aspetti

probabilmente non-algoritmici, nel senso che c’è una certa probabilità di riuscire ad intuire la verità di

Gq, e una certa probabilità di riuscire a dimostrarla, e maggiore è l’ incertezza in un senso, minore è

nell’altro. Questo è stato lo studio svolto sugli aspetti non-algoritmici della Biologia Quantistica per

quanto riguarda il sistema nervoso a livello di macro-molecole (tubuline). Crediamo, comunque, che

ci siano aspetti non-algoritmici anche nella genetica, sempre a livello di macro-molecole (DNA).

Più in generale, qui facciamo l’ ipotesi che tutti i fenomeni biologici “ad alto livello” (come il

linguaggio, l’ apprendimento e la percezione a livello nervoso) e alcuni a livello genetico siano

descrivibili non solo da un linguaggio logico, ma anche da un meta-linguaggio. Quello che distingue il

cervello da un computer è il meta-linguaggio, e crediamo che anche ciò che distingue la vita da una

chimica complessa è il metalinguaggio, che la genetica ha, mentre la chimica non ha.

Il DNA non è mera informazione, ma neanche solamente elaborazione dell’ informazione stessa .

Il DNA fornisce istruzioni algoritmiche per costruire la cellula, ma tali algoritmi possono essere

eseguiti solo nel contesto dato dall’ ambiente cellulare. Quindi il DNA è un computer, più un aspetto

contestuale o funzionale [10] , che riguarda l’ informazione semantica dei fenomeni ad alto livello e

quindi il meta-linguaggio.

A livello quantistico, il DNA può essere visto come un computer quantistico [11], che computa ad

altissima velocità grazie alla sovrapposizione quantistica e all’entanglement. Quindi, anche il DNA

dovrà essere descritto da una logica di tipo Lq, e avrà il suo metalinguaggio quantistico.

Il fatto che l’ informazione genetica sia contestuale, non permette di adottare, nel calcolo logico dei

sequenti, la visibilità delle formule attive (indipendenza dal contesto) come invece è stato fatto nel

caso della logica della mente quantistica.

Si consideri il sequente: 2

A , dove A, l’ “antecedente” del sequente è una formula attiva (un

algoritmo), il simbolo indica il link metalinguistica “comporta” (un processo o trasformazione),

è il “conseguente”, ovvero il prodotto della trasformazione, e 2

, il modulo quadro del numero

complesso , che è il grado di asserzione della asserzione “A è vera”, è la probabilità che tale

processo avvenga.

Un tale tipo di sequente è stato usato nel calcolo deduttivo di Lq, dove per semplicità, la formula

attiva A era stata considerata indipendente da ogni contesto iniziale (che in logica sta per una

sequenza finita di proposizioni) la cui interpretazione chimico-fisica potrebbe essere quella dell’

ambiente e delle condizioni iniziali. In tal caso la formula attiva A viene detta “visibile”.

Nel caso della genetica, l’ algoritmo A non è più pensabile come indipendente dal contesto , e

quindi il sequente diventa: 2

)(, A , dove la formula attiva A dipende dal contesto , e

quindi non è più “visibile”, e la probabilità del processo 2

)( dipende dal contesto .

Questo vuol dire che un algoritmo genetico non è “visibile” nel senso che non può venire eseguito se

non nel contesto appropriato.

Comunque, nell’ambito della genetica quantistica, la proposizione di Goedel quantistica, Gq,

porterebbe ad un aspetto probabilisticamente non-algoritmico forse ancora più interessante (almeno a

| 39

livello teorico) di quello riguardante il sistema nervoso.

Infatti, il carattere probabilistico di Gq induce, nel contesto della genetica, alla formulazione di un

principio di indeterminazione quantistico-logico tra l’ incertezza sull’ esistenza della vita V (verità

logica) e l’ incertezza della sua produzione VP a partire da dati iniziali e regole formali

(dimostrazione logica): 1VPV .

Si ricorda qui che il teorema di incompletezza classico di Goedel prevede un’ incertezza V

praticamente nulla (la verità di G è certa), mentre prevede un’ incertezza VP praticamente infinita

(la dimostrazione di G è impossibile).

Nel caso quantistico, invece, c’ è un’ incertezza non nulla (grandissima probabilità) sulla verità di Gq

(sulla presenza della vita) e un’ incertezza non infinita, ma sempre grandissima (piccolissima

probabilità) sulla dimostrabilità di Gq (sulla possibilità di produrre la vita).

Questo spiegherebbe perché la vita, pur avendo una piccolissima probabilità di essere originata, lo è

stata, infatti, sulla terra, forse grazie all’enorme quantità di dati iniziali primordiali, mentre risulta

altamente improbabile poter riuscire a riprodurla in laboratorio, avendo a disposizione solo una

quantità limitata di dati iniziali. Bisogna anche dire che il carattere contestuale stesso della

computazione del DNA rende quasi impossibile poter preparare in laboratorio quel preciso contesto

che renda esecutivo quel dato algoritmo, perché la dinamica del sistema e il contenuto informativo

dello stato biologico sono fortemente accoppiati e si influenzano continuamente a vicenda.

Questa risposta parziale al problema della biogenesi 12] ovvero quello di poter scoprire un percorso

che conduca dalla non-vita alla vita, è comunque negativa, come lo sono del resto i meta-teoremi d’

incompletezza di Goedel riguardo al sogno di Hilbert, di riuscire ad avere un sistema formale

consistente e completo (dove tutte le verità sono dimostrabili).

Bibliografia

[1] E. Schrödinger, What is Life? (Cambridge University Press, Cambridge, 1944).

[2] J. McFadden, Quantum Biology (Norton, New York, 2001).

[3] A. Patel, “Why genetic information processing could have a quantum basis,” J. Biosci. 26,145-51 (2001). [4] Hefeng Wang and Sabre Kais. Quantum entanglement and electron correlation in molecular systems. Israel Journal of

Chemistry, 47(1):59–65, 2007.

[5] Paola Zizzi, “From Quantum Metalanguage to the Logic of Qubits”. PhD Thesis, arXiv:1003.5976 (2010).

[6] Paola Zizzi, When Humans Do Compute Quantum. In: A Computable Universe, Hector Zenil (Ed), Word Scientific

Publishing (2012). Forthcoming.

[7] S. Hameroff, R. Penrose,(1995) Orchestrated reduction of quantum coherence in brain microtubules: A model for consciousness. Neural Network World, Vol. 5(5): 793-804;

S.R. Hameroff, “Quantum coherence in microtubules: a neural basis for emergent consciousness?” Journal of

Consciousness Studies 1, 98–118 (1994); T.J.A.Craddock, C.Beauchemin, J.A.Tuszynski (2009), Information processing mechanisms in microtubules at

physiological temperature: model predictions for experimental test. BioSystems, vol. 97, 28-34.

[8] R. Penrose, Shadows of the Mind. Oxford University Press, London 1995. [9] Paola Zizzi and Massimo Pregnolato. The Non-Algorithmic Side of the Mind. Quantum Biosystems 2012; 4 (1): 1-8.

[10] Sara Imari Walker and Paul C.W Davies, The Algorithmic Origins of Life. arXiv:1207.4803 (2012). [11] J.McFadden, J.Al-Khalili (1999). A quantum mechanical model of adaptive mutation. BioSystems, vol.50, 203-211.

[12] P.C.W. Davies, The Origin of Life (Penguin, London, 2003); The Fifth Miracle (Simon & Schuster, New York, 1998).

Corresponding author: Paola Zizzi - Dipartimento di Psicologia, Università di Pavia,

Piazza Botta, 6, 27100 Pavia, Tel: 3475300467, [email protected]

Verso un modello generale della dinamica del citoscheletro

E. Pessa (Dipartimento di Scienze Comportamentali e del Cervello Università di Pavia)

Nel corso degli ultimi anni si è assistito ad un aumento dell’interesse nei confronti della dinamica del

citoscheletro, fomentato dalle teorie di Hameroff e Penrose sul ruolo che eventuali processi quantistici

riguardanti i microtubuli potrebbero avere nello spiegare i fenomeni connessi all’attività cognitiva e,

più in generale, alla coscienza (vedi, ad esempio, [1], [2], [3]). Data la difficoltà di effettuare


40 |

esperimenti in grado di confermare o smentire la validità di queste proposte teoriche, si rende

necessaria la costruzione di modelli della dinamica del citoscheletro che consentano la previsione di

effetti sperimentalmente verificabili. Attualmente tale costruzione risulta assai difficile, data, da un

lato, la complessità della struttura del citoscheletro e, dall’altra, l’esistenza di grosse limitazioni legate

alla simulazione di processi quantistici. In tutte le proposte di tipo modellistico finora introdotte si è

considerato il citoscheletro come una rete di biopolimeri comprendente tre tipi principali di filamenti

(vedi per una rassegna [4]): quelli di actina, i microtubuli e i filamenti intermedi. Di solito questi

ultimi vengono trascurati, dato che sembrano giocare solo un ruolo passivo di rinforzo. Quasi tutti i

modelli sono basati su descrizioni di tipo classico, focalizzate sull’idrodinamica macroscopica della

cellula, e si concentrano principalmente sugli aspetti reologici del citoscheletro, legati al ruolo del

citoscheletro nel determinare le proprietà meccaniche della cellula (vedi per rassegne [5], [6]). Alcuni

di questi modelli sono ispirati ad una teoria generale riguardante la materia biologica, nota come

teoria della tensegrità, proposta da Ingber fin dagli anni Ottanta (vedi per una sintesi [7]). Tale teoria

postula che tutte le strutture biologiche, su qualunque scala, garantiscano la stabilità della loro forma,

nonché la capacità di eseguire movimenti in modo coordinato grazie all’azione combinata di forze di

tensione e di compressione esercitate localmente. In particolare, nel citoscheletro le tensioni sarebbero

supportate dai filamenti di actina mentre i microtubuli sarebbero responsabili delle compressioni (per

un esempio di modello del citoscheletro basato sulla tensegrità vedi [8]).

In presenza di questo quadro teorico, in questo contributo viene proposto un nuovo modello della

dinamica del citoscheletro che, focalizzandosi sulla dinamica di una rete di microtubuli quantistici

interagenti, ricava le proprietà meccaniche del citoscheletro stesso in termini della risposta globale di

questa rete, vista come un insieme di motori molecolari, ricorrendo ai modelli che collegano il

comportamento globale dei filamenti di actina allo spettro di frequenza delle forze prodotte dai motori

in questione (vedi in proposito il modello già citato in [5]). Nello specifico, il modello è stato

progettato per descrivere il citoscheletro delle cellule neuronali, nelle quali i microtubuli formano

aggregati coerenti, in cui tutti i microtubuli hanno la stessa direzione, generalmente parallela a quella

della membrana cellulare (come in prossimità delle zone assonali). Questo permette di limitarsi a

considerare reti di microtubuli praticamente monodimensionali o, al massimo, bidimensionali.

Basandosi sulle ricerche fondamentali di Tuszynski et al. sui processi quantistici che hanno luogo nei

microtubuli (vedi per rassegne [9], [10]), l’attività di ogni microtubulo è stata descritta tramite un

processo markoviano quantistico continuo nel tempo (vedi su questi processi [11]), governato dalle

interazioni con l’uscita dei microtubuli spazialmente vicini, ma in cui l’uscita del segnale prodotto dal

microtubulo considerato avviene in un tempo che dipende dalla lunghezza del microtubulo stesso.

Tale lunghezza viene considerata variabile, come avviene nei microtubuli reali, e descritta da leggi di

variazione già individuate in letteratura (vedi [12], [13]). In aggiunta a tali interazioni, differentemente

da altri modelli, viene aggiunta anche l’interazione tra i microtubuli e il liquido intracellulare in cui

sono immersi. Infatti quest’ultima è responsabile della formazione nel liquido di domini coerenti che

possono fungere da ‘memoria temporanea’ dell’informazione veicolata dai microtubuli. Per questo il

liquido viene rappresentato come un sistema di spin interagenti (rappresentanti i dipoli elettrici in esso

contenuti), con interazioni tra primi vicini. Non sono state invece prese in considerazione le molecole

di tubulina rimaste nel citoscheletro dopo la disgregazione di un singolo microtubulo, dato che recenti

modelli (vedi [14]) hanno evidenziato come questa circostanza sia di secondaria importanza ai fini

della evoluzione dinamica del sistema dei microtubuli.

Le simulazioni su computer del modello, finora condotte su sistemi comprendenti alcune centinaia di

microtubuli, hanno rivelato due aspetti critici: 1) le proprietà reologiche del citoscheletro finora

osservate si possono ottenere solo con una scelta assai accurata dei valori dei parametri del modello, il

che farebbe supporre che tali proprietà siano prive di generalità; 2) non compare nessuna influenza

particolarmente significativa del carattere quantistico della dinamica dei microtubuli, tranne il caso in

cui le interazioni tra i microtubuli e il liquido intracellulare siano particolarmente intense. Queste

circostanze suggeriscono, da un lato, la necessità di una riflessione sulle teorie finora proposte

relativamente al ruolo del citoscheletro e, dall’altro, l’opportunità di una estensione del modello che

eviti approssimazioni troppo spinte di una realtà biologica assai complessa. In ogni caso, le

| 41

simulazioni condotte e l’esame critico dei loro risultati costituiscono un passo necessario nella

direzione di un costruzione di una teoria generale della dinamica del citoscheletro.

Bibliografia [1] Penrose R (1994) Shadows of the Mind. A Search for the Missing Science of Consciousness. New York: Oxford University

Press. [2] Hameroff SR (1994) Quantum Coherence In Microtubules: A Neural Basis For Emergent Consciousness? Journal of

Consciousness Studies, 1: 91.118.

[3] Hameroff SR, Penrose R (1996) Orchestrated reduction of quantum coherence in brain microtubules: a model for consciousness. In Toward a Science of Consciousness - The First Tucson Discussions and Debates, edited by: Hameroff SR,

Kaszniak A, Scott AC. Cambridge, MA, USA: MIT Press.; 507-540.

[4] Pullarkat, P.A., Fernández, P.A., Ott, A. (2007). Rheological properties of the Eukariotic cell cytoskeleton. Physics Reports, 449: 29-53.

[5] Levine, A.J., MacKintosh, F.C. (2009). The mechanics and fluctuation spectrum of active gels. Journal of Physical Chemistry B, 113: 3820-3830.

[6] Ramaswamy, S. (2010). The mechanics and statistics of active matter. Annual Review of Condensed Matter Physics, 1:

323-345. [7] Ingber, D.E., Heidemann, S.R., Lamoureux, P., Buxbaum, R.E. (2000). Opposing views on tensegrity as a structural

framework for understanding cell mechanics. Journal of Applied Physiology, 89: 1663-1678.

[8] Cañadas, P., Laurent, V.M., Oddou, C., Isabey, D., Wendling, S. (2002). A cellular tensegrity model to analyse the

structural viscoelasticity of the Cytoskeleton. Journal of Theoretical Biology, 218: 155-173.

[9] Tuszynski JA, Brown JA, Crawford E, Carpenter EJ, Nip MLA, Dixon JM, Sataric MV (2005) Molecular Dynamics

simulations of tubulin structure and calculations of electrostatic properties of microtubules. Mathematical and Computer Modelling, 41: 1055-1070.

[10] Craddock TJA, Tuszynski JA (2010) A critical assessment of the information processing capabilities of neuronal

microtubules using coherent excitations. Journal of Biological Physics, 36: 53-70. [11] Mülken, O., Blumen, A. (2011). Continuous-time quantum walks: Models for coherent transport on complex networks.

Physics Reports, 502: 37-87.

[12] Deymier, P.A., Yang, Y., Hoying, J. (2005). Effect of tubulin diffusion on polymerization of microtubules. Physical Review E, 72: 021906, 1-7.

[13] Baulin, V.A., Marques, C.M., Thalmann, F. (2007). Collision induced spatial organization of microtubules. Biophysical

Chemistry, 128: 231-244. [14] Glade, N. (2012). On the nature and shape of tubulin trails: Implications on microtubule self-organization. Acta

Biotheoretica, 60: 55-82.

Corresponding author: Eliano Pessa - Dipartimento di Scienze Comportamentali e del Cervello, Università di Pavia Piazza

Botta, 11, 27100 Pavia, Italy, tel. +39-0382986276, [email protected]

Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di malta

A. Rosaa, A. Rescigno

a, A. Piras

b, A. Atzeri

a, P. Scano

b, S. Porcedda

b, P. Zucca

a, M. A. Dessì

a

aDip. Scienze Biomediche,

bDip. Scienze Chimiche e Geologiche, Università degli Studi di Cagliari,

Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39

70 675 4124; e-mail: [email protected].

I grassi e gli oli hanno un ruolo importante nell'industria alimentare e farmaceutica. Vi è un crescente

interesse per le caratteristiche dei lipidi di oli vegetali non convenzionali come fonte di componenti

bioattivi e nutrienti funzionali1.

Il Cynomorium coccineum L. è una pianta non-fotosintetica, perenne e parassita, della famiglia delle

Cynomoriaceae, presente in diversi paesi del Bacino del mediterraneo (Spagna, Corsica, Sardegna,

Sicilia, Malta e Creta), nella costa africana occidentale e Penisola Araba2-4

. È conosciuta con nomi

diversi, tra i più comuni Fungo melitensis, Champignon o Éponge de Malt, Fungo di Malta e Tarthuth

nei paesi arabi2-4

. Le proprietà terapeutiche del Fungo di Malta sono state tenute in grande

considerazione nel corso dei secoli. È stato ampiamente utilizzato in molte culture come rimedio

medicinale per la cura di ulcere, emorragie, dissenteria, impotenza, disordini mestruali e infezioni2-4

.

Studi in vitro e in modelli animali hanno evidenziato proprietà antiemorroidali, antiossidanti,

afrodisiache, toniche, antivomitive, ipotensive e di stimolazione della spermatogenesi, degli estratti

ottenuti da questa pianta2-5

. In letteratura si trovano esempi sull'uso del C. coccineum come cibo

durante i periodi di carestia.



