2009 Convegno Malattie Rare Parodi [23 01]
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Transcript of 2009 Convegno Malattie Rare Parodi [23 01]
La sierologia delle malattie La sierologia delle malattie bollose autoimmunibollose autoimmuni
Aurora Parodi, Emanuele Cozzani, Massimo Drosera
Di.S.E.M. Sezione di DermatologiaUniversità di Genova
Le malattie bollose autoimmuni hanno in comune il meccanismo patogenetico, il legame, cioè,
degli auto-anticorpi a specifiche degli auto-anticorpi a specifiche molecole di adesione tra
cheratinocita e cheratinocita e tra l’epidermide e il derma
Strutture di adesione intercellulari e Strutture di adesione intercellulari e della giunzione dermodella giunzione dermo--epidermicaepidermica
J.Cell.Mol.Med 2007
DIAGNOSI:DIAGNOSI:
�Clinica (eterogenea)
�Istologia (livello del distacco)�Istologia (livello del distacco)
�Immunopatologia (diretta ed indiretta)
DIAGNOSI: 4 GruppiDIAGNOSI: 4 Gruppi
�Pemfigo�Pemfigoidi�Pemfigoidi�Epidermolisi bollosa acquisita�Dermatite erpetiforme di Duhring
METODICHE SIEROLOGICHE:METODICHE SIEROLOGICHE:
�IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA
�ELISA
�IMMUNOBLOTTING �IMMUNOBLOTTING
�IMMUNOPRECIPITAZIONE
�IMMUNOMICROSCOPIA ELETTRONICA
L’IMMUNOFLUORESCENZA L’IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTAINDIRETTA
Utilizza come substrato la cute umana normale, l’esofago di scimmia, normale, l’esofago di scimmia,
e, meno frequentemente, l’esofago di cavia e la vescica di ratto
L’IMMUNOFLUORESCENZA L’IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTAINDIRETTA
Per le malattie della giunzione si può utilizzare la metodica della cute
“split”, con la quale si può avere non solo un aumento della sensibilità in solo un aumento della sensibilità in
quanto i siti antigenici sono più esposti, ma anche si può avere idea su quale
versante della giunzione dermo-epidermica si legano gli
anticorpi
ELISA, IMMUNOBLOTTING, ELISA, IMMUNOBLOTTING, IMMUNOPRECIPITAZIONEIMMUNOPRECIPITAZIONE
Con l’IFI non si ha l’identificazione degli antigeni target degli
autoanticorpi che invece è necessaria per la diagnosi corretta, e allora, la per la diagnosi corretta, e allora, la caratterizzazione della specificità
molecolare dei targets antigenici si ha con l’utilizzo di metodiche quali
l’ELISA, l’Immunoblotting e l’Immunoprecipitazione
ELISA: vantaggi
• molto sensibile
• rapida e di facile esecuzione
• misura il titolo anticorpale in maniera più precisa dell’ IFI e capace di monitorare la malattiadell’ IFI e capace di monitorare la malattia
Svantaggi:
• restrittiva in quanto non permette la valutazione di altre possibili reattività
Immunoblotting: vantaggi
• metodica estremamente specifica
• elevata sensibilità per la Dsg3 (75-90%)
• rompendo completamente le interazioni proteiche permette l’identificazione del singolo antigene proteiche permette l’identificazione del singolo antigene
• identificando l’antigene target permette una diagnosi di precisione
• metodica complementare all’IFI aumentando la percentuale diagnostica
Immunoblotting: svantaggi
• metodica non indicata per lo studio di complessi proteici a conformazione tridimensionale come la desmogleina 1
• metodica di esecuzione complessa da considerasi di secondo livello non sempre considerasi di secondo livello non sempre realizzabile in tutti i laboratori
• non permette il monitoraggio della malattia non essendoci una relazione tra gravità della malattia, titolo anticorpale in IFI e intensità della banda
• elevata sensibilità ma non in tutti i casi
Immunoprecipitazione: vantaggi
• metodica che preserva la conformazione tridimensionale dell’antigene
•particolarmente adatta per lo studio delle desmogleine e delle desmocollinedesmogleine e delle desmocolline
•elevata specificità e sensibilità
•attualmente è la metodica di riferimento per la diagnosi del PPN
Immunoprecipitazione: svantaggi
• ridotta solubilità delle interazioni proteina-proteina per cui a volte viene riconosciuto il complesso proteico e non il singolo antigene (subunità αβγαβγαβγαβγ laminina 5)(subunità αβγαβγαβγαβγ laminina 5)
• poