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Relazione dell’Attività di Tirocinio in Systems Biology

Relazione dell’Attività di Tirocinio in Systems Biology

Dr. Giulio Spinozzi

[email protected]://giuliospinozzi.altervista.org/

cbna

Dipartimento di Ingegneria Informatica ed Elettronica

20 febbraio 2012

Dr. Giulio Spinozzi | Dipartimento di Ingegneria Informatica ed Elettronica | Perugia, Febbraio 2012 1 / 28

[email protected]

http://giuliospinozzi.altervista.org/

Relazione dell’Attività di Tirocinio in Systems Biology | Contenuti

Contenuti

1 Basi di Biologia

2 La Systems Biology

3 QuantiVcazione Automatica di Western Blot

4 Conclusioni e Sviluppi Futuri


Relazione dell’Attività di Tirocinio in Systems Biology | Basi di Biologia

La Cellula

Cellula EucariotaInvolucro nucleare sul DNA ,organelli intra-cellulari rivestiti,mitosi

Cellula ProcariotaMolto più piccola, parete cellulare,scissione binaria, organismiunicellulari



La Divisione Cellulare

MitosiDivisione equazionale della cellulaeucariote, 2 cellule diploidi, cellulesomatiche

Meiosi4 cellule aploidi, riproduzionesessuale, riduzione da corredo indoppia copia a corredo a semplicecopia, crossing-over



Il DNA

AcidoDesossiribonucleico

contiene leinformazioni genetichenecessarie allabiosintesi di RNA eproteine

La disposizione insequenza delle quattrobasi costituiscel’informazione genetica



La Duplicazione di DNAOgni volta che una cellula si divide:

La ReplicazioneOgni Vlamento è uno stampoper uno nuovo complementare

In entrambe le direzioni

Inizia con RNA-innesco

DNA PolimerasiSintetizza i nuovi Vlamenti

Aggiunge uno a uno i nucleotidiai Vlamenti in crescita

Crea gli mRNA



Sintesi delle Proteine

Avviene sui Ribosomi

Servono altre molecole diRNA: tRNA e mRNA

tRNA: mette ciascuncodone di mRNA con il suoamminoacido

mRNA: porta informazionidurante la trascrizione dalDNA ai siti della sintesiproteica (ogni serie di trenucleotidi dell’mRNAforma il cordone per unamminoacido)



Central Dogma: Informazione Genetica Unidirezionale



Carcinoma del Polmone

Principale causa di mortalità tumorale

Numerosi studi hannoprovato che:

Potenziali bersagliterapeutici per i recettoridella famiglia dell’EGFR edell’IGF1R

L’attivazione costitutivadel dominiotirosin-chinasico è in gradodi indurre: unaproliferazione disregolatafavorendone le capacitàinvasive e metastatiche,l’angiogenesi e lasopravvivenza cellulare.


Relazione dell’Attività di Tirocinio in Systems Biology | La Systems Biology

L’Approccio della Systems Biology

La Systems Biology indaga il funzionamento e la funzione di reti dinamiche inter- eintra-cellulari, utilizzando approcci signal- e systems-oriented.

Sistema Naturale: un aspetto del mondo che si studia

Sistema Formale: il contesto matematico impiegato per rappresentare ilSistema Naturale



Modellazione di una Rete BiochimicaUna generica reazione chimica:

|l1|S1 + |l2|S2 + ...+ |li|Si −→ |li+1|Si+1 + |li+2|Si+2... (1)

li coeXciente stechiometrico, Si specie chimica. In cui valgono:

0 =

N∑︁i=1

(liSi) (2)

la velocità di reazione vale:

r(t) = − 1|li|

dSi(t)dt

= − 1|li+1|

dSi+1(t)dt

= − 1|li+2|

dSi+2(t)dt

= ... (3)

l’extent of a reaction (progresso della reazione):

∈ (t) =

⎧⎪⎨⎪⎩1li(Si(t)− Si(0)) reagenti

1li(Si(0)− Si(t)) prodotti

(4)



Reazioni Biochimiche Elementari

E’ possibile scomporre reazioni complessi, in reazioni elementari:

Mono-Molecolari: S1k−→ S2, r(t) = − dS1(t)

dt = kS1(t)

Bi-Molecolari: S1 + S2k−→ prodotti, r(t) = − dS1(t)

dt = − dS2(t)dt = −kS1(t)S2(t)

Ordini Superiori: |l1|S1 + |l2|S2 + ...+ |li|Si −→ |li+1|Si+1 + |li+2|Si+2...r(t) = k[S1(t)]n1 ...[Si(t)]ni [Si+1(t)]ni+1 ... = k

∏︀i[Si(t)]

ni

Reazioni Reversibili: S1k−1←−−−→k1

S2, r(t) = − dS1(t)dt = k1S1(t)− k−1S2(t) =

dS2(t)dt

dove ki rappresenta la velocità della reazione i.

Reazioni Consecutive: S1k1−→ S2

k2−→ S3Reazioni Auto-Catalitiche (prodotto accelera la propria produzione):S1

k−→S2

S2,

r(t) = − dS1(t)dt = dS2(t)

dt = d∈(t)dt = k1S1(t)S2(t) = k[S1(0)− ∈ (t)][S2(0)+ ∈ (t)]



Esempio di Modellazione Dinamica di una Rete - 1

Si consideri la seguente reazione che modella l’evoluzione delle concentrazioni direagenti e prodotti con la presenza di un enzima che catalizza la dinamica:

E+ Sk2←−−−→k1

ESk3−→ P+ E (5)

d[E]dt

= −k1[E][S] + k2[ES] + k3[ES]

d[S]dt

= −k1[E][S] + k2[ES]

d[ES]dt

= k1[E][S]− k2[ES]− k3[ES]

d[P]dt

= k3[ES]

(6)



Esempio di Modellazione Dinamica di una Rete - 2

Evoluzione temporale del substrato, enzima, complesso e del prodotto per la reazioneenzimo-cinetica. Soluzione esterna ed interna per i parametri Vssati:



Cross Talk dei Pathways EGR e IGF-1R nelle LineeCellulari Tumorali del Polmone (NSCLC)

Fatta la modellazione si vuole:Validare tramite esperimenti sudiverse linee cellulari tumorali ilcomportamento dinamicopredetto dal modello nellecondizioni wild type

Creare un algoritmo cherenda automatica laprocedura diquantiVcazione dei WesternBlot sulle linee cellulari



Tecniche Sperimentali - Western Blot

Aspetti sperimentali utili adindagare la trasduzione del

segnale cellulare

1 Proteine campione separate sugel in base al peso molecolare

2 Trasferimento su membrana dinitrocellulosa tramite E⃗

3 Saturazione, pulitura

4 Legame dell’anticorpo primario

5 Legame dell’anticorposecondario coniugato ad unenzima

6 Rilevazione, l’enzima coniugatoall’anticorpo secondario scindeun substrato che, incorrispondenza della proteinaspeciVca, sviluppa precipitatocolorato o chemioluminescenza



Sperimentazione - PianiVcazione Western Blot

Serie temporale per ogni singolo esperimento (AKT, EGFR, IGFR, ERK: fosforilate enon fosforilate):

Gel 1 t0 t1 t1 t1 t1 t2 t2 t2 t2 t3 t3Gel 2 t3 t3 t4 t4 t4 t4 t5 t5 t5 t5 t6Gel 3 t6 t6 t6 t7 t7 t7 t7 t8 t8 t8 t8Gel 4 t9 t9 t9 t9 X t0 t1 t1 t1 t1 t2

Tabella: Struttura Iniziale

Gel 1 t0 t1 t1 t1 t1 t2 t2 t2 t2Gel 2 t3 t3 t3 t3 t4 t4 t4 t4 t5Gel 3 t5 t5 t5 t6 t6 t6 t6 t7 t7Gel 4 t7 t7 t8 t8 t8 t8

Tabella: Struttura Finale, dopo revisione

dove t0 rappresenta la proteina all’istante iniziale, t1,....,t8 dopo 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50,60 minuti, in ognuna delle seguenti quattro condizioni: WT, L1, L2, L1 + L2.