42 |

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di evidenziare eventuali proprietà funzionali e potenziali

effetti benefici sulla salute umana correlabili al consumo dell’olio ottenuto dal fungo di Malta. A tal

fine, attraverso l’azione congiunta di diversi gruppi di ricerca, sono state studiate la composizione

chimica e l'attività biologica dell’olio fisso

isolato dal Fungo di Malta (Figura 1A)

raccolto in Sardegna6. L'olio è stato

ottenuto mediante estrazione con anidride

carbonica in fase supercritica (CO2-SFE)6.

La CO2-SFE è una tecnica di estrazione

rispettosa dell'ambiente, utilizzata

industrialmente per l’ottenimento di oli

essenziali/fissi da spezie/piante, in

alternativa ai metodi classici. L’analisi

quali-quantitativa delle principali classi

lipidiche è stata effettuata mediante

risonanza magnetica nucleare (13

C

NMR)6. Le analisi in GC e HPLC hanno

fornito dettagliate informazioni sui singoli

acidi grassi e sullo stato ossidativo

dell'olio estratto6. Sono stati quindi

valutati gli effetti modulatori dell’olio sulla vitalità cellulare, sul profilo dei componenti lipidici (acidi

grassi e colesterolo) in cellule Caco-2 differenziate, come modello di cellule epiteliali intestinali

normali, e in cellule coloniche tumorali (Caco-2 non differenziate)6.

L’estrazione mediante CO2-SFE (250 bar, 40 °C) ha portato all’ottenimento di un olio giallo (resa

7%). Tra i principali componenti

sono stati identificati

triacilgliceroli (42.4%), 1,3

diacilgliceroli (13.1%), 1,2

diacilgliceroli (4.3%),

monoacilgliceroli (3.8%) e acidi

grassi liberi (36.3%). L’olio ha

mostrato un composizione

particolare, con elevati livelli di

18:1 n-9 (38%, 303 mg/g) e degli

acidi grassi essenziali 18:2 n-6

(20%, 159 mg/g) e 18:3 n-3

(11%, 93 mg/g). Diversi oli fissi

hanno mostrato, in colture

cellulari e modelli animali,

interessanti proprietà

antitumorali7. L’olio del C.

coccineum ha indotto in cellule

Caco-2 coloniche tumorali una

significativa riduzione della

vitalità da 100 g/mL (Figura

1B), e del 90% a 500 g/mL,

mentre non ha indotto alcuna

riduzione della vitalità in

monostrati di cellule intestinali

Caco-2 differenziate (Figura 2A). Le cellule epiteliali intestinali sono state quindi incubate con l’olio

per una valutazione dell’effetto modulatorio sui componenti lipidici e della biodisponibilità. Dopo 24

0

25

50

75

100

125

Ctrl 50 100 150 250 350 500 600 750 1000

Vit

ali

tà (

%

con

tro

llo

)

Olio fisso ( g/mL)

0

10

20

30

40

50

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Ctrl 50 100

18

:2 e

18

:3 (

g/p

iast

ra)

16

:1 e

18

:1 (

% c

on

tro

llo

)

Olio fisso ( g/mL)

16:1

18:1

18:2 n-6

18:3 n-3 c

c

ad

a

ad

a

B

A

Figura 2. Vitalità (% del controllo, test Alamarblue) (A) e valori degli acidi

grassi 16:1, 18:1 (% controllo), 18:2 e 18:3 ( g/piastra) (B) misurati nelle

cellule Caco-2 differenziate di controllo e dopo 24 ore di incubazione in

presenza dell’olio fisso di C. coccineum (B). a = P < 0.001, c = P < 0.05

versus Ctrl; d = P < 0.001, vs 50 g/mL; (n = 16).

0

20

40

60

80

100

120

ctrl 50 100 250 500 750 1000

% V

iita

lità

Olio fisso ( g/mL)

af a

adgl

adglo adglo

AB

Figura 1. Immagine digitale del Cynomorium coccineum (fungo di Malta)

raccolto in un’area costiera del sud-est della Sardegna, Italia (A). Vitalità

(% del controllo) misurata nelle cellule Caco-2 tumorali dopo 24 ore di

incubazione in presenza dell’olio fisso di C. coccineum (test MTT) (B). a =

P < 0.001, c = P < 0.05 versus ctrl; d = P < 0.001, f = P < 0.05 vs cellule

incubate con 50 g/mL; g = P < 0.001 vs 100 g/mL; l = P < 0.001, vs 250

g/mL; o = P < 0.001, vs 500 g/mL; (n = 16).

| 43

ore di incubazione è stato osservato nelle cellule trattate un significativo cambiamento nel profilo

degli acidi grassi, con un marcato incremento degli acidi grassi essenziali 18:2 n-6 e 18:3 n-3

(rispettivamente 4 e 14 volte superiori rispetto alle cellule di controllo) e, in minor misura, di 18:1 n-9

(Figura 2B). L’olio ha inoltre indotto un selettivo aumento anche nei livelli di 20:3, 22:5 n-3 e, in

misura minore di 20:5 n-3. Non è stato osservato un accumulo di colesterolo rispetto alle cellule di

controllo, mentre è stato misurato un lieve incremento del livello di idroperossidi, correlato allo stato

ossidativo dell’olio. Un simile effetto sul profilo lipidico è stato osservato nelle cellule Caco-2

tumorali. La composizione degli acidi grassi è molto importante in relazione alle caratteristiche

nutrizionali e funzionali di un olio. L’olio del Fungo di Malta è risultato una fonte naturale,

biodisponibile, di acidi grassi essenziali; ha mostrato la capacità di influenzare la vitalità in cellule

tumorali intestinali, senza alcuna tossicità nelle cellule normali. Si qualifica quindi come una risorsa

per applicazioni farmaceutiche e alimentari, potenzialmente in grado di esercitare effetti positivi sul

mantenimento della salute e di agire nella prevenzione/trattamento di condizioni patologiche.

Bibliografia

1) Al Ashaal, H.A., Farghaly, A.A., Abd El Aziz, M.M., Ali, M.A., 2010. Phytochemical investigation and medicinal

evaluation of fixed oil of Balanites aegyptiaca fruits (Balantiaceae). J. Ethnopharmacol. 127, 495–501.

2) IUCN, 2005. International Union for Conservation of Nature and Natural Resources, Centre for Mediterranean Cooperation, Cynomorium coccineum L., in: IUCN Centre for Mediterranean Cooperation Malaga (Spain) (Ed.), A Guide

to Medicinal Plants in North Africa, pp. 99–100.

3) Dharmananda, S., 2011. Cynomorium - Parasitic plant widely used in traditional medicine.

<http://www.itmonline.org/arts/cynomorium.htm>.

4) Lebling, R.W., 2003. The treasure of tarthuth. Saudi Aramco World 54, 12–17.

5) Abdel-Magied, E.M., Abdel-Rahman, H.A., Harraz, F.M., 2001. The effect of aqueous extracts of Cynomorium coccineum and Withania somnifera on testicular development in immature Wistar rats. J. Ethnopharmacol. 75, 1–4.

6) Rosa, A., Rescigno, A., Piras, A., Atzeri, A, Scano, P., Porcedda, S., Zucca, P., Dessì, A. 2012. Chemical composition and effect on intestinal Caco-2 cell viability and lipid profile of fixed oil from Cynomorium coccineum L. Food Chem.

Toxicol. 50, 3799–3807.

Corresponding author: Antonella Rosa - Dip. Scienze Biomediche, Università degli Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria,

SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4124; e-mail: [email protected]


44 |

POSTER

P01-Qualitative comparision of olive oil mediterranean

D. Planeta a, S. Aiello

b, M. Giammanco

c, W. Randazzo

d, V. Mineo

a

a Dipartimento Sistemi Agro-Ambientali, Università degli Studi di Palermo,

b Dipartimento di Scienze

e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo, c Dipartimento di Studi

Giuridici, Economici, Biomedici e Psicosociopedagogici delle Scienze Motorie e Sportive, Università

degli Studi di Palermo, d Dipartimento DEMETRA, Università degli Studi di Palermo

The interest in the last few decades for olive cultivation is expanding is because they have been

achieved levels of mechanization that make olive growing economically competitive with other tree

crops, and because the recognition of the nutritional and health qualities of olive oil resulted in an

increase and a geographic expansion of demand.

The revaluation of olive oil which fat essential for a balanced diet is due to the particular lipid fatty

acid composition which, in addition to being rich in monounsaturated fatty acids, has a budget

balanced essential polyunsaturated fatty acids, with positive effects on adjustment of the level of

cholesterol in blood, on the mechanisms of cell permeability and the formation of free radicals.[1,2]

Among the minor constituents of virgin olive oils carotenes, tocopherols and phenolic substances are

hydrophilic compounds Healthy mostly related to the quality of virgin olive oil due to its antioxidant

properties.[3]

The overall quality of an oil is determined by genetic factors (cultivar), soil (chemical-physical

characteristics of the soil), climatic and cultural practices. From the interaction of these factors depend

on the chemical characteristics of an oil.[4]

The main purpose of this work was to compare quality parameters of chemical samples monovarietal

oils extracted from cultivar Sicilian and Spanish. The Sicilian cultivars are divided into three

categories: major, minor and neglected, while the oil samples were produced by Spanish cultivar

originating in Andalusia, southern Spain.

The analyzes were carried out in 2010 on 24 samples of olive oil olive oil products in the year

2008/2009, of which 19 produced by native Sicilian cultivars and 5 from Spanish cultivars.

The samples were analyzed according to the Regulation EC 1989/03 and the following parameters

were determined; free acidity, number of peroxides, spectrophotometric indices at 232 nm and 270

nm, fatty acid composition, by analysis by gas chromatography of methyl esters, phenolic substances,

by UV spectrophotometric analysis.

Revealed a high biological variability and agronomic feature of Sicilian varietal platform, unlike other

distribution areas such as the Spanish olive sector.

This genetic polymorphism is primarily responsible for the variability that affects all aspects of olive

production, including chemical and physical indices adopted for the qualitative assessment. The

survey conducted on monovarietal oils of cultivars germplasm native Sicilian and Spanish, it was

found that all the oils meet the European standards of the law, but at the same time there was a

different overall quality that contrasts the Sicilian oils to those Iberians.

The oils are collectively discreetly equipped with polyphenols, except that in the case of Manzanilla

resulting deficient. The analysis of fatty acid composition showed an imbalance in cultivars Spanish

tied to values meager of oleic acid, linoleic acid at high values and, consequently, to relations of oleic

/ linoleic quite low, less than 6. Chemical-physical precious have been found in the oils of the cultivar

Biancolilla Nerba, Crastu, Iacona, Pizzutella, Vaddarica and to a greater extent Montonica.

| 45

Bibliography

[1] L. Franzetti, M. Scarpellini, M, A. Vecchio, D. Planeta. Microbiological and safety evaluation of green table olives

marketed in Italy. Annals Of Microbiology, Vol. 61, Issue: 4, Pages: 843-851

[2] P. Conte, V. Mineo, S. Bubici, C. De Pasquale, F. Aboud, A. Maccotta, D. Planeta, G. Alonzo. Dynamics of pistachio oils

by proton nuclear magnetic resonance relaxation dispersion Analytical and bioanalytical chemistry, Vol. 400, Issue: 5, Pages:

1443-1450

[3] V. Mineo, D. Planeta, C. Finoli, S. Giuliano.

Fatty acids, Sterols and Antioxidant compounds of minor and neglected cultivar of Sicilian virgin olive oils.Progress in

nutrition, Vol. 9 Issue: 4 Pages: 259-263

[4]G. Aiello, P. Catania, M. Enea, G. La Scalia, F. Pipitone, M. Vallone.

Real time continuous oxygen concentration monitoring system during malaxation for the production of Virgin Olive Oil. Grasas

y Aceites, Vol. 63 Issue 4, Pages 475-483.

Corresponding author: Diego Planeta, Dipartimento Sistemi Agro-Ambientali, Università degli Studi di Palermo, Viale Scienze

11, 90128 Palermo, Italy; tel:+39.091 23897080; email: [email protected]

P02-The control of abstinence in the treatment of alcohol

dependence: the use of acamprosate in relapse prevention.

F. Venturellaa, Asaro A.

a, G. Faillace

b, G. Spinnato

c, D. Di Majo

e; M. La Guardia

e, M. Giammanco

e,

S. Aiello d

a Dipartimento di Scienze per la Promozione della Salute G. D’ Alessandro, Università di Palermo,

bSer.T Alcamo,

c Sevizio di Psichiatria ASL Palermo 2,

d Dipartimento di Scienze e Tecnologie

Molecolari e Biomolecolari, Università di Palermo, e.

Dipartimento DISMOT, U.O. di Fisiologia e

Farmacologia, Università di Palermo

"The alcoholism can also deal with drug treatments."

This is the message that emerges from the press conference of presentation of Campral, trade name of

acamprosate, a neuromodulator specifically indicated in the maintenance of abstinence in alcohol-

dependent patients.Alcoholism is a disease characterized by: craving, loss of control, tolerance and

physical dependence.For many years the prevention of relapse in use of alcohol after detoxification

was supported almost exclusively by psychosocial procedures and techniques with modest success.

Treatment with acamprosate is a valid tool to complement psychotherapy as it does not cause

addiction, abuse or withdrawal of its suspension and does not interfere with other medications that

patients often alcoholics must take.To evaluate the effectiveness, our study evaluated the effects of

Acamprosate compared to GHB in clinical-physiological and social health in a way indicators of a

possible therapeutic success in terms of abstinence from alcohol and social reintegration. The

hypothesis of the project is that pharmacotherapy anticraving with acamprosate integrated with

psycho-social support, can reduce relapse in alcohol together with the reduction of the risk of abuse

arising from the use of GHB. This work purports to be an account of 11 months of observation of

patients treated with acamprosate.

Results: A total of 36 patients were observed, of which 5, 4 men and 1 woman at the Ser.T Alcamo

and 31, 21 men and 10 women at the Ser.T of Palermo. In the fight against alcoholism, this therapy

with acamprosate offers significant potential: decreases, in fact, the incidence, severity and frequency

of relapses (Fig. 1). As regards the craving, during the period of treatment with acamprosate, there has

been a change, in the sense of reduction, of craving for alcohol: if before therapy was in 68% of cases,

medium-high, becomes after 3-4 months after therapy in low-nil in 89% of patients observed.

It has been recorded that, after 3-4 months after receiving acamprosate, the clinical picture of the

patient is greatly improved by referring to biological markers (Fig. 2).

Conclusions: The study shows that treatment with acamprosate is an exciting opportunity within a

project of integrated care for the treatment of alcohol addiction. The acamprosate may also be used

early in the pharmacological treatment of dependence on alcohol to prevent the appearance of


46 |

55,6%

13% Relapse relapse with acamprosate

relapse with acamprosate

excitability neuronal associated abstinence.On the other hand, its use must have a duration sufficient

to allow neuronal excitability to normalize in the most enduring possible: the treatment, in fact, is

recommended for one year. In any case, the use can be continued even in the face of relapses, with the

aim to reduce the frequency or severity.In particular, the strong point seems to be the ability for the

user to experience a new sense of normalcy and to remove the desire for significant periods of alcohol.

Fig.1: Percentage of relapse

during treatment with

acamprosate.

Fig.2: Laboratory findings on biological markers before and after treatment with acamprosate.

Bibliography:

1. Mason BJ, Lehert P. Effect of acamprosate on protracted withdrawal symptoms: anxiety, dysphoria and insomnia.

Scottsdale, AZ, Dec 7-11-2008.

2. Mason BJ, Heyser CJ: the neurobiology, clinical efficacy and safety of acamprosate in the treatment of alcohol dependence. Expert Opin Drug Saf. 9. 177-188, 2010a.

3. Mason BJ, Heyser CJ. Acamprosate: a prototypic neuromodulator in the treatment of alcohol dependence. CNS Neurol

Disord Drug Targets. 9: 23-32, 2010b. 4. Mason BJ, Lehert P: the effects of current subsyndromal psychiatric symptoms or past psychopathology on alcohol

dependence treatment outcomes and acamprosate efficacy. Am J Addict. 19: 147-154, 2010. 5. Ootemen W, Naassila M, Koeter MW, Verheul R, schippers GM, Houchi H, Daoust M, Van Den Brink W: predicting the

effect of naltrexone and acamprosato in alcohol-dependent patients using genetic indicators. Addict boil. 14: 328-337,

2009. 6. Pilling S, Yesufu-Udechuku A, Taylor C, Drummond C. Diagnosis, assessment and management of harmful drinking and

alcohol dependence: summary of NICE guidance. BMJ. 342: d700, 2011.

7. Rosenthal RN, Gage A, Perhach JL, Goodman AM. Acamprosate: safety and tolerability in the treatment of alcohol dependence. J Addict Med. 2: 40-50, 2008.

8. Rosner S, Leucht S, Lehert P, Soyka M: acamprosate supports abstinence, naltrexone prevents excessive drinking.

Evidence from a meta-analysis with unreported outcomes. J Psychopharmacol. 22: 11-23, 2008. 9. Rosner S, Hackl-Herrwerth A, Leucht S, Lehert P, Vecchi S, Soyka M. Acamprosate for alcohol dependence. Cochrane

Database Syst Rev: CD004332, 2010.

10. Witkiewitz K, Saville K, Hamreus K.Acamprosate for treatment of alcohol dependence: mechanisms, efficacy and clinical utility. Ther Clin Risk Manag. 2012;8:45-53. Epub 2012 Feb 1.

11. Petrov I, Krogh J, Nordentoft M. [Meta-analysis of pharmacological therapy with acamprosate, naltrexone, and

disulfiram--a systematic review]. [Meta-analysis of pharmacological therapy with acamprosate, naltrexone, and disulfiram--a systematic review].

12. Mason BJ, Lehert P. Acamprosate for alcohol dependence: a sex-specific meta-analysis based on individual patient data.

Epub 2011 Sep 6. 13. Brager A, Prosser RA, Glass JD. Acamprosate-responsive brain sites for suppression of ethanol intake and preference.

2011 Oct;301(4):R1032-43. Epub 2011 Jun 22.

Corresponding author: Dott. Fabio Venturella, Dipartimento di Scienze per la promozione della salute G. D’ Alessandro,Via

Del Vespro 127 Università degli Studi di Palermo, Tel. 3203354997, Email: [email protected]

95 77

43.3

356.8

91.5

17 21

61

0 40 80

120 160 200 240 280 320 360 400

MCV AST ALT G-GT

Biological markers

BEFORE

AFTER

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Petrov%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Krogh%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nordentoft%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mason%20BJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lehert%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brager%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prosser%20RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Glass%20JD%22%5BAuthor%5D


| 47

P03-Relationship between maximal fat oxidation and oxygen

uptake: comparison between patients with type 2 diabetes and

healthy sedentary subjects.

A.Cataldo, G. Russo, D. Cerasola, D. Di Majo, S. Aiello, M. Giammanco, M. Traina

Department of Sports Science (DISMOT), University of Palermo, Italy

Purpose

Carbohydrate and fatty acids are the dominant fuels oxidized for energy production during exercise.

Their contribution is influenced by intensity of exercise1, with a progressive increase in the relative

contribution of carbohydrate oxidation to energy expenditure, whereas the absolute rate of fat

oxidation increases from low to moderate intensities of exercise and declines as exercise becomes

more intense2. In patients with type 2 diabetes (T2D) the altered metabolism and the lower capacity to

sustain efforts3 changed the choice and regulation of energy substrates for oxidation

4.

Purpose of our study was to assess the relationship between the highest value of fat oxidation rate

(FATmax) and the oxygen uptake (VO2) in sedentary T2D patients and to compare with healthy

sedentary subjects.

Methods

Fifteen sedentary T2D patients (nine males, six females), mean age 58 (range 39 – 65) and fifteen

healthy sedentary subjects (eight males, seven females), mean age 53 (range 37 – 71), were studied.

All T2D patients were being treated with diet and antiglycemic agents. Significant cardiovascular

disease was excluded in all subjects by an instrumental examination. The exercise testing started in the

laboratory at 08.00 hours after an overnight fast. All subjects performed a graded exercise test to

exhaustion on treadmill, using modified Bruce protocol. Oxygen uptake (VO2) and carbon dioxide

(VCO2) were recorded and maximum fat oxidation rate (FATmax) was determined using indirect

calorimetry, with the assumption that urinary nitrogen excretion rate was negligible. Substrate

oxidation rates were then plotted as a function of exercise intensity, expressed as percentage of

maximal oxygen uptake (VO2max). Experimental data are presented as means standard error of the

mean, and for the statistical analysis of the data linear regression analysis was used.

Results

The physical and physiological characteristics of subjetcs are shown in table 1. The average VO2max

for T2D patients and healthy subjects was 22.29 1.06 ml/Kg/min and 28.63 2.03 ml/Kg/min

respectively (P < 0.01). In T2D patients, absolute fat oxidation rate reached a maximum of 6.71 0.46

mg/Kg/min at VO2 of 15.41 0.68 ml/Kg/min (70 1.27% of VO2max) while in healthy subjects 7.19

0.77 mg/Kg/min at VO2 of 18.23 1.28 ml/Kg/min (64 2.61% of VO2max). When linear regression

analysis was performed, a positive linear correlation between FATmax and VO2 (r = 0.85; p = 0.0001)

in both groups has been found (Fig. 1). Also, positive linear correlation between FATmax and VO2max

in both T2D (r = 0.76; p = 0.001) and healthy subjects (r = 0.73; p = 0.002) has been found (Fig. 2).

Conclusions

Our data, comparable with those reported in the literature5, indicate that in T2D patients fat oxidation

rate is not impaired. VO2max, index of exercise capacity, was significantly lower in T2D patients so

that, in T2D compared to healthy subjects, we found a maximal fat rate oxidation at higher exercise

intensity. Moreover, the positive linear correlation between FATmax and both VO2 and VO2max

suggests that even in T2D patients the muscle oxidative capacity might increase in response to aerobic

training.

48 |

Table 1: Physical and physiological characteristics of subjetcs.

T2D patients Healthy subjects

n 15 15Age (y) 58 ± 1.78 53 ± 2.04

Height (cm) 168 ± 2.32 167 ± 2.58Weight (Kg) 81 ± 3.20 75 ± 4.69

BMI 28.7 ± 1.07 26.6 ± 1.3VO2max (ml/Kg/min) 22.29 ± 1.06 28.63 ± 2.03 **

FATmax (ml/Kg/min) 6.71 ± 0.46 7.19 ± 0.77

VO2 at FATmax (ml/Kg/min) 15.41 ± 0.68 18.23 ± 1.28 *

%VO2max at FATmax (%) 70 ± 1.27 64 ± 2.61 *

Data are means ± SE

* P < 0.05 for difference between healthy and T2D subjects

** P < 0.01 for differences between healthy and T2D subjects

.

Fig.1 Correlations between FATmax and VO2 in T2D (A) and Healthy (B) subjects

Fig.2 Correlations between FATmax and VO2max in T2D (A) and Healthy (B) subjects.

References

1) Romijn JA, Coyle EF, Sidossis LS, Gastaldelli A, Horowitz JF, Endert E, and Wolfe RR. Regulation of endogenous fat and

carbohydrate metabolism in relation to exercise intensity and duration. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 265: E380–E391, 1993.

2) Martin III, Klein W and S. Use of endogenous carbohydrate and fat as fuels during exercise. Proc. Nutr. Soc. 57:49–54,

1998. 3) Regensteiner JG, Sippel J, McFarling ET, Wolfel EE, and Hiatt WR. Effects of non-insulin dependent diabetes on oxygen

consumption during treadmill exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 27(6): 875–881, 1995.

4) Vranic M. Physiology and biochemistry of exercise in insulin-resistant states. Presented at the 60th Scientific Sessions of the American Diabetes Association; San Antonio, Texas; June 11, 2000.

5) Borghouts LB, Wagenmakers AJM, Goyens PLL, Keizer HA. Substrate utilization in non-obese Type II diabetic patients at

rest and during exercise. Clinical Sc. 103: 559-566, 2002. Corresponding Author: Marco Giammanco, fax+390916236407, Email: [email protected]

9.00

11.00

13.00

15.00

17.00

19.00

21.00

23.00

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

VO

2 (

ml/

Kg/

min

)

FATmax (mg/Kg/min)

T2D subjects

r = 0.85

A

9.00

14.00

19.00

24.00

29.00

3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00

VO

2 (

ml/

Kg/

min

)

FATmax (mg/Kg/min)

r = 0.85 p = 0.0001

Healthy subjects

B

9.00

14.00

19.00

24.00

29.00

34.00

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00

VO

2m

ax (m

l/K

g/m

in)

FATmax (mg/Kg/min)

T2D subjects

A

r = 0.76 p = 0.001

9.00

19.00

29.00

39.00

49.00

3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 VO

2m

ax (

ml/

Kg/

min

)

FATmax (mg/Kg/min)

Healthy subjects

r = 0.73 p = 0.002

B


| 49

P04-The influence of hypocaloric diet, associated with moderate

physical activity and CBT (cognitive behavioral therapy), on self-

esteem and self-efficacy and their modulator role on emotional

eating.

G. Giammanco, D. Di Majo, M. Giammanco, M. La Guardia

Dipartimento DISMOT, Unità Operativa Didattico Scientifica di Fisiologia e Farmacologia

Università degli Studi di Palermo

There are many evidences that emotional factors have great influence on eating habits; this

phenomenon is defined “emotional eating” and increases the risk of obesity (1). Few studies

demonstrate that patients affected by binge eating disorder felt negative emotions before binges; the

main emotion reported was anxiety, then sadness and tiredness. The emotional factors can interfere

with a diet therapy and with keeping results at the end of a diet. Emotional eating is related to the

stress (2), so when subjects feel anxiety and depression, is more probable that they use food as

modulator of their emotions, in this way the weight develops fast with all risks of obesity.

The obesity is often attended by a specific syndrome called metabolic syndrome; the main symptoms

are insulin resistence, hyperinsulinemia, not-insulin-dependent diabetes mellitus, dyslipidemia, central

obesity, hyperuricemia, hypertension; this clinic condition predisposes to cardiovascular diseases. So

the aim of our study is to observe how two psychological constructs as “self-esteem” and “self-

efficacy”, that are demonstrated to have a protective role against negative emotions as anxiety e

depression (5), can modulate the emotional eating. For this aim, we used CBT (Cognitive Behavior

Therapy). We began to select a sample of obese subjects, and gave them few questionnaires to

evaluate the degree of anxiety and depression (STAI/BDI), the level of self-esteem (BASIC SE), and

if there was a diagnosis of Binge Eating Disorder (BED) by a Binge Eating Scale (BES). The first

results show a significant relation between anxiety and depression and low level of self-esteem, and

their relation with BED. The one subject of the sample with low self-esteem and high depression and

anxiety, but without BED, uses pharmacological therapy for anxiety and depression. Is probable that

modulator effect of food is displaced by drugs.

sesso età BMI BES BDI STAI BASIC SE

F 30 37,2 1 6 27 >80°

F 47 53,7 39 40 77 <1°

F 50 40,1 6 33 67 <5°

M 30 52,8 31 13 59 15°

M 36 37,1 4 1 35 >90°

BIBLIOGRAPHY 1) DallmanMF. “Stress-induced obesity and the emotional nervous system.”

Trends EndocrinolMetab. 2010 Mar; 21(3):159-65. Epub 2009 Nov 18. 1) MashebR.M., Grilo C.M.“Emotional overeating and its associations with eating disorder psychopatology among

overweight patients with Binge Eating Disorder”. International Journal of Eating Disorders; 2006 39: 141-146.

2) Marci E. Gluck “Stress response and binge eating disorder” Appetite 46 (2006) 26–30 3) G. M. Reaven (1988). Role of insulin resistance in human disease. Diabetes, Banting lecture 37: 1595-1607

4) Baumesteir, R.F., Campbell, G.D., Krueger, J.D., Vohs, K.D.,“Does high self-esteem cause better performance,

interpersonal success, happiness, or healthier lifestyle?” Psychological Science in the Public Interest, 2003 4, 1-44. 4

Corresponding Author: Giulia Giammanco, email: [email protected]

http://it.wikipedia.org/wiki/1988


50 |

P05-Cellular drug delivery system based on vaterite particles

B. Parakhonskiy1, 2

, C. Foss1, E. Carletti

1, A. Haase

1, A. Motta

1, C. Migliaresi

1, and R. Antolini

1

1. BIOtech, University of Trento, via delle Regole 101, 38123 Mattarello, Italy

2. Shubnikov Institute of Crystallography, Russian Academy of Science, Moscow, Russia

The novel technique for the synthesis of vaterite submicron containers were developed in our work.

We present the characterization of these carriers, their loading and experiments on possible release

strategies controlling of the release rates of encapsulated substances. Biocompatibility analyses were

performed, evaluating the cytotoxicity of vaterite containers and their influence on the cell

metabolism. Finally we present in vitro cellular uptake experiments for different molecular-weight

cargos.

CaCO3 vaterite spherical particles were fabricated with controllable average sizes from 400nm up to

10 micron. As proof-of-principle experiments, fluorescent markers (low-molecular-weight Rhodamine

6G and high-molecular-weight TRITC-dextran) were encapsulated into the vaterite containers, so that

payload release dynamics could be studied by fluorescence microscopy and spectrofluorimetry. An

increase of the release rate of Rhodamine 6G into water and cell growth medium was found with

respect to ethanol coinciding with the recrystallization phase transition from vaterite to calcite after 3

days. For samples loaded with TRITC-dextran, this phase transition was inhibited, causing only small

amounts of the encapsulated markers being desorbed during one week.

Human ovarian carcinoma ES2 cells were cultured with a suspension of vaterite particles in culture

medium. Neither cytotoxicity was noticed after 2 days of incubation, nor cell reproduction was

significantly affected proving the biocompatibility of the vaterite containers. The uptake dynamics

was monitored by confocal laser microscopy after staining live cells with Calcein-AM. High- and

low-molecular-weight payload for cell uptake experiments showed diverse dynamics.

While the first exhibited fast dye release into the cells, the later showed strong indications of intact

containers accumulating within the cell also after 48h. These contrasting dynamics can be further

controlled by covering the microcontainers with additional layers of biocompatible polyelectrolyte,

which will further increase the payload release time. A change of the pH from neutral to acid

conditions instead, will lead to a destruction of the vaterite matrix followed by a quick release of the

encapsulated materials. These flexible control mechanisms make this system an interesting candidate

for pharmaceutical applications.

P06-Modelli biologici di stress ossidativo per lo studio delle

proprietà antiossidanti del carciofo

Melis M. P., Atzeri A., Cabboi B., Deiana M., Incani A., Loru D., Rosa A., M. Melis, Dessì M. A.

Dip. Scienze Biomediche, Università degli Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5,

09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4127; e-mail: [email protected].

É oramai ben riconosciuto il ruolo funzionale, in relazione al miglioramento dello stato di salute e di

benessere e/o riduzione del rischio di malattia, di una serie di alimenti che rientrano nelle normali

abitudini alimentari e che mostrano la loro efficacia nelle quantità normalmente consumate nella dieta.

Il carciofo, alimento da sempre apprezzato nella regione mediterranea, è una verdura caratterizzata da

elevati livelli di polifenoli (≈ 2% del peso fresco), composti in grado di esercitare un’importante

azione di prevenzione nei confronti di differenti condizioni patologiche. Tradizionalmente è stato

utilizzato nella medicina popolare per le sue proprietà coleretiche-colagoghe, diuretiche,


| 51

epatoprotettive ed ipocolesterolemizzanti, proprietà confermate da vari studi sperimentali, che hanno

avvalorato l’azione benefica del carciofo nei confronti di alcuni disturbi epatici e digestivi1, la

capacità di esplicare effetti anti-iperlipidemici2 sia ostacolando l’aumento di trigliceridi sia inibendo lo

svuotamento gastrico. È stata inoltre evidenziata un’azione ipoglicemizzante negli animali e

nell’uomo oltre ad un effetto ipocolesterolemico3 dovuto sia ad aumentato flusso biliare (e

conseguente aumento di escrezione di colesterolo), sia all’ostacolo di neo-sintesi di colesterolo

(tramite l’inibizione dell’enzima idrossi-metilglutaril CoA reduttasi). Numerosi studi hanno mostrato

l’importante azione antiossidante esplicata dal carciofo o dai suoi estratti in diversi modelli

sperimentali, in particolare in leucociti umani stimolati con diversi ossidanti tra cui H2O2, in colture di

cellule endoteliali e di monociti4, in colture primarie di epatociti di ratto trattati con cumene

idroperossido o tert-butil idroperossido5 o durante l’ossidazione di LDL mediata da ioni rameici

4,6. Le

proprietà antiossidanti del carciofo sono state correlate al contenuto di composti polifenolici presenti,

in particolare ai livelli di acido caffeico e dei suoi derivati. Altri importanti composti fenolici

identificati nel carciofo sono i flavonoidi apigenina e luteolina e i loro glucosidi e rutinosidi.

Questo studio è volto a valutare l’azione antiossidante del carciofo della cultivar “Spinoso Sardo”,

clone “Spinoso”, con l’obiettivo di fornire una nuova caratterizzazione delle proprietà di questo

pregiato ortaggio, molto importante

nell’economia della Sardegna, per

renderlo da squisito alimento

apprezzato soprattutto per la sua

bontà, oltre che per le sue proprietà

benefiche nei confronti di vari

disturbi epatici-biliari, a nuova

potenziale fonte di molecole

antiossidanti. A tale scopo è stato

studiato e comparato il potere

antiossidante di una serie di estratti

metanolici ottenuti da differenti parti

(foglie, capolini e gambi) del carciofo

Spinoso Sardo attraverso l’utilizzo di

diversi modelli di stress ossidativo di

rilevanza biologica, quali la

degradazione ossidativa dell’acido

linoleico a 37 °C e l’ossidazione del colesterolo a 140 °C. Inoltre è stato valutato l’effetto citotossico

nei confronti delle cellule Caco-2 differenziate, quale modello di cellule intestinali. Tutti gli estratti di

carciofo hanno ostacolato la degradazione dell’acido linoleico ma in maniera differente: i capolini

hanno mostrato un potere protettivo maggiore rispetto agli estratti dei gambi e delle foglie; infatti, già

da 1 g hanno protetto l’acido linoleico di circa il 50% e permesso un recupero maggiore di acidi

grassi idroperossidi a dieni coniugati (HP). Una protezione totale dell’acido grasso si è riscontrata con

5 g degli estratti dei capolini e con 50 g degli estratti dei gambi (Figura 1). Tale capacità

antiossidante probabilmente è esplicata dagli estratti di carciofo attraverso un meccanismo di

donazione di atomi idrogeno, confermato dalla capacità degli estratti di spostare il rapporto c,t/t,t degli

HP formati durante l’autossidazione dell’acido linoleico a favore degli isomeri c,t7. La protezione

verso il colesterolo è stata più simile tra gli estratti (100% di protezione da 5 g), 1 g dell’estratto dei

capolini ha permesso una protezione paragonabile tra foglie e capolini, mentre i gambi sono stati

meno efficaci.