Esempio di Lucidi di Western BlotEsposizioni 𝛽-Actina: 1s, 2s, 20s, 30s, 1m, 2m. Esposizioni Proteine: 15s, 1m, 5m, 30m,30m’. Esposizioni Proteine*: 1m, 5m, OverNight, OverNight’. Ora uniformate.

Figura: 𝛽-Actina (exp 20sec) Figura: proteine non fosforilate (exp 1min)Dr. Giulio Spinozzi | Dipartimento di Ingegneria Informatica ed Elettronica | Perugia, Febbraio 2012 18 / 28

Relazione dell’Attività di Tirocinio in Systems Biology | QuantiVcazione Automatica di Western Blot

I Passi dell’Algoritmo MATLAB

1 Acquisizione di tutte le immagini di WB

2 Ottimizzazione delle stesse (tramite Image Processing Toolbox)

3 Selezione e integrazione dei singoli blot (metodo Otsu)

4 Calcolo dell’ottimo tra tutte le esposizioni di 𝛽-Actina

5 Rapporto di tutte le proteine con l’esposizione precedentemente trovata di𝛽-Actina

6 Selezione della miglior condizione in tutte le esposizioni di ciascuna proteinarapportata alla 𝛽-Actina tramite clustering (in fase di sviluppo).



Acquisizione di tutte le Immagini di WB

Figura: Inserimento Parametri

Il salvataggio nel Workspace MATLAB:Tutte le immagini vengono salvate in unastruttura MATLAB (immagini)

In ogni riga è presente una immagine

Prima colonna il riferimento all’immagine

Seconda colonna immagine convertita dargb a scala di grigi (rgb2gray)

Terza colonna immagine ottimizzata

Integrazione dei blot



Ottimizzazione delle ImmaginiLe lastre vengono scannerizzate, ritagliate, successivamente lavorate:

Figura: Confronto tra le varie tecniche di ottimizzazione



Selezione e Integrazione dei Singoli Blot (Metodo Otsu) - 1Processo di integrazione dei blot su immagine ottimizzata (adapthisteq,Contrast-Limited Adaptive Histogram Equalization: CLAHE).



Selezione e Integrazione dei Singoli Blot (Metodo Otsu) - 2

Figura: Immagine abbastanza nitida

Il metodo Otsu esegue una sogliatura automatica dell’istogramma nelle immaginidigitali (graythresh).



Ottimo delle Esposizioni di 𝛽-ActinaSolitamente usata come controllo di caricamento, per veriVcare l’integrità dellecellule, la degradazione delle proteine, e nel Western Blot (come housekeeping).

Selezione dell’ottimo:VM per ogni condizione(WT, L1, L2, L1 + L2) eogni esposizione

VAR per ogni condizionee ogni esposizione

MED totale dei VM

VAR minima delle singolecondizioni

Ottimo: maggiornumero di condizioni amin(MED) e con laminima VAR.



Rapporto Proteine/Esposizione Ottima di 𝛽-ActinaSolitamente usata come controllo di caricamento, per veriVcare l’integrità dellecellule, la degradazione delle proteine, e nel Western Blot (come housekeeping).



Selezione della Miglior Condizione in tutte le Esposizionidi ogni Proteina/𝛽-Actina - 1

Figura: Schema a blocchi del processo di clustering



Selezione della Miglior Condizione in tutte le Esposizionidi ogni Proteina/𝛽-Actina - 2

Selezione dell’ottimo:Cluster su serietemporali (tramite ades. matrice disimilarità)

Selezione del clusterdesiderato (tramitederivata massima oaltro)


Relazione dell’Attività di Tirocinio in Systems Biology | Conclusioni e Sviluppi Futuri

Concludendo

Il periodo di tirocinio ha permesso di introdurmi in una branca dell’ingegneria, nuovaper me, molto interessante e aUascinante. I passi che ho seguito sono:

1 Studio delle necessarie basi di biologia

2 Introduzione alla Systems Biology

3 Attività di progetto/sperimentale

Sviluppi FuturiTerminare l’ultimo passo, tramite clustering, o altra tecnica

Conclusione degli esperimenti su tutte le linee cellulari

Applicazione dell’algoritmo su tutte le lastre prodotte

Confronto e analisi dei dati ottenuti

Validazione del modello


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