0

50

100

150

200

250

300

0

20

40

60

80

100

120

HP

to

t (%

del

l'o

x)

ac.

lin

ole

ico

(%

del

co

ntr

oll

o 0

°C)

estratti di carciofo

1ug 2.5ug 5ug 10ug 50ug

1ug 2.5ug 5ug 10ug 50ug

Figura 1: Acido linoleico residuo (barre) espresso in % del controllo a 0 C e acidi grassi

idroperossidi totali (HP tot) (linee) espressi in % dell’ossidato (ox), formati dopo

incubazione, a 37 C per 32 ore alla luce, di 1mg di acido linoleico in assenza (ox) o in

presenza di 1-50 g di estratti in metanolo di gambi, foglie e capolini di carciofo, clone

“Spinoso”, cultivar “Spinoso Sardo”. (Valori del controllo: ac. linoleico= 0.95 0.05mg;

HP= 86.66 11.44 g, analisi in HPLC7).

52 |

Sulle cellule Caco-2 differenziate, (modello ampiamente utilizzato per la valutazione delle proprietà

delle cellule intestinali8), gli estratti in metanolo dei capolini del clone “Spinoso” non hanno mostrato

alcuna azione citotossica, valutata

con il test Alamar Blue9, nel range

di concentrazione 1-1000 mg/ml, al

contrario degli estratti metanolici

delle foglie totalmente tossici già a

concentrazione di 25 mg/ml

(Figura 2). Dai risultati ottenuti si

evince come l’uso di metodiche

semplici, poco costose e di routine

siano risultate utili per mettere in

luce virtù benefiche di un alimento

da tanti apprezzato per il suo gusto

oltre che per le sue proprietà quale

“alimento funzionale”.

Bibliografia

1) Sannia A. (2010). Un’esperienza di fitoterapia con una associazione di fitocomplessi ad attività epatoprotettrice contenente un estratto di foglie di carciofo per il controllo dei sintomi della dispepsia funzionale. Minerva Gastroenterol. Dietol., 56: 93-99.

2) Shimoda et al., (2003). Anti-hyperlipidemic sesquiterpenes and new sesquiterpene glycosides from the leaves of artichoke (Cynara scolymus L.): structure requirement and mode of action. Bioorg. Med. Chem. Lett., 13: 223-228.

3) Bundy et al., (2008). Artichoke leaf extract (Cynara scolymus) reduces plasma cholesterol in otherwise healthy

hypercholesterolemic adults: A randomized, double blind placebo controlled trial. Phytomedicine, 15: 668-675.

4) Zapolska-Downar et al., (2002). Protective properties of artichoke (Cynara scolymus) against oxidative stress induced in

cultured endothelial cells and monocytes. Life Sciences, 71: 2897-2908.

5) Gebhard (1997). Antioxidative and protective properties of extracts from leaves of the artichoke (Cynara scolymus L.) against

hydroperoxide-induced oxidative stress in cultured rat hepatocytes. Toxicol. App. Pharmacol., 144: 279-286.

6) Jiménez-Escrig et al., (2003). In vitro antioxidant activities of edible artichoke (Cynara scolymus L.) and effect on

biomarkers of antioxidants in rats. J. Agric. Food Chem., 51: 5540-5545

7) Rosa et al., (2002). Antioxidant activity of capsinoids. J. Agric. Food Chem., 50: 7396-7401

8) Deiana et al., (2010). Protective effect of simple phenols from extravirgin olive oil against lipid peroxidation in intestinal Caco-2 cells. Food Chem. Toxicol., 48: 3008–3016.

9) O'Brien et al., (2000). Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur. J. Biochem., 267: 5421-5426.

Corresponding author: Melis M.Paola - Dip. Scienze Biomediche, Università degli Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria,

SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4127; e-mail: [email protected].

P07-Cardiac regeneration by pharmacologically active

microcarriers releasing growth factors and/or transporting adipose-

derived stem cells

M. Savi1,7

, L. Bocchi1,4

, E. Fiumana2,4

, C. Frati3, F. Bonafé

2,4, S. Cavalli

3, P. G. Morselli

6, J.-P.

Karam2,5

, C. Montero-Menei5, C. M. Caldarera

,2,4, C. Guarnieri

2,4, C. Muscari

2,4, D. Stilli

1,4, F.

Quaini7,4

, E. Musso1,4

.

Dipartimento di Bioscienze-Università di Parma1, Dipartimento di Biochimica-Università di

Bologna2, Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali-Università di

Parma3, Istituto Nazionale per le Ricerche Cardiovascolari (INRC)

4, INSERM U 646 – Università di

Angers5, Dipartimento d Scienze Chirurgiche Specialistiche ed Anestesiologiche-Università di

Bologna6, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale - Università di Parma

7.

AIMS. In preclinical studies, cell transplantation has definitely emerged as a potential treatment

0

20

40

60

80

100

120

1 2,5 5 10 25 50 100 250 500 750 1000

Mo

rta

lità

cell

ula

re (

% d

el co

ntr

oll

o)

concentrazione estratti ( g/ml)

gambi

capolini

foglie

a, d a, #

Figura 2: Mortalità cellulare (% del controllo, 0% di mortalità o 100% di vitalità) di

cellule Caco-2 tenute in coltura per 24 ore con diverse concentrazioni (1-1000 g/ml) di

estratti di carciofo. [a= p<0.001 vs i controlli; d= p<0.001 foglie vs gambi e capolini;

#= p<0.001 gambi e foglie vs capolini]. La citotossicità degli estratti (1-1000 g/ml) è

stata saggiata su cellule CaCo-2 differenziate8, utilizzando il test Alamar Blue9.


| 53

+dP/dt (mmHg/s)

- 22%-13%

-18%-15%

0

100020003000

400050006000

7000

80009000

-dP/dt (mmHg/s)

-8000

-6000

-4000

-2000

0

- 33%

-23%

-29%-33.6%

strategy for heart failure secondary to myocardial infarction (MI) whereas data from large sample size

clinical trials are conflicting (1). To ameliorate the unsatisfactory outcome of cell therapy in clinical

settings attention has been paid to several factors such as tailoring of cell type, fine tuning of

procedural aspects, and optimization of engraftment techniques with the use of scaffolds. In recent

years, several studies documented the existence in adipose tissue of stem cells (Adipose-derived Stem

Cells: ASCs) which can be safely transplanted to an autologous or allogeneic host and differentiate

into various cell types, including cardiomyocytes (2). Further, Hepatocyte Growth Factor and Insulin-

Like Growth Factor-1 (GFs) were shown to repair the infarcted heart and improve its

electromechanical competence by respectively mobilizing resident cardiac stem cells (CSCs) and

promoting their survival and proliferation (3). Finally, pharmacologically active microcarriers (PAMs)

formed by biodegradable and non-cytotoxic poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres which interact

with cells/molecules conveyed on their surface and tissue microenvironment were proposed for

enhancing cell engraftment in the injured myocardium (4). In the present study, we tested the

hypothesis that stem cell based cardiac regeneration through intra-myocardial delivery of ASCs, GF-

mediated local activation of CSCs, or both, can be improved by PAMs.

METHODS. ASCs were isolated by human lipoaspirates. PAMs were coated with fibronectin and

poly-lysine to improve cell adhesion and biological function. GFs were encapsulated into PAMs

during the microsphere formulation. Thirty-eight adult male Wistar rats with one-month old MI were

treated with ASCs (MI_ASC group, n=8), ASCs+PAMs (MI_ASC+PAM, n=7), GF-releasing PAMs

(MI_PAM+GF, n=6), ASCs+GF-releasing PAMs (MI_PAM+ASC+GF, n=6) or vehicle (MI_V, n=6).

Five additional rats were sham operated (SHAM). Two weeks after treatment, hemodynamic

parameters were invasively determined in Millar conductance catheter studies and inducibility of

ventricular arrhythmias was assessed during programmed stimulation in Langendorff-perfused hearts,

by Microelectrode Array (MEA) system. Eventually, the hearts were subjected to anatomical,

morphometric, and immunohistochemical analyses. ASC tracking was achieved by the detection at

tissue level of both pre-labeled cells with Dil fluorochrome and human specific sex chromosomes by

FISH.

a) b)

* * * * * * * *

Figure 1. Mean values±SE of (a) +dP/dt and (b) –dP/dt, measured in the 6 experimental groups. *

p<0.05, significant differences vs. SHAM

RESULTS. The deterioration of ventricular function in untreated MI rats was represented by an

approximately 22% reduction in the maximal rate of ventricular pressure rise and decline (±dP/dt;

Figure 1 a-b) and a 35% prolongation of isovolumic contraction and relaxation times. PAM+ASC+GF

was the most effective treatment leading to a substantial improvement of all hemodynamic parameters

whose values approached those measured in SHAM rats (Figure 1 a-b). The recovery of left

ventricular (LV) hemodynamics in MI_PAM+ASC+GF group had a structural counterpart in a 10%

reduction in LV chamber dilation together with a 20% increase in mass-to-chamber-volume ratio, thus

cancelling out the unfavorable LV remodeling induced by MI (no significant difference vs. SHAM).

In the same animals a considerable amount of cell engraftment within the infarcted hearts was clearly

documented by FISH immunohistochemical studies. Lastly, all treatments involving the use of PAM

had beneficial effects on myocardial perfusion by significantly increasing the number of arterioles in

the regenerated hearts. Again, the best results were obtained in MI_PAM+ASC+GF group (+75%;

p<0.01 vs. MI-V ).

SHAM

MI_V

MI_ADSC

MI_ADSC+PAM

MI_PAM+GFs

MI_PAM+ADSC+GFs

SHAM

MI_V

SHAM

MI_V

MI_ADSC

MI_ADSC+PAM

MI_ADSC

MI_ADSC+PAM

MI_PAM+GFs

MI_PAM+ADSC+GFs

MI_PAM+GFs

MI_PAM+ADSC+GFs

54 |

By contrast, the improvement in cardiac mechanical function and structure mediated by

PAM+ASC+GF treatment was not accompanied by a similar positive effect on electrical function.

Indeed, arrhythmias occurring during programmed stimulation trended to be larger in all treated

animals and more so in MI_PAM+ASC+GF group.

CONCLUSION. PAMs appeared to improve ASC- or GF-based approaches to regenerate the

infarcted heart and ameliorate cardiac function although caution should be paid on the

electrophysiological impact of the physical interaction of microspheres with the myocardium.

References:

1.Malliaras K, Marbán E. Cardiac cell therapy: where we've been, where we are, and where we should be headed. Br Med Bull.

2011;98:161-85.

2.Mizuno H, Tobita M, Uysal AC. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.

Stem Cells. 2012;30:804-10.

3.Urbanek K, Rota M, Cascapera S, Bearzi C, Nascimbene A, De Angelis A, Hosoda T, Chimenti S, Baker M, Limana F,

Nurzynska D, Torella D, Rotatori F, Rastaldo R, Musso E, Quaini F, Leri A, Kajstura J, Anversa P. Cardiac stem cells possess

growth factor-receptor systems that after activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and

long-term survival. Circ Res. 2005;97:663-73.

4.Karam JP, Muscari C, Montero-Menei CN. Combining adult stem cells and polymeric devices for tissue engineering in

infarcted myocardium. Biomaterials. 2012;33:5683-95.

Corresponding author: Donatella Stilli, Dipartimento di Bioscienze, Parco Area delle Scienze 11A, Università di Parma, 43100

PARMA. Tel.: +390521905624. E-mail [email protected]

P08-Micro-Raman mapping of bio-carbonates and polyenic

pigments in corals and shells

L. Bergamonti1, G. Predieri

1, P.P. Lottici

2

1

Chemistry Department, University, Parco Area delle Scienze 17/a, 43124 Parma – Italy, 2 Physics

and Earth Sciences Department, University, Parco Area delle Scienze 7/a, 43124 Parma – Italy

Calcifying organisms are widely studied to investigate the complex organic-inorganic structure of the

biogenic carbonates and the environmental factors influencing their formation (1). The nature of the

pigments in marine and terrestrial biogenic carbonates found in corals, shells or pearls is still debated

and, in addition, a deeper understanding of the intricate biomineralization processes is looked for to

mimic the “natural” growth techniques for specific applications.

Raman microscopy is a powerful technique to investigate both the spatial distribution of the inorganic

phases (calcite, aragonite or vaterite) and to define the nature of the organic pigments in corals, shells

and pearls, especially when resonance conditions are attained (2-6). Mixtures of methylated

(carotenoids) or non-methylated polyenes with different UV-VIS absorption spectra and chain lengths

(i.e. number N of C=C bonds) are responsible for the colors and their variations in mineralized

organisms (4-5).

Here we report on Raman mapping measurements at 632.8 nm and at 473.1 nm (resonance) in calcitic

and/or aragonitic samples: terrestrial pulmonate gastropod mollusk shells of the Liguus virgineus

species (family Orthalicidae) compared with corals (Stylaster roseus and Corallium rubrum).

The pigment in Corallium rubrum (calcitic) shows Raman frequencies typical of polyenic

unmethylated chains whereas in Stylaster roseus coral (aragonitic) the spectrum is similar to that

found in a methylated carotenoid pigment as astaxanthin or canthaxanthin. On the other hand, for the

peculiar Liguus virgineus shells investigated (mainly aragonitic), the pigments show both methylated

and unmethylayed polyenic nature. The results of the Raman mapping distribution of carbonate

species are discussed and compared with those found in marine gastropoda or bivalve shells, where

methylated polyenes are hardly found.


http://en.wikipedia.org/wiki/Terrestrial_animal

http://en.wikipedia.org/wiki/Pulmonate

http://en.wikipedia.org/wiki/Gastropod

http://en.wikipedia.org/wiki/Mollusk

| 55

References:

1 - Urmos, J.; Sharma, S. K.; Mackenzie, F. T., Am. Mineral. 1991, 76, 641–646.

2 - Bergamonti, L.; Bersani, D.; Csermely, D.; Lottici, P.P., Spectrosc. Lett. 2011, 44, 453-458.

3 - Soldati, A. L.; Jacob, D. E.; Wehrmeister, U.; Hager, T.; Hofmeister, W., J. Raman Spectrosc. 2008, 39, 525–536.

4 - Karampelas, S.; Fritsch, E.; Mevellec, J.-Y.; Gauthier, J.-P.; Sklavounos, S.; Soldatos, T., J. Raman Spectrosc. 2007, 38,

217–230.

5 - Barnard, W.; de Waal, D. J. Raman Spectrosc. 2006, 37, 342–352.

6 - Hedegaard, C.; Bardeau, J.-F.; Chateigner, D., J. Mollus. Stud. 2006, 72, 157–162.

P09-La popolazione del vergante attraverso lo studio dei cognomi

L. Pedrini1, B. Pedrini

1, E. Rabino Massa

2

1Collaboratore scientifico: Museo di Antropologia ed Etnografia - Università di Torino

2Dipartimento di Scienze della vita e Biologia dei Sistemi - Università di Torino

Nel Vergante, zona collinare situata a sud-ovest del Lago Maggiore, sino a pochi decenni fa, la

migrazione dai paesi montani e collinari verso il fondovalle era scarsa. La pastorizia e l’agricoltura

fornivano alle popolazioni mezzi appena sufficienti per vivere ma non di più, per cui non vi era

neanche immigrazione. Abbiamo verificato se questa stanzialità c’è stata o c’è ancora in alcuni paesi

collinari del Vergante.

La presente ricerca si prefigge lo scopo: a- Di verificare quali siano stati i flussi migratori delle

popolazioni del Vergante nel corso delle ultime cinque generazioni; b- Di accertare l’eventuale

esistenza di una omogeneità biologica valutata sui cognomi; c- Di avviare indagini genetiche, previo

accertamento dell’ isolamento delle comunità vergantesi, d- Di utilizzare i risultati al fine di un

completamento e confronto con quelli degli studi in corso sulle popolazioni isolate delle Alpi e degli

ambienti lagunari (Progetti Antico Delfinato e L’Uomo e il Lago).

La presente ricerca rappresenta, quindi, uno studio pilota per esaminare, attraverso l’analisi dei

cognomi, l’isolamento dei seguenti 8 paesi del Vergante: Ghevio, Colazza, Pisano, Corciago,

Tapigliano, Nebbiuno Fosseno e Massino. Per ciascuno dei paesi sopra ricordati abbiano rilevato la

frequenza dei cognomi di tre decenni scelti a caso compresi nel periodo 1866- 1994 (1866-’ 75, 1930-

’39 e 1985-‘94).

Dall’esame in dettaglio dei singoli Comuni si evince che, a partire dal 1866, il ceppo originario appare

conservato, pur incidendo meno sulla totalità della popolazione. Le peculiarità più salienti si rilevano

per il Comune di Massino, che mostra il più altro grado di omogeneità, in quanto il ceppo originario

ha mantenuto un alto grado di persistenza, ed anzi il numero medio degli abitanti con lo stesso

cognome è aumentato. Al contrario del Comune di Corciago, dove il ceppo originario si è disperso,

più che dimezzandosi in 120 anni.

In conclusione si può affermare che nella maggior parte dei Comuni si è potuti risalire, attraverso ai

cognomi, alle famiglie presenti da cinque generazioni e che l’acquisizione di nuovi patronimici ha

permesso di individuare i cambiamenti dovuti all’ immigrazione.

56 |

P10-Ricerche sulla popolazione di Giaglione (TO) in epoca

preunitaria

S. De Iasio1, G. Levati

1, M. Girotti

2, M. Fagiano

2, R. Boano

2

1Dipartimento di Bioscienze, Universita' di Parma,

2Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei

Sistemi , Università di Torino

La ricerca biodemografica ha storicamente privilegiato l’utilizzo di fonti di flusso (nascite, matrimoni,

morti) per le analisi sui meccanismi microevolutivi delle popolazioni. In particolare l’attenzione dei

ricercatori è stata rivolta ai registri di matrimonio. Varie circostanze hanno portato a operare verso tale

scelta: la possibilità piuttosto comune di disporre di tali documenti; la facilità nella stima di alcuni

parametri biodemografici da essi desumibili, quali ad esempio i livelli di endogamia ed esogamia.

Tuttavia le fonti di flusso non rendono sufficientemente conto della frazione di popolazione che ha

effettivamente perpetuato la comunità nel tempo, come pure non danno informazioni sulle modalità di

aggregazione dei suoi componenti, né consentono di valutare l’importanza dei diversi fattori

socioeconomici che possono avere inciso sul processo di continuità della popolazione. Una valida

alternativa alle fonti di flusso può essere l’utilizzo di fonti di stato censuarie, civili (censimenti) o

parrocchiali (gli “status animarum”), che danno una fotografia molto dettagliata sullo stato della

popolazione in un preciso momento. É bene tuttavia ricordare che esse non sono sempre facilmente

reperibili, in particolare quelle in epoca preunitaria.

In questa prospettiva di studio, il recupero e l’analisi della documentazione censuaria assume un ruolo

prioritario al fine di ovviare alle carenze proprie delle fonti di flusso.

Nel presente lavoro vengono comparati alcuni stimatori demografici relativi alla popolazione di

Giaglione (Val Susa, Torino) desunti utilizzando i censimenti civili del marzo 1799 (all’epoca facente

parte della effimera Repubblica Piemontese) e del dicembre 1858 (allora Giaglione era sotto il Regno

di Sardegna, riformato dallo Statuto Albertino, in provincia di Susa, divisione di Torino).

Al 1799 la popolazione di Giaglione risulta costituita da 1348 individui, compresi in 266 unità

abitative e ripartiti in 7 frazioni geografiche di dimensioni variabili da 120 a 303 abitanti. Al 1858 la

comunità si è accresciuta a 1695 soggetti e 344 famiglie, dislocate sul territorio in 9 frazioni, più un

certo numero di toponimi riferibili essenzialmente a piccoli gruppi di case sparse.

Le dimensioni degli aggregati abitativi al 1799 evidenziano un numero ristretto di unità formate da

solitari o da due persone soltanto, mentre quelle costituite da 3 a 7 persone sono le più comuni. Molto

poche sono le unità di ampie dimensioni (9 o più individui). Al censimento sabaudo del 1858 risultano

aumentate in modo significativo le proporzioni sia dei nuclei formati da due persone che da quelli

costituiti da almeno 9 individui, mentre si riducono percentualmente quelli di dimensioni intermedie,

segnali di un cambiamento in atto nelle modalità di aggregazione della popolazione.

Le unità abitative sono state classificate e comparate sulla base del codice predisposto da P. Laslett

(Laslett, 1977) che consente di individuare gli aggregati domestici secondo criteri di natura geografica

(gli individui che “dormono sotto lo stesso tetto”), di relazione o affinità familiare (legami familiari

naturali o acquisiti tramite matrimonio) o funzionale (coloro che condividono una certa attività). In

linea con quanto riscontrato nella letteratura demografica (Soliani et al, 1985), la popolazione risulta

strutturata principalmente in aggregati composti da coppie nucleari, con o senza figli, anche in

condizione di vedovanza, specie da parte della femmina. Tuttavia tra il 1799 e il 1858 si rileva una

accresciuta proporzione di coppie senza figli e di vedovi (maschi) con figli, mentre risulta diminuita la

quota di aggregati estesi (comprendenti anche altri parenti non costituenti un ulteriore nucleo

familiare) e soprattutto multipli (più nuclei famigliari coresidenti), sintomi che al momento della

formazione della coppia si dovrebbe avere avuto una preponderanza di matrimoni “neolocali”,

costituenti cioè nuclei familiari nuovi, senza che il partner fosse aggregato alla famiglia d’origine del

coniuge.

Nella composizione per sesso, le femmine risultano in surplus rispetto ai maschi rispettivamente di 50

individui (su 1346 totali) nel 1799 e di 17 (su 1695) nel 1858. Lo sbilanciamento si avverte soprattutto

| 57

nella fascia d’età degli adulti giovani (dai 20 ai 34 anni), difettose di maschi, presumibilmente causato

dal reclutamento di soldati per l’esercito; lo squilibrio rispetto al rapporto sessi 1:1 è rilevante anche

nelle classi più avanti con gli anni, dai 45 ai 59, ma stavolta a sfavore delle femmine. In assenza degli

atti di morte che lo possano attestare, sembra ragionevole imputare la carenza di donne dai 45 ai 59

anni alla maggior mortalità femminile collegata al logoramento fisico e all’indebolimento conseguenti

gli stress da parto.

E’ stata inoltre effettuata una analisi della discendenza legittima, conteggiando i figli minori ancora

conviventi con i genitori (almeno uno ancora in vita al momento del censimento). Naturalmente non

può che trattarsi di una stima parziale della discendenza finale in quanto molte delle spose considerate

non avevano ancora concluso il proprio periodo fertile. Inoltre dal computo mancano i figli deceduti

che non dovevano essere pochi in quanto negli anni censiti la popolazione doveva essere caratterizzata

da un “ancient regime” demografico di tipo pretransizionale, con valori di natalità e mortalità ancora

decisamente elevati. Mancano infine anche i figli sposatisi precocemente e/o che per vari motivi si

erano allontanati dalla famiglie d’origine. La distribuzione dei nuclei familiari in funzione dei figli

censiti evidenzia una differenza importante tra le due rilevazioni nel numero di coppie coniugali

giovani ancora senza figli, con una quantità di coppie ancora “sterili” molto maggiore nel censimento

più antico. Probabilmente le modalità di scrittura dei registri del 1799 per quanto concerne

l’indicazione delle relazioni tra ciascun individuo con il capofamiglia può avere dato adito ad errori

interpretativi e forse avere influito sulla correttezza dell’attribuzione di alcuni figli ai genitori giusti.

Ne è prova il rigetto dell’ipotesi di adattamento della distribuzione di frequenza osservata a quella

teorica di Poisson (p=0,04%), attesa per le popolazioni in regime di fecondità naturale. Detta

sovrastima di coppie senza figli sembra invece non verificarsi per la distribuzione di frequenza delle

dimensioni della prole per il 1858 (p=8,07%). Come suggerito da Cavalli-Sforza e Bodmer (1971), è

possibile ovviare all’errata stima delle coppie senza figli togliendole dalla distribuzione: così è stata

riscontrata la validità nell’adattamento al modello poissoniano (17,4% e 12,3% rispettivamente per il

1799 e 1958) senza evidenziare fenomeni sistematici di perturbazione sulla distribuzione dei figli vivi

in regime di fecondità naturale.

Malgrado i limiti di analisi già illustrati, è stato possibile osservare la riduzione della fecondità

all’aumentare dell’ordine di nascita cumulando i figli legittimi (ancora) vivi e rapportando fra loro i

valori di ciascun ordine di nascita con il precedente (Livi Bacci, 1981) . La riduzione della fecondità

attesa nelle popolazioni “naturali” dovrebbe essere attorno al 20% passando da un ordine al

successivo. Nel presente lavoro la riduzione percentuale della fecondità aumenta progressivamente al

succedersi degli ordini di nascita in quanto si assommano tra loro la mancata conclusione della

fecondità delle spose e gli effetti depauperativi della mortalità, soprattutto di quelli in età

preriproduttiva. Si osserva in entrambe i censimenti una caduta molto più forte nella numerosità dei

nuclei familiari passando dalle famiglie con 4 figli vivi a quelle con 5, indice della criticità nella quale

venivano a trovarsi i nuclei una volta raggiunta una certa dimensione.

Bibliografia:

L.L. Cavalli-Sforza, W.F. Bodmer, 1971, The genetics of human populations, H. Freeman, S. Francisco (USA)

P. Laslett, 1977, Famiglia ed aggregato domestico, in: (a cura di M. Barbagli) Famiglia e mutamento sociale, 30-54, Il Mulino, Bologna.

M. Livi Bacci, 1981, Introduzione alla demografia, Loescher editore, Torino.

L. Soliani, A. Anelli, R. Zanni, 1985, Aspetti della dinamica delle strutture familiari, in: (a cura di A. Moroni, A. Anelli,

O. Ravera) Atti S.IT.E., 5: 765-776, Zara Edizioni, Parma.

Corresponding author: Sergio De Iasio, Dipartimento Di Bioscienze, V.le Usberti 11/a, Parma tel. 0522 905664 e-mail

[email protected]

58 |

P11-Distribution and phylogeny/distance-trees of prokaryotic

photoreactive domains

C. Mandalari1, A. Losi

1, W. Gärtner

2

1 Dept. of Physics and Earth Sciences, Univ. of Parma (Italy),

2 Max Planck Institute for Chemical

Energy Conversion, Mülheim (Germany)

Light is very important for the metabolism of many prokaryotic and eukaryotic organisms.

Prokaryotic organisms often use dedicated red- and blue light sensing photoreceptor functional

domains. There are two main superfamilies of non-membrane bound photoreceptors: the first ones are

bilin-binding phytocrome-related proteins based on GAF (cGMP-specific phosphodiesterases,

cyanobacterial adenylate cyclases, and formate hydrogen lyase transcription activator FhlA) domains

(bilin-GAF proteins); the second are flavin-binding proteins, photoreceptive thanks to their LOV

(Light, Oxygen and Voltage) and BLUF (Blue Light sensing Using Flavins) domains [1].

Our model sequence for LOV domains is from the LOV-protein Ytva from B. subtillis. For BLUF we

used the corresponding domain from the T. elongatus PixJ protein. We searched protein sequences

similar to LOV and BLUF domains employing the BLAST algorithm and then we try to find possible

evolutionary paths. From the research we find 498 proteins with LOV domains in 379 different

species and 751 with BLUF region in 558 organisms. Many species have more than one protein with

these domains and in some cases there is co-presence of both domains. In most cases LOV and BLUF

proteins are modular, with the photoreceptive modules associated to diverse effector or/and regulative

domains. In some organisms beyond LOV and BLUF there are also phytocrome-related proteins. We

can say that in every bacterial phyla there is at least a photoreactive domain bleonging to LOV, BLUF

or bilin-GAF, whereas archaea possess solely LOV proteins as soluble photoreceptors.

As for the phylogeny we use neighbouring-method to obtain a branching pattern, limited to LOV and

BLUF sequences, given the uncertainties in alligning bilin-GAF. We can observe that most of proteins

coming from different strains of the same organism are in the same cluster and, in general, domains

from organisms of the same phyla are neighbour. We can also observe that proteins with the same

functional domains are in the same cluster, so that we should more correctly speak of distance-trees.

From these observation we can think that proteins could have the same function or they could be

involved in similar signal-transduction/metabolic pathways.

References

1. A. Losi, W. Gartner, “Bacterial bilin- and flavin-binding photoreceptors”, Photochem. Photobiol. Sci., 2008, 7, 1168-1178

*Corresponding author: Mandalari Carmen - University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics and Earth Sciences, viale G.P. Usberti 7/A, 43100-Parma (I)

Tel: +39-0521905256, e-mail: [email protected]

P12-Biomarcatori per la diagnosi precoce del tumore al polmone

P. Mozzoni1,2

, I. Banda1,M. Goldoni

1,2, M. Rusca

3, P. Carbognani

3, A. Casalini

3, M. Corradi

1, A.

Mutti1.

1Università degli studi di Parma;

2INAIL Istituto Nazionale per l’Assicurazione contro gli Infortuni

sul Lavoro; 3Azienda Ospedaliera di Parma

Il cancro al polmone è la prima causa di morte per patologia neoplastica nei paesi industrializzati. La

prognosi di tale malattia è limitata a causa della mancanza di validi approcci finalizzati al

riconoscimento tempestivo delle lesioni che permettano di attuare una diagnosi precoce. Appare

perciò evidente l’importanza di sviluppare metodiche in grado di individuare lesioni iniziali. (1-2).

Numerose evidenze sperimentali mostrano il coinvolgimento dei miRNA nella regolazione di processi


| 59

biologici che portano alla formazione del tumore, tra cui l’adesione, l’invasione, la migrazione, la

transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e l’angiogenesi (3). I microRNA (miRNA) sono una

classe di piccoli RNA non codificanti, generalmente lunghi tra i 18-25 nucleotidi, in grado di regolare

l’espressione genica a livello post-trascrizionale attraverso la degradazione di specifici RNA

messaggeri o attraverso l’inibizione della traduzione in proteina (4).

Il presente lavoro si pone l’obbiettivo di identificare potenziali biomarcatori da utilizzare nella

diagnosi precoce del tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC) in matrici di facile accesso,

quali il plasma e, per la prima volta, il condensato dell’aria espirata (CAE) con lo scopo di ottenere un

test diagnostico non invasivo con una buona sensibilità e specificità. Sono stati valutati come

biomarcatori due microRNA: il miRNA-21 e il miRNA-486, correlati all’espressione di oncogeni e

oncosoppressori tumorali

Fig. 1. A: Rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel plasma di soggetti sani (CTR, ) e di soggetti affetti da NSCLC(▲). B: Curva

ROC del rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel plasma. E’ indicato il punto di flesso

Fig. 2. A: Rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel CAE di soggetti sani (CTR,) e di soggetti affetti da NSCLC (▲). B: Curva

ROC del rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel CAE. E’ indicato il punto di flesso.

Nel plasma l’espressione del miRNA-21 è risultata essere significativamente maggiore nei soggetti

con NSCLC rispetto ai soggetti di controllo sani (P<0.0001), mentre l’espressione del miRNA-486 ha

evidenziato una significativa riduzione di espressione nei soggetti malati rispetto ai soggetti sani

(P<0.0001). Lo stesso andamento è stato evidenziato nel CAE, anche in questo caso il miRNA-21

presentava una maggiore espressione nei soggetti affetti da NSCLC, rispetto ai soggetti sani

(P=0.0253); al contrario il miRNA-486 mostrava una minore espressione nei soggetti malati rispetto

ai sani. (P=0.0294). Inoltre, considerando il fatto che i soggetti con valori elevati di miRNA-21

presentavano generalmente bassi livelli di miRNA-486, è stato valutato il loro rapporto in entrambe le

matrici, ottenendo un aumento del potere discriminante messo in evidenza dalle rispettive curve ROC

(Fig.1 e 2). La curva ROC generata dal rapporto tra il miRNA-21 e il miRNA-486 nel plasma

presentava una sensibilità dell’87.5% e una specificità dell’86.8%. L’area sotto la curva era di 0.901

A B

CTR NSCLC0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

Rel

ativ

e E

xpre

ssio

n

miR

NA

-21/m

iRN

A486 C

AE

P=0.0289

*

P<0.0001

***

A

CTR NSCLC0.1

1

10

100

Rel

ativ

e E

xpre

ssio

n

miR

NA

-21/m

iRN

A-4

86 P

lasm

a

B

60 |

(IC95 0.827-0.975), significativamente diversa da 0.5. La curva ROC generata dal rapporto tra il

miRNA-21 e il miRNA-486 nel CAE presentava una sensibilità dell’60% e una specificità dell’71.1%.

L’area sotto la curva era di 0.678 (IC95 0.549-0.806), significativamente diversa da 0.5.

Utilizzando gli indicatori valutati nel plasma e nel CAE, che nel confronto tra gruppi erano risultati

statisticamente differenti come variabili predittive e come variabile dipendente lo status (malato o

sano), è stata effettuata la regressione logistica binaria per valutare la capacità di tali indicatori nel

classificare i soggetti. Nell’insieme il miRNA-21 e il miRNA-486 erano in grado di distinguere

correttamente i soggetti con tumore polmonare nel 76.5% dei casi (13/17) e i soggetti senza tumore

nel 96.6% dei casi (28/29), con una percentuale globale dell’89.1%.

Questi risultati, seppur preliminari, evidenziano come i miRNA possano essere considerati dei buoni

biomarcatori precoci per la diagnosi di NSCLC, in matrici periferiche di facile accesso, quali il sangue

e per la prima volta il condensato dell’aria espirata. Questo risultato è molto importante perché

permetterebbe di diagnosticare la malattia senza l’utilizzo di esami strumentali invasivi. Si potrebbe

quindi pensare ad un loro ipotetico utilizzo a fianco delle tradizionali tecniche di imaging a scopo

diagnostico e prognostico.

Bibliografia

1. Al-Kattan K, Sepas E, Fountain SW, Townsend ER. (1997), “Disease recurrence after resection for stage I lung cancer”.

Eur J Cardiothorac Surg;12:380-384. 2. Westeel V, Choma D, Clement F, Woronoff-Lemsi MC, Pugin JF, Dubiez A, Depierre A. Relevance of an intensive

postoperative follow-up after surgery for non-small cell lung cancer. Ann Thorac Surg 2000; 70:1185-1190.

3. Lages E, Ipas H, Guttin A, Nesr H, Berger F, Issartel JP. MicroRNAs: molecular features and role in cancer. Front Biosci. 2012 Jun 1;17:2508-40.

4. Hussain MU. Micro-RNAs (miRNAs): genomic organisation, biogenesis and mode of action. Cell Tissue Res. 2012

Aug;349(2):405-13.

Corresponding author: Dott.ssa Paola Mozzoni Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Via Gramsci, 14 – 43126

Parma; Tel 0521-033078; e-mail: [email protected]

P13-Comparative analysis of cytotoxic effects INDUCED BY N4-

ethylmorpholine citronellalthiosemicabazone complexes in different

human cancer cell lines

F. Biscegliea, R. Alinovi

b, S. Pinelli

b, P. Tarasconi

a, A. Buschini

c, F. Mussi

c, G. Pelosi

a

a Department of Chemistry,

bDepartment of Clinical and Experimental Medicine,

c Department of

Biosciences, University of Parma,

Thiosemicarbazone and their metal complexes are a class of compounds that present interesting

biological properties among which the ability to inhibit proliferation of a wide variety of cancerous

cell lines. In the course of our studies, we have assessed that their activity is certainly due to more

than one cellular target and, interestilngly, is strongly dependent on the typology of tumour cells.[1]

Their high selectivity is highlighted in in vitro models: some cell lines are very sensitive and others

are totally insensitive. In previous papers we have reported that in human leukaemia cell line U937

two N4-ethylmorpholine citronellalthiosemicarbazone complexes, [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and

[Cu(Etmorph-S-tcitr)2], showed strong antiproliferative activities.[2, 3] The aim of this study is

therefore to perform a comparative analysis of cytotoxic effects (apoptosis and oxidative stress

induction) of these two compounds in four cancer cell lines of different malignancies: the histiocytic

lymphoma cell line U937, the promyelocytic leukemia cell line HL-60, the colon adenocarcinoma cell

line HT-29 and the neuroepithelioma cell line SK-N-MC.

A first comparison of IC50 values evidenced that the copper complex is systematically more potent.

Both complexes exhibit the highest cytotoxic activity on U937, while SK-N-MC cells resulted to be

the most resistant (Tab. 1).

| 61

IC50 (µM)

[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] [Cu(Etmorph-S-tcitr)2]

U937 12.3 + 0.9 2.3 + 0.4

HL60 15.4 + 1.8 6.0 + 0.9

HT29 52.6 + 6.3 14.9 + 3.4

SK-N-MC 21.2 + 2.7 5.7 + 1.2

Table 1. IC50 values for the tested cell lines exposed to compounds [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2]

More specifically, treatment with the IC50 concentration of each compound resulted in a significant

induction of apoptosis in U937, HL 60 and SK-N-MC cells but not in HT-29 line. These results were

confirmed by the DNA fragmentation assay and caspase activation: no modification of caspase

activities was observed in HT-29.

Figure 1. Caspase activity (above) and ROS levels (below) induced by compounds [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] (left) and

[Cu(Etmorph-S-tcitr)2] (right)

The same trends in ROS (Reactive Oxygen Species) intracellular levels were observed for U937 and

SK-N-MC cells: [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] caused a time-dependent increase and [Ni(Etmorph-S-tcitr)2]

only an early transient increase. These oxidative stress markers were not modified in HL-60 cells by

both complexes. Intracellular ROS of HT-29 were more than 4 fold the control value during the early

phases of [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] exposure; a lower and later increase of ROS was observed during

[Cu(Etmorph-S-tcitr)2] treatment (Fig. 1).

The effects of [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] on different cell lines are extremely

heterogeneous. This different “sensitivity” makes difficult to hypothesise a general action mechanism

and to generalize structure-activity correlation. The choice of the cellular model used to investigate

the interaction of thiosemicarbazone complexes with the biological systems has come out to be a

crucial phase in in vitro studies.

U937 HL60 HT29 SK-N-MC

100

1000

***

*

**

**

*

***

*

***

Cas

pase

act

ivity

(% a

s co

mpa

red t

o co

ntro

ls)

U937 HL60 HT29 SK-N-MC

100

1000

Cas-8

Cas-9

Cas-3

*

***

* *

***

* **

U937 HL60 HT29 SK-N-MC0

100

200

300

400

500

**

***

***

****

ROS

(% a

s co

mpa

red t

o co

ntro

ls)

[Ni(Etmorph-S-tcitr)2

] [Cu(Etmorph-S-tcitr)2

]

U937 HL60 HT29 SK-N-MC0

100

200

300

400

5001 h

4 h

24 h

*****

***

***

*

***

[Ni(Etmorph-S-tcitr)2

] [Cu(Etmorph-S-tcitr)2

]

62 |

References

1.G. Pelosi Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity The Open Crystallography Journal, 2010, 3, 16-

28. 2.M. Belicchi-Ferrari, F. Bisceglie, A. Buschini, S. Franzoni, G. Pelosi, S. Pinelli, P. Tarasconi and M. Tavone Synthesis,

structural characterization and antiproliferative and toxic bio-activities of copper(II) and nickel(II) citronellal N4-

ethylmorpholine thiosemicarbazonates, J. Inorg. Biochem. 2010, 104, 199-206. 3.F. Bisceglie, S. Pinelli, R. Alinovi, P. Tarasconi, A. Buschini, F. Mussi, A. Mutti and G. Pelosi, Copper(II)

thiosemicarbazonate molecular modifications modulate apoptotic and oxidative effects on U937 cell line, J. Inorg. Biochem.

2012, 116, 195-203.

Corresponding author: Giorgio Pelosi - Department of Chemistry, University of Parma, Parco Area delle Scienze 17A 43124 Parma (Italy), tel. +390521905420, e-mail: [email protected]

P14-Effetti citotossici degli ossidi di cobalto e di titanio su cellule

A549.

R. Alinovi2, S. Pinelli

2, M. Goldoni

1, P. Mozzoni

1, D. Dallatana

3, A. Perotti

2, A. Mutti

2

1CERT Centro di Eccellenza per la Ricerca Tossicologica,

2Dipartimento di Medicina Clinica e

Sperimentale, 3Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli

Studi di Parma.

La continua e rapida espansione delle nanotecnologie ha comportato la diffusione negli ambiente di

vita e di lavoro di nanoparticelle (NP) che costituiscono un rilevante problema sanitario: per le loro

dimensioni (inferiori a 100 nm) sono in grado di penetrare nell’apparato respiratorio fino a

raggiungere gli alveoli polmonari, con conseguenti insorgenze od aggravamenti di patologie

respiratorie e cardiopolmonari (1). Un contributo fondamentale alla comprensione dell’interazione fra

NP e sistemi biologici, dei meccanismi d’azione e dei possibili effetti viene fornito dagli studi in vitro

(2). In seguito ad esposizione a NP costituite da metalli e dai loro ossidi sono stati evidenziati

alterazioni mitocondriali, danni al DNA, produzione di radicali liberi e fattori pro-infiammatori (3, 4).

Tra le NP di interesse industriale quelle di diossido di Titanio (TiO2) e di ossido di Cobalto (Co3O4)

sono diffusamente utilizzate, oltre che come pigmenti e catalizzatori, nella produzione di schermi per

raggi UV (Ti NP) e di sensori (Co NP).

In questo studio sono stati confrontati gli effetti di NP di ossido di Co e di ossido di Ti su cellule

A549, derivate da un adenocarcinoma polmonare. Questa linea cellulare è stata scelta perché

l’apparato respiratorio costituisce la principale via di inalazione ed assorbimento di NP e quindi un

potenziale bersaglio (5).

Nel medium di coltura le NP tendono ad aggregarsi, formando agglomerati di notevoli dimensioni

(alcuni µm).

Solo concentrazioni molto elevate di NP riducono la vitalità cellulare senza indurre processi

apoptotici: IC50 201.13+59.51 e 459.03+83.37 µg/ml rispettivamente per Co e Ti. Concentrazioni non

letali (50 e 100 µg/ml) di entrambe le NP sono tuttavia in grado di disturbare l’adesione delle cellule

al substrato di coltura ed di provocare alterazioni nel ciclo cellulare di A549 esposte a Co, con una

significativa diminuzione delle cellule in fase S e G2/M.

Nel corso dell’esposizione a Co si osserva inoltre un elevato incremento dose-dipendente di specie

reattive dell’ossigeno (ROS), con conseguente significativo aumento dei prodotti dello stress

ossidativo sulle proteine (gruppi carbonilici), sui lipidi di membrana (TBARS-Thiobarbituric acid

reactive substances) e con induzione di attività enzimatiche scavenger (eme ossigenasi-1). Nelle fasi

iniziali del trattamento (1 h) compare anche un lieve danno genotossico, evidenziato col metodo del

Comet alcalino. Questo effetto precoce è reversibile ed il recupero, presente già dopo 4 h, è

completato dopo 24 h.

Il nostro studio ha dimostrato che modelli sperimentali in vitro costituiscono una fase importante per

la comprensione dei meccanismi di tossicità di nanoparticelle di uso industriale e che le peculiari

| 63

caratteristiche chimico-fisiche delle NP rendono impossibile qualsiasi generalizzazione.

E’ inoltre stato confermato che NP metalliche, in particolare Co NP, producono ROS, in grado di

provocare danni a livello di macromolecole e strutture cellulari. E’ tuttavia ipotizzabile che l’azione

delle NP si esplichi con un meccanismo multi-target.

Finanziato dalla Ricerca Finalizzata RF-2009-1472550: Integrated approach to evaluate biological

effects on lung, cardiovascular system and skin of occupational exposure to nanomaterials (NanO I-

LuCaS).

Bibliografia:

1.NIOSH National Institute for Occupational Safety and Health. Approaches to the safe nanotechnology. Managing the health and safety concerns associated with engineered nanomaterials. USA, 2009.

2.Han X., Corson N., Wade-Mercer P. et al. Assessing the relevance of in vitro studies in nanotoxicology by examining

correlations between in vitro and in vivo data. Toxicology 2012, 297; 1-9. 3.Lewinski N., Colvin V., Drezek R. Cytotoxicity of nanopartcles. Small 2008, 4: 26-49.

4.Rivera Gil P., Oberdorster G., Elder A., Puntes V., Parak W.J. Correlating physico-chemical with toxicological properties of

nanoparticles: the present and the future. ACS Nano 2010, 4, 5527-5531. 5.Yang W., Peters J.I., Williams R.O. Inhaled nanoparticles. A current review. Int. J. Pharm. 2008, 356: 239-247.

Corresponding author: Alinovi Rossella - Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università degli Studi di Parma,

Via Gramsci, 14 - 43126 Parma

Tel. 0521 033093 e-mail: [email protected]

P15-Enzimatic biomarkers in the gilthead seabream juveniles fed

with graded concentrations of alchylphenols

I. Traversi1,3*

, E. Gambetta1, V. Nozzi

2, F. Maradonna

2, O. Carnevali

2,3, A. Mandich

1,3

1Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova,

viale Benedetto XV 5,16132 Genova, 2Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università

Politecnica delle Marche, via Brecce Bianche, 60131 Ancona, 3INBB Consorzio Interuniversitario di

Biosistemi e Biostrutture, via Medaglie d’Oro, 00136 Roma

The presence of different types of organic pollutants, in both wild and cultured teleosts, has been

widely reported. Among organic pollutants, 4-t-octylphenol (OCT), and 4-nonylphenol (NP) are man-

made contaminants possessing controversial endocrine disruption properties [1]. Gilthead seabream

(Sparus aurata L) is one of the most important commercial species for Mediterranean aquaculture and

one of the marine species more frequently used as bioindicator of endocrine disruption [2]. The aim of

this study was to investigate in seabream juveniles the effects of OCT and NP enriched diet on

biotransformation, measured as ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity (phase I) and

glutathione-S-transferase (GST) activity (phase II). The effects on the activity of antioxidant defences

was determined by measuring catalyse (CAT) activity. Vitellogenin (Vtg) and Zona radiata protein

(Zrp) expressions were used as endocrine biomarkers of exposure [3]. Seabream juveniles were

divided into 8 groups of 20 animals (10g/bw) each: control, solvent control (ethanol) and 6 groups

exposed to 3 graded concentrations of OCT (5, 50 e 100 mg /kg/day OCT1, OCT2, OCT3

respectively) and NP (5, 50 e 100 mg /kg/day NP1, NP2, NP3 respectively) for 21 days. At the end of

the exposure, liver was immediately frozen for the enzymatic activity assays and for RNA extraction

for Vtg and Zrp mRNA assay. Liver weight was recorded for hepatosomatic index (HSI). VTG e Zrp

gene expression was evaluated by Q-RT-PCR by using Sybergreen method. EROD activity was

measured in microsome suspension recording the increase in fluorescence for the resorufin formation;

GST activity in the cytosolic fraction was analyzed with spectrophotometer, following the formation

of s-2,4-dinitro phenyl glutathione, at 340 nm; CAT was spectrophotometrically assayed at 240 nm,

by consumption of H2O2. Significant increase of HIS was observed in NP1, NP2 and OCT1. mRNA

Vtg expression was significantly higher in both NP1 and NP2 and in OCT2. Vtg and Zrp gene

expression valuation on NP3 and OCT3 groups are still in progress. OCT significantly inhibited CAT


64 |

activity (p<0,0005) in all groups, while CAT activity was significantly (p<0,0005) inhibited only in

NP1 and in NP3 (p<0,01). GST activity was significantly increased in NP1 and NP2 (p<0,05) and

decreased in OCT3 (p<0,005). EROD activity was significantly lower (p<0,05) only in NP2 and NP3,

while all OCT concentrations induced lower EROD activity. Concluding the obtained results

evidenced negative effects of both NP and OCT exposure in every concentrations here analyzed,

although a dose dependent response was not evidenced, suggesting a detrimental effects on the

reproduction of this important economic model.

Progetto F-2009-1536185, finanziato dal Ministero della Salute.

Bibliografia.

[1] Pérez Carrera E., García-López A., Martín del Río M.P., Martínez-Rodríguez G., Solé M., Mancera J. M. Effects of 17β-estradiol and 4-nonylphenol on osmoregulation and hepatic enzymes in gilthead sea bream (Sparus auratus). Comparative

Biochemistry and Physiology, Part C (2007), 145: 210–217

[2] Teles M., Pacheco M., Santos M. A. Sparus aurata L. liver EROD and GST activities, plasma cortisol, lactate, glucose and erythrocytic nuclear anomalies following short-term exposure either to 17h-estradiol (E2) or E2 combined with 4-nonylphenol.

Science of the Total Environment (2005) 336: 57– 69

[3] Arukwe, A., Goksory, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next generation: oogenetic,

population, and evolutionary implications of endocrine disruption. Review. Comparative Hepatology (2003) 2:4

http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4

Corresponding author: Traversi Ilaria, Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi

di Genova, viale Benedetto XV 5,16132 Genova tel 0103538046 – 3202622463 e-mail [email protected]

P16-Hepatic activities in Sparus Aurata L. juveniles fed with

bisphenol A enriched diet.

I. Traversi1,3

, A. Scorolli2, G. Gioacchini

2, G. Roncoli

1, O. Carnevali

2,3, A. Mandich

1,3

1Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova,

viale Benedetto XV 5,16132 Genova, 2Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università

Politecnica delle Marche, via Brecce Bianche, 60131 Ancona, 3INBB Consorzio Interuniversitario di

Biosistemi e Biostrutture, via Medaglie d’Oro, 00136 Roma

A large number of compounds have been reported to exhibite endocrine modulating activity. These

include chemicals such as Bisphenol-A (BPA), a man-made contaminant, extensively used for human-

manufactured products [1]. Recently, from 60 to 90% BPA-contamined fish has been found along

South-Italian coasts, demonstrating increasing impact of this contaminant in the marine environment

[2]. Gilthead seabream (Sparus aurata L) is one of the most important commercial species for

Mediterranean aquaculture and one of the marine species more frequently used as bioindicator of

endocrine disruption [3]. This study aimed to relate the effects of BPA-enriched diet to catalase

(CAT), CYP1A-dependent 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) and glutathione S-transferase

(GST) activities in seabream juveniles. Vitellogenin (Vtg) and Zona radiata protein (Zrp) expressions

were measured as endocrine biomarkers of exposure [4]. Eight groups 8-10g/bw seabream juveniles

(n=20) were reared for 21 days under laboratory condition in 200 l tanks, at 18°C, 10L/14D

photoperiod. Two groups were kept as control (C) and solvent control (CSP). Experimental groups

were fed on commercial diet enriched with increasing concentrations of BPA (BPA1:5 mg/g/day,

BPA2: 50 mg/g and BPA3: 100 mg/g). At the end of the exposure, liver was immediately frozen for

enzymatic activities and mRNA extraction. Liver weight was recorded for hepatosomatic index

(HSI). EROD activity was measured in microsome suspension recording the increase in fluorescence

for the resorufin formation; GST activity in the cytosolic fraction was analyzed to spectrophotometer,

following the formation of s-2,4-dinitro phenyl glutathione, at 340 nm; CAT was

spectrophotometrically assayed at 240 nm, by consumption of H2O2. VTG e Zrp gene expression was

evaluated by Q-RT-PCR by using Sybergreen method. More than 50% BPA3 exposed juveniles died

after two week exposure and only two groups (BPA1 and BPA2) were available for analyses at the



| 65

end of the trials. Significant increase of HSI, Zrp and Vtg expression was observed in both BPA1 and

BPA2 (p<0,05) with significantly higher levels of both biomarkers in BPA1. EROD and CAT

activities were significantly (p<0,001) inhibited in BPA1 and BPA2.

In conclusion the results here obtained clearly showed that the selected biomarkers will be useful for

monitoring the presence of Bisphenol-A on marine environment as well as on commercial diet widely

employed on aquaculture practice.

Progetto F-2009-1536185, finanziato dal Ministero della Salute.

Bibliografia

[1] Vandenberg L. N., Maffini M. V., Sonnenschein C., Rubin B. S., Soto A. M. Bisphenol-A and the Great Divide: A Review

of Controversies in the Field of Endocrine Disruption. Endocrine Reviews (2009) 30(1):75–95.

[2] Mita L., Bianco M., Viggiano E., Zollo F., Bencivenga U., Sica V., Monaco G., Portaccio M.,

Diano N., Colonna A., Lepore M., Canciglia P., Mita D.G. Bisphenol A content in fish caught in two different sites of the

Tyrrhenian Sea (Italy). Chemosphere (2011), 82: 405–410.

[3] Teles M., Pacheco M., Santos M. A. Sparus aurata L. liver EROD and GST activities, plasma cortisol, lactate, glucose and

erythrocytic nuclear anomalies following short-term exposure either to 17h-estradiol (E2) or E2 combined with 4-nonylphenol.

Science of the Total Environment (2005) 336: 57– 69.

[4] Arukwe, A., Goksory, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next generation: oogenetic,

population, and evolutionary implications of endocrine disruption. Review. Comparative Hepatology (2003) 2:4


Corresponding author: Traversi Ilaria, Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi

di Genova, viale Benedetto XV 5,16132 Genova tel 0103538046 – 3202622463 e-mail [email protected]

P17-K:D-Rib un inibitore della proliferazione delle cellule tumorali

ed un promotore del folding di DNAzima.

L.Bruni1,2,3

S.Croci1,2

1Dipartimento di Neuroscienze - Unità di Biofisica e Fisica Medica - Università di Parma,

2INBB

Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi – ROMA, 3Fondazione Valsè Pantellini

Le cellule tumorali mostrano un aumento della glicolisi anche in presenza d’ossigeno disponibile.

Questo processo chiamato “Effetto Warburg” è uno dei fondamentali switch metabolici che una

cellula cancerosa manifesta se paragonata ad una cellula non cancerosa. Tra i trasportatori del

glucosio c’è la famiglia SGLT (cotrasportatore Na+/glucosio). L’elevata concentrazione totale di

sodio in lesioni mammarie tumorali misurata con 23

Na-MRI sembra essere un indicatore del livello

cellulare di malignità [1].

Il ruolo del D-ribosio e dello ione potassio (K+) sono ampiamente noti: il D-ribosio è un aldopentoso,

assiste il metabolismo energetico della cellula oltre ad esser un precursore d’alcuni aminoacidi; lo ione

K+ è coinvolto in molti processi tra cui apoptosi, genesi e mantenimento del potenziale di membrana e

stabilizza il folding dei G-quadruplex. C'è un interesse crescente nell’utilizzo di G-quadruplex anche

come sensori per lo ione K+ [2].

Per saggiare l’effetto del K:D-Rib sulla proliferazione delle linee cellulari non si sono potuti utilizzare

i comuni saggi metabolici (MTT assay, WST-1 assay ecc) in quanto K:D-Rib interagisce con il

bromuro di tetrazolio riducendolo a formazan [3].

Ci siamo perciò avvalsi di un metodo d’uso comune: le cellule (4000 cell/ml trattate con K:D-Rib

5mM e incubate per 12 gg) sono state contate utilizzando il programma ImageJ ed in seguito si è

calcolato il tempo di duplicazione. Il controllo ha mostrato un tempo di duplicazione di 44 ore, mentre

il trattato di 59 ore. L’effetto rilevato è un progressivo rallentamento della proliferazione cellulare del

trattato rispetto al controllo.

Il saggio delle colonie, nel quale si contano gruppi cellulari di almeno 50 unità, ha confermato i

risultati delle curve di crescita, mostrando ancora una volta un effetto antiproliferativo del K:D-Rib sia

sulla linea HTB-126 [3] che HTB-30 (metastasi pleurica di carcinoma mammario). Quest’ultima linea



66 |

cellulare ha mostrato 15 colonie per il controllo e nessuna colonia per i trattati. Questi dati

sperimentali unitamente ad una ricca bibliografia sui canali K+ [2] e sul ruolo stesso del K

+ ci hanno

portato a ipotizzare che una fine regolazione della concentrazione di K+ stia alla base del “corretto

funzionamento” delle cellule. Da qui l’esigenza di valutare se K+

entri o no nelle cellule in seguito al

trattamento con K:D-Rib. La concentrazione di K+ è stata misurata sfruttando la formazione di una

macromolecola chiamata DNAzima [4]. Dalla concentrazione di DNAzima si è in grado, attraverso

spettroscopia UV-VIS, di misurare se lo ione K+ è presente nella soluzione. Abbiamo quindi

verificato la formazione di questa molecola in presenza di K:D-Rib 5mM. Il DNAzima così formato

può essere utilizzato come biosensore per la misura della concentrazione del K+ nel mezzo cellulare,

prima e dopo il trattamento. Risultati preliminari sembrano indicare che il surnatante delle HTB-126

trattate con K:D-Rib 5mM per 48h mostrano una concentrazione di DNAzima inferiore rispetto al

DMEM (terreno di coltura delle cellule) con K:D-Rib 5mM, ma superiore al solo DMEM ed al

surnatante del controllo (HTB-126 non trattate). Possiamo dire che una parte di K+

entri all’interno

della cellula e che il DNAzima possa essere utilizzato come biosensore di K+.

Bibliografia:

[1] Ronald Ouwerkerk, Michael A. Jacobs , Katarzyna J. Macura, Antonio C. Wolff, Vered Stearn, Sarah D. Mezban, Nagi F.

Khouri, David A. Bluemke, Paul A. Bottomley Elevated tissue sodium concentration in malignant breast lesions detected with

non-invasive 23Na MRI. Breast Cancer Res Treat (2007) 106:151–160.

[2] Zhiguo Wang Roles of K+ channels in regulating tumour cell proliferation and apoptosis. Eur J Physiol (2004) 448: 274–

28:

[3] S. Croci, L. Bruni, S. Bussolati, M. Castaldo, M. Dondi Potassium bicarbonate and D-ribose effects on A72 canine and

HTB-126 human cancer cell line proliferation in vitro. Cancer Cell International (2011) vol. 11 11-30.

[4] Travascio P, Li Y, Sen D.. DNA-enhanced peroxidase activity of a DNA-aptamer-hemin complex. Chem Biol (1998) 5:5

05–517.

P18-Contenuto e mappa di distribuzione del magnesio intracellulare

in cellule farmaco-resistenti e -sensibili

E. Malucelli,1,5

, S. Lagomarsino2, L. Merolle

1, C. Marraccini

3, A. Sargenti

1, C. Cappadone

1, G.

Farruggia1,5

, A. Cedola4, M. Fratini

4, A. Notargiacomo

4, M. Lombardo

6, C. Trombini

6,

7A.

Gianoncelli, S. Iotti1,5

.

1Dipartimento Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;

2Istituto per i Processi Chimico-

Fisici, c/o Dipartimento di Fisica, Università la Sapienza, Roma, 3Dipartimento di Scienze della Vita,

Università di Modena e Reggio Emilia; 4Istituto di Fotonica e Nanotecnologie - CNR, Roma;

5Istituto

Nazionale Biostrutture e Biosistemi; 6Dipartimento di Chimica, Università di Bologna;

ELETTRA -

Sincrotrone Trieste S.c.p.A., Basovizza Trieste

Introduzione

Il magnesio nelle cellule gioca un ruolo importante sia strutturale che di regolazione. Nonostante la

copiosa mole di dati che si possono trovare sulla biochimica del magnesio, la fotografia della sua

distribuzione e la comprensione della sua omeostasi sono ancora incomplete sia per limitazioni

strumentali che per difficoltà concettuali. I recenti sforzi nell’applicazione di nuove tecniche di

imaging nel campo della ricerca sul magnesio non hanno permesso ancora l'accurata mappatura édella

distribuzione e del contenuto intracellulare di questo ione perché l'acquisizione di informazioni

dettagliate su processi intracellulari richiede una elevata risoluzione spaziale, dati quantitativi e

informazioni chimiche. Per riuscire a soddisfare tutti questi requisiti, abbiamo dimostrato in un

recente articolo [1] che è possibile unire informazioni sulla composizione degli elementi chimici,

utilizzando X-Ray Fluorescence Microscopy (XRFM) e sulla morfologia cellulare, tramite Atomic

Force Microscopy (AFM). Combinando queste due tecniche è possibile quantificare la concentrazione

di qualsiasi elemento. Grazie ai recenti miglioramenti delle sorgenti di raggi X dei sincrotroni di terza

generazione e al miglioramento delle ottiche di focalizzazione, la XRFM rappresenta la tecnica ideale

| 67

per effettuare questo tipo di misure. In particolare, la XRFM è un metodo con elevata sensibilità per

mappare la distribuzione di elementi all’interno delle cellule come Carbonio, Azoto, Ossigeno, Sodio

e Magnesio in una singola acquisizione.

Obiettivo

Lo scopo di questo studio è confrontare il contenuto e la distribuzione di Magnesio in linee cellulari

tumorali chemio-resistenti e -sensibili fissate chimicamente. Il modello sperimentale utilizzato è una

linea cellulare umana di carcinoma del colon (LoVo) sensibili e resistenti alla doxorubicina, uno dei

farmaci maggiormente utilizzato nella terapia di tumori solidi.

Metodi

XRFM può mappare il contenuto degli elementi ma non la concentrazione, che è la variabile rilevante

nel contesto biologico. Abbiamo affrontato questo problema combinando XRFM (risoluzione spaziale

0.5x0.5 micrometri) con la AFM (risoluzione spaziale 0.12x0.12 micrometri) che consente di misurare

lo spessore della cellula analizzata. Questa combinazione di tecniche ha richiesto l'implementazione di

un nostro algoritmo di "multimodal fusion" che consente di allineare immagini ottenute con tecniche e

risoluzioni spaziali diverse. Questo nuovo approccio sperimentale offre il vantaggio di combinare le

informazioni sul contenuto degli elementi con informazioni morfologiche di una singola cellula

entrambe con risoluzione spaziale sub-micrometrica.

Risultati

Utilizzando questo approccio abbiamo determinato:

i) Nella cellule farmaco resistenti analizzate, il contenuto (espresso in frazione in peso) di magnesio è

maggiore che nelle cellule sensibili. In particolare nelle cellule resistenti abbiamo ottenuto un valore

di magnesio oltre 5 volte superiore rispetto alla sensibile in una ROI (8x8 mm) posizionata in

corrispondenza del nucleo.

ii) La mappa di magnesio intracellulare mostra una marcata differenza nel pattern di distribuzione tra le

cellule farmaco-resistenti e -sensibili.

Conclusioni

I risultati di questo lavoro confermano anche in cellule doxorubicina resistenti un maggiore contenuto

di magnesio intracellulare rispetto alle sensibili come recentemente osservato con assorbimento

atomico in una linea cellulare cis-platino resistente [2]. Inoltre la diversa distribuzione riscontrata

fornisce una ulteriore evidenza del ruolo del magnesio nella genesi del fenotipo della farmaco-

resistenza. Riteniamo quindi che questa metodologia di analisi possa diventare un sistema di

riferimento non solo per la misura del Magnesio, ma anche per altri elementi leggeri. Inoltre

rappresenta un prezioso strumento per un’accurata mappatura di diversi elementi intracellulari sia in

condizioni patologiche che normali.

Bibliografia

1. Lagomarsino S., Iotti S., Farruggia G., Cedola A., Trapani V., Fratini M., Bukreeva I., Notargiacomo A., Mastrototaro L., Marraccini C., Sorrentino A., McNulty I., Vogt S., Legnini D., Kim S., Giagnoncelli A. Maier J.A.M, Wolf. F.I. Intracellular

concentration map of magnesium in whole cells by combined use of X-ray fluorescence microscopy and atomic force

microscopy. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 66 (11–12), 834–840, 2011 2. Marverti G., Ligabue A., Montanari M., Guerrieri D., Cusumano M., Di Pietro M.L., Troiano L., Di Vono E., Iotti S.,

Farruggia G., Wolf F.I., Monti M.G., Frassineti C. Characterization of the cell growth inhibitory effects of a novel DNA-

intercalating bipyridyl-thiourea-Pt(II) complex in cisplatin-sensitive and-resistant human ovarian cancer cells. Invest New Drugs, 29(1), 73-86, 2011.

Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna,

tel. 051 2095625, e-mail [email protected]

http://www.sciencedirect.com/science/journal/05848547

http://www.sciencedirect.com/science/journal/05848547/66/11


68 |

P19-Modificazioni del contenuto intracellulare di magnesio durante

l’apoptosi mitocondrio-mediata: studi degli eventi precoci correlati

al potenziale mitocondriale

1L. Merolle,

1C. Cappadone,

1,2G. Farruggia,

3C. Marraccini,

1A. Sargenti,

4A. Colanardi,

1,2S. Iotti

1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;

2 Istituto Nazionale Biostrutture e

Biosistemi, 3Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia;

4Istituto di

Farmacologia Traslazionale- CNR L'Aquila.

L’apoptosi non solo è un processo geneticamente controllato per il mantenimento dell’omeostasi

tissutale, ma è uno degli effetti antineoplastici indotti da molti agenti chemioterapici. Diversi cationi

sono coinvolti nei processi apoptotici, e la maggiore enfasi è stata posta sul ruolo giocato dagli ioni

calcio, considerato un importante secondo messaggero intracellulare. Più recentemente l’attenzione si

e' focalizzata nel coinvolgimento del magnesio nei processi apoptotici, anche se la letteratura

sull'argomento è tuttora piuttosto scarsa e spesso presenta risultati contraddittori.

Uno studio recente ha evidenziato l’attività antitumorale di un nuovo derivato indolico, MM67, che è

in grado di attivare l’apoptosi mitocondrio-mediata e di determinareun calo del contenuto

intracellulare di magnesio in cellule di adenocarcinoma umano del colon, HT-29 [1]. Le cellule

trattate con questo agente proapoptotico mostrano un arresto nella fase G2/M del ciclo cellulare, un

aumento significativo dell’espressione di Bax, la depolarizzazione della membrana mitocondriale e

un netto rilascio di citocromo c dal compartimento mitocondriale [2]. Il mitocondrio è l’organello di

stoccaggio del magnesio intracellulare [3], e l’osservazione che nell’apoptosi indotta da MM67 si

osserva una diminuzione dello ione ci ha fatto ipotizzare che il magnesio sia coinvolto nella via

intrinseca di induzione di apoptosi.

Scopo di questo lavoro è stato quello di seguire le variazioni temporali del magnesio, sia libero che

totale, durante l’apoptosi indotta da MM67 e di valutarne la correlazione con le variazioni del

potenziale mitocondriale (Δ m). Tutte le analisi sono state effettuate in citofluorimetria: il potenziale

mitocondriale è stato valutato mediante la marcatura delle cellule con la sonda mitocondriale

DiOC6(3), mentre il magnesio libero è stato determinato mediante marcatura con la sonda

commerciale MagFluo4-AM [4] e il magnesio totale mediante marcatura con la sonda non

commerciale di recente sintesi DCHQ5 [5].

Nei primi trenta minuti dopo il trattamento si è riscontrato un aumento del Δ m, seguito da una

marcata depolarizzazione nelle successive 48 ore. Il magnesio libero intracellulare ha mostrato un

andamento parallelo, con un incremento nella prima mezzora, seguito da una diminuzione nelle ore

successive. Il magnesio totale invece decresceva fino dai primi minuti.

Possiamo quindi concludere che l’apoptosi indotta da MM67 è caratterizzata da una diretta

correlazione tra il ΔΨm e il magnesio libero intracellulare, in accordo con quanto riportato in

letteratura [3]. I nostri dati inoltre confermano che i due pool cellulari di magnesio, quello libero e

quello totale hanno ruoli diversi e meccanismi indipendenti di regolazione.

Questo rappresenta uno studio preliminare perché rimane da chiarire se questi movimenti del

magnesio che seguono il trattamento con MM67 siano un epifenomeno o se siano coinvolti nei

meccanismi della cascata apoptotica mitocondrio-mediata.

Bibliografia

1. Cappadone C, Merolle L, Marraccini C, Farruggia G, Sargenti A, Locatelli A, Morigi R, Iotti S., Intracellular magnesium

content decreases during mitochondria-mediated apoptosis induced by a new indole-derivative in human colon cancer cells (2012) Magnes. Res. 25(3):104-11.

2. Andreani A, Granaiola M, Locatelli A, Morigi R, Rambaldi M, Varoli L, Calonghi N, Cappadone C, Farruggia G, Stefanelli

C, Masotti L, Nguyen TL, Hamel E, Shoemaker RH, Substituted 3-(5-imidazo[2,1-b]thiazolylmethylene)-2-indolinones and analogues: synthesis, cytotoxic activity, and study of the mechanism of action (2012) Med Chem; 55:2078-88.

3. Kubota T, Shindo Y, Tokuno K, Komatsu H, Ogawa H, Kudo S, Kitamura Y, Suzuki K, Oka K. Mitochondria are

intracellular magnesium stores: investigation by simultaneous fluorescent imagings in PC12 cells (2005) Bioch. et Biophys. Acta 1744 19–2 .

| 69

4. Lee S, Lee HG, Kang SH. Real-time observations of intracellular Mg2+ signaling and waves in a single living ventricular

myocyte cell (2009) Anal Chem.,812:538-42.

5. Farruggia G, Iotti S, Lombardo M, Marraccini C, Petruzziello D, Prodi L, Sgarzi M, Trombini C, Zaccheroni N. Microwave

assisted synthesis of a small library of substituted N,N'-bis((8-hydroxy-7-quinolinyl)methyl)-1,10-diaza-18-crown-6 ethers (2010) J.Org.Chem.,75,6275-6278

Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel.

0512095625, e-mail [email protected]

P20-Valutazione dell’efflusso di magnesio indotto da cAMP in cellule

HL60 mediante un nuovo chemosensore fluorescente derivato dall’8-

idrossichinolina

1Marraccini C.,

2Sargenti A.,

2Merolle L.,

2Cappadone C.,

2,3G. Farruggia,

2,3.S. Iotti.

1Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia;

2Dipartimento di

Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna; 3Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi.

L’omeostasi del magnesio intracellulare è attivamente oggetto di studio, poiché è noto l’importante

ruolo che questo ione ricopre nelle funzioni cellulari. Molti studi hanno evidenziato che stimoli

metabolici o ormonali possono indurre flussi di magnesio attraverso la membrana plasmatica in brevi

intervalli di tempo. Questi flussi sono caratterizzati da piccole variazioni del magnesio libero

intracellulare ed elevate variazioni del magnesio totale. In particolare, è stato riportato che la

stimolazione con AMP ciclico (cAMP) provoca una variazione del magnesio totale entro 10 minuti

dal trattamento in cardiomiociti, suggerendo che questo stimolo induca un efflusso di magnesio nelle

cellule eccitabili [1]. In questo studio abbiamo voluto verificare se altri tipi di cellule manifestino

un'analoga risposta al trattamento con cAMP. A questo scopo abbiamo come modello la linea

leucemica promielocitica umana HL60, cellule non eccitabili ma altamente proliferanti. Per valutare

le variazioni del magnesio totale abbiamo utilizzato la sonda fluorescente DCHQ5, derivato fenilico

della famiglia di sonde basate su un estere azacrown coniugato con due 8-idrossichinoline. Questa

sonda ha una kd per il magnesio nell’ordine micromolare e pertanto è adatta alla determinazione del

magnesio totale intracellulare; inoltre è molto ritenuta all’interno delle cellule e la fluorescenza

intracellulare è stabile per piu’ di 30 minuti [2].

Il magnesio intracellulare è stato valutato mediante un saggio fluorimetrico, marcando le cellule con la

sonda alla concentrazione 15 microM. Le cellule sono state trattate con il sale butirrico del cAMP a

diverse concentrazioni, comprese tra 0,6 e 2 mM, e la fluorescenza è stata seguita per 10 minuti dopo

la stimolazione. In tutti i casi si è verificata una diminuzione della fluorescenza entro i primi tre minuti

dallo stimolo, diminuzione che poi è proseguita in modo molto più moderato nei minuti successivi.

L’analisi quantitativa rivela che circa il 10% del magnesio viene estruso, confermando che cAMP

induce un efflusso di magnesio anche in questo tipo di cellule. Abbiamo inoltre verificato, con un

saggio citofluorimetrico con Propidio Ioduro che la diminuzione della fluorescenza non è imputabile a

fenomeni aspecifici che inducono una permeabilizzazione membrana plasmatica.

Inoltre, mediante la marcatura delle cellule sonde commerciali e analisi citofluorimetriche, abbiamo

confermato che anche in questo modello cellulare la stimolazione con cAMP non comporta una

variazione della frazione libera ionizzata [3] mentre induce una iperpolarizzazione del mitocondrio,

come riportato in letteratura [4].

In conclusione abbiamo dimostrato che la stimolazione con cAMP correla con l’efflusso extracellulare

di magnesio anche in cellule proliferanti. Questo fornisce ulteriori evidenze all’ipotesi che il magnesio

possa considerarsi un secondo messaggero intracellulare. Infine queste misure hanno confermato che

la DCHQ5 è uno strumento di analisi estremamente utile per lo studio dell’omeostasi del magnesio, e

che può essere utilizzata sia per la determinazione quantitativa del magnesio cellulare che per

monitorare i flussi di questo ione.


70 |

Bibliografia

1. Romani A, Dowell E, Scarpa A. Hormonal stimulation of Mg2+ uptake in hepatocytes. Regulation by plasma membrane and

intracellular organelles (1991), J Biol Chem, 266:24376-24384;

2. Marraccini C, Farruggia G, Lombardo M, Prodi L, Sgarzi M, Trapani V, Trombini C, Zaccheroni N, Wolf F.I, Iotti S. Diaza-

18-crown-6 hydroxyquinoline derivatives as flexible tools for the assessment and imaging of total intracellular magnesium

(2012), Chemical Science, 3, 727-734

3. Romani AM. Cellular magnesium homeostasis. (2011), Arch. Biochem. Biophys., 512:1-23.

4. Zungu IL, Hawkins Evans D, Abrahamse H. Mitochondrial responses of normal and injured human skin fibroblasts following

low level laser irradiation-an in vitro study (2009), Photochem. Photobiol., 85(4):987-996;

5. Li FY, Chaigne-Delalande B, Kanellopoulou C, Davis JC, Matthews HF, Douek DC, Cohen JI, Uzel G, Su HC, Lenardo MJ.

Second messenger role for Mg2+ revealed by human T-cell immunodeficiency (2011), Nature, 475(7357):471-6.

Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna,

tel. 051 2095625, e-mail [email protected]

P21-Nuove prospettive nella determinazione del magnesio

intracellulare

1Sargenti A.,

1Merolle L. ,

1Malucelli E.,

2Andreani G.,

1Cappadone C.,

1,4Farruggia G.,

1,4Iotti S.,

3Marraccini C.,

4Trombini C.,

4Lombardo M.

. 1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;

2Dipartimento di Scienze Mediche

Veterinarie, Università di Bologna; 3Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e

Reggio Emilia; 4

Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi, 4Dipartimento di Chimica, Università di

Bologna.

Il magnesio è essenziale per moltissimi processi biologici, ma la sua omeostasi cellulare non è ancora

stata completamente chiarita. In particolare è noto che il magnesio libero ionizzato e quello totale sono

sottoposti a meccanismi di regolazione diversi e indipendenti tra loro: risulta quindi cruciale potere

discriminare tra le due frazioni. Mentre per il magnesio libero ionizzato sono disponibili molte sonde

fluorescenti, non esistono sonde commerciali in grado di valutare il magnesio totale. Pertanto è di

notevole interesse una nuova famiglia di sonde ottenuta coniugando ad un etere corona due residui di

8-idrossichinolina (DCHQ) diversamente sostituita. Queste sonde mostrano una notevole affinità e

specificità per il magnesio [1]. In particolare, la sonda capostipite (DCHQ1) ha permesso di

visualizzare la distribuzione intracellulare del magnesio in cellule vitali e di determinare, con un

saggio spettrofluorimetrico, il contenuto di magnesio in campioni cellulari. I dati sono sovrapponibili

a quelli ottenuti mediante spettrometria di assorbimento atomico (AAS). Rispetto a questa tecnica, il

dosaggio effettuato mediante questa sonda presenta l’indubbio vantaggio di richiedere campioni molto

più ridotti (di almeno dieci volte), e l'utilizzo di strumentazioni di più larga diffusione e con minori

problematiche riguardanti la sicurezza [2].

Tuttavia, la sonda DCHQ1 ha mostrato alcune limitazioni di utilizzo, come una bassa ritenzione

intracellulare e un parziale "fotobleaching". Inoltre è eccitabile solo nell’UV, limitandone l'uso in

citofluorimetria o in microscopia confocale.

Un nuovo derivato fenilico, DCHQ5, mostra invece caratteristiche molto più interssanti: è altamente

ritenuta nelle cellule, il complesso con il magnesio è altamente fluorescente, è molto stabile e può

essere eccitato anche nel visibile [3].

Lo scopo di questo lavoro è quindi stato quello di valutare l’applicabilità della DCHQ5 alla

determinazione del magnesio totale intracellulare attraverso saggi citofluorimetrici e

spettrofluorimetrici.

Il modello cellulare utilizzato sono cellule leucemiche umane HL60, una leucemia promielocitica che

può essere indotta a differenziare con dimetilsolfossido (DMSO). Questo trattamento induce già dopo

3 giorni il blocco proliferativo delle cellule in fase G0/G1 e parallelamente il dimezzamento del


| 71

magnesio totale, che passa da una media di 25 nmoli/106 cell a circa 12 nmoli/10

6 cell [2].

L’analisi citofluorimetrica effettuata utilizzando la sonda DCHQ5 sia eccitando nell’UV che nel

visibile evidenzia che l’intensità di fluorescenza nelle cellule differenziate è circa dimezzata rispetto

alle cellule proliferanti, come mostrato nella tabella I che riporta i dati di un tipico esperimento.

Dato che l’analisi citofluorimetrica fornisce solo un dato semiquantitativo, abbiamo valutato la

capacita' analitica di questa sonda ad un classico saggio di tipo fluorimetrico, utilizzando campioni di

cellule lisate per sonicazione. I risultati ottenuti hanno mostrato un’ottima sovrapponibilità con i quelli

ottenuti sugli stessi campioni in AAS, come riportato nella tabella II.

Possiamo quindi concludere che la sonda DCHQ5 risulta un ottimo chemosensore per la

determinazione sia quantitativa che qualitativa del magnesio intracellulare, ampliando l'applicabilità di

questa famiglia di sonde a sistemi biologici.

Tab. II Quantificazione del magnesio intracellulare in diversi campioni di

cellule, utilizzando il saggio fluorimetrico con la sonda DCHQ5 e la

determinazione mediante AAS

Campione DCHQ5

Mg (nmol/106 cells)

AAS

Mg (nmol/106 cells)

HL60 121p 19,75 ± 0,76 22,78 ± 0,38

HL60 124p 22,93 ± 1,30 20,70 ± 0,61

HL60 128p 23,77 ± 1,14 24,70 ± 0,89

HT29 67p 24,31 ± 1,13 23,94 ± 0,89

HT29 69p 23,96 ± 0,37 21,17 ± 0,71

Bibliografia

1] Farruggia G., Iotti S., Prodi L., Montalti M., Zaccheroni N., Savage P.B., Trapani V., Sale P., Wolf F.I. 8-hydroxyquinoline

derivatives as fluorescent sensors for magnesium in living cells. Journal of the American Chemical Society 128, 344-50, 2006

2] Farruggia G., Iotti S., Prodi L., Zaccheroni N., Montalti M., Savage P., Andreani G., Trapani V., Wolf F.I.,

Hydroxyquinoline derivatives as Fluorescent Probes to Measure Intracellular Magnesium: Insight into Characteristics and Biological Applications, Journal of Fluorescence, 19, 11–19, 2009

3] Marraccini C., Farruggia G., Lombardo M., Prodi L., Sgarzi M., Trapani V., Trombini C., Zaccheroni N., Wolf F.I., Iotti S.

Diaza-18-crown-6 hydroxyquinoline derivatives as flexible tools for the assessment and imaging of total intracellular magnesium. Chemical Science, 3, 727-734, 2012

Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel. 051 2095625, e-mail [email protected]

P22-La carenza di magnesio inibisce la progressione del ciclo

cellulare in cellule di osteosarcoma umano

1Cappadone C.,

1,2Farruggia G.,

1Merolle L.,

3Marraccini C. ,

1Sargenti A.,

1,2Malucelli E.,

1,2Iotti S.

1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;

2 Istituto Nazionale di Biostrutture

e Biosistemi; 3 Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio

Vi sono molte evidenze che suggeriscono una correlazione tra la disponibilità di magnesio e la

proliferazione cellulare e, in particolare, è stato ampiamente dimostrato che la carenza di questo ione

inibisce la proliferazione in molte linee cellulari di diversa origine, normali e trasformate [1]. Tuttavia,

i meccanismi molecolari che sottendono a questo fenomeno non sono ancora stati ben chiariti. In

questo lavoro abbiamo quindi studiato l’effetto della carenza di magnesio sulla proliferazione e

Tab.I. Canale medio della distribuzione di fluorescenza di cellule marcate con

DCHQ5 5 µM

Eccitazione 360 nm Eccitazione 488 nm

HL60 proliferanti 94 83

HL60 differenziate 45 43

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=16390164&query_hl=1&itool=pubmed_docsum


72 |

sull’espressione di alcune proteine coinvolte nella progressione del ciclo cellulare in cellule di

osteosarcoma umano SaOs-2 e U2OS.

Le cellule sono coltivate per 24 ore in terreno privo di magnesio e contenente lo 0,5% di siero fetale

bovino (FBS) deprivato dello ione. Questo trattamento ha sincronizzato le cellule nella fase G0/G1 e

ha ridotto il contenuto di magnesio intracellulare. Le cellule sono state quindi coltivate in terreno

contenente il 5% di FBS e in presenza o in assenza di MgCl2 1 mM per 24 ore. Sebbene sia riportato

che le cellule tumorali sono meno sensibili alla deprivazione di magnesio [2], la presenza dello ione

nel terreno di coltura ha incrementato notevolmente la proliferazione delle cellule di osteosarcoma

rispetto alle cellule deprivate. L’analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria a flusso, indica

che le cellule deprivate sono bloccate in G0/G1 anche dopo l’aggiunta di FCS, mentre nelle cellule

coltivate in terreno completo di magnesio si osserva un netto aumento delle cellule in fase S e in fase

G2/M.

A livello della transizione G1/S le attività delle chinasi ciclino-dipendenti sono regolate positivamente

dal legame con le loro cicline e negativamente dagli inibitori CKI. Abbiamo quindi investigato

l'espressione della proteina p21 e del suo attivatore trascrizionale p53.

Dopo l'aggiunta di siero, le cellule coltivate in assenza di magnesio presentano un netto calo del

contenuto di questo ione, mentre non presentano variazioni significative di p21 e p53 rispetto alle

cellule in terreno contenente MgCl2. Alla luce dei risultati ottenuti, si può concludere che l'arresto

proliferativo dipende dalla riduzione del contenuto di magnesio, ma è p53 indipendente. Studi futuri

saranno indirizzati a chiarire i meccanismi e i bersagli molecolari responsabili di questo blocco.

Bibiliografia

1. Ikari A, Sawada H, Sanada A, Tonegawa C, Yamazaki Y, Sugatani J. Magnesium deficiency suppresses cell cycle

progression mediated by increase in transcriptional activity of p21(Cip1) and p27(Kip1) in renal epithelial NRK-52E

cells. J. Cell. Biochem. 2011 :112(12):3563-72

2. Wolf F., Trapani V. Cell (patho)physiology of magnesium. Clin. Sci. 2008: 114(1):27-35

Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, tel 051 2095626, e

mail [email protected]

P23-Behavior of classical and non-classical soluble HLA class I

molecules in patients with chronic hepatitis C virus infection before

and after pegylated interferon and ribavirin treatment: potential

role as markers of immune activation and response to antiviral

treatment.

G. Murdaca1, P. Contini

1, P. Cagnati

1, S. Marenco

2, G. Pieri

2, F. Lantieri

3, A. Picciotto

2, F. Puppo

1

1Clinical Immunology Unit, Department of Internal Medicine, University of Genoa, Genoa, Italy

2Gastroenterology Unit, Department of Internal Medicine, University of Genoa, Genoa, Italy

3Department of Health Sciences, Biostatistic Unit, University of Genoa, Genoa, Italy

The human major histocompatibility complex encodes two sets of HLA class I (HLA-I) molecules,

which have been termed class Ia (or classical) and class Ib (or non-classical) molecules. The class Ia

antigens include the gene products of HLA-A, -B and –C loci and are characterized by a broad tissue

expression and by a high degree of polymorphism.1,2

The class Ib antigens include the gene products

of HLA-E, -F and –G loci and are characterized by a restricted tissue distribution and by a limited

polymorphism.1,3

We have previously reported that their serum levels were significantly elevated in

human immunodeficiency virus (HIV)-1-infected subjects as compared to HIV-negative controls4-7

,


| 73

that their increases correlated with disease progression and development of the Acquired

Immunodeficiency Syndrome (AIDS), and, finally, that their decreases significantly correlated with

virological and immunological response to Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART).4-6,18

These results suggest that the measurement of sHLA-A, -B, -C and sHLA-G antigens serum levels

might represent a useful surrogate marker to monitor virological response and immune reconstitution

in HIV-positive subjects undergoing HAART treatment. In the present study, we measured the sHLA-

A, -B, -C and sHLA–G serum levels in 40 HCV genotype 1-infected patients treated with PEG-IFN-α

plus ribavirin at baseline (T0) and at months 3, 6 and 12 (T3, T6 and T12) and, finally, 6 months (T18)

after the end of the antiviral treatment. Finally, we correlate the baseline sHLA-A, -B, -C and sHLA–

G serum levels with the levels detected in a group of viremic HAART treatment-“ naïve” HIV-1-

infected patients and in a groupof healthy controls. sHLA-A, -B, -C antigen serum levels at T0 were

significantly higher in both groups of responder (R) and non responder (NR) HCV-infected patients as

compared to healthy controls and viremic HIV-infected individuals. sHLA-G serum levels at T0 were

also significantly higher in both groups of R and NR patients as compared to healthy controls but

lower as compared to viremic HIV-infected individuals. sHLA-A, -B, -C and –G antigen serum levels

significantly decreased in the group of R patients from T0 to T18. Decrease of both sHLA-A-B-C and

sHLA-G serum levels significantly correlated with the decrease of serum HCV-RNA levels, AST,

ALT, γGT and ALP in the group of R patients. In conclusion, sHLA-A, -B, -C and sHLA–G antigens

play a role in the pathogenesis and progression of HCV infection. PEG-IFN-α and ribavirin

association therapy induced a significant reduction of circulating soluble HLA molecules correlating

with viral clearance. Therefore, sHLA-A, -B, -C and -G serum level could be proposed as a useful

surrogate marker to monitor patients with HCV during PEG-IFN-α and ribavirin association therapy

and, finally, to discriminate R from NR HCV-infected subjects.

References

1. Contini P, Ghio M, Poggi A, Filaci G, Indiveri F, Ferrone S, Puppo F. Soluble HLA-A, -B, -C and –G molecules induce

apoptosis in T and NK CD8+ cells and inhibit cytotoxic T cell activity through CD8 ligation. Eur J Immunol 2003;

33:125-34. 2. Ploegh HL, Orr HT, Strominger JL. Major histocompatibility antigens: the human (HLA-A, -B, -C) and murine (H-2K, H-

2D) class I molecules. Cell 1981; 24:287-99.

3. O’Callaghan CA, Bell JL. Structure and function of the human MHC class Ib molecules HLA-E, HLA-F and HLA-G.

Immunol Rev 1998;163:129-38.

4. Murdaca G, Contini P, Setti M, Cagnati P, Villa R, Lantieri F, Indiveri F, Puppo F. Behavior of serum human major

histocompatibility complex class I antigen levels in human immunodeficiency virus-infected patients during antiretroviral therapy: correlation with clinical outcome. Hum Immunol 2007;68(11):894-900.

5. Murdaca G, Contini P, Setti M, Cagnati P, Lantieri F, Indiveri F, Puppo F. Behavior of non-classical soluble HLA class G

antigens in human immunodeficiency virus 1-infected patients before and after HAART: comparison with classical soluble HLA-A, -B, -C antigens and potential role in immune-reconstitution. Clin Immunol 2009;133(2):238-44.

6. Murdaca G, Contini P, Setti M, Cagnati P, Spanò F, Lantieri F, Puppo F. Soluble human leukocyte antigen-G serum levels

in patients with acquired immune deficiency syndrome affected by different disease-defining conditions before and after antiretroviral treatment. Hum Immunol 2011;72(9):712-6.

7. Puppo F, Brenci S, Lanza L, Bosco O, Imro MA, Scudeletti M, Indiveri F, Ferrone S. Increased level of serum HLA class

I antigens in HIV infection. Correlation with disease progression. Hum Immunol 1994; 40:259-66.

Corresponding author: G. Murdaca, MD PhD DIMI, Viale Benedetto XV, n. 6 16132 Genova – Italy, Phone: +390103537924,

Fax: + 390105556950, e-mail: [email protected]

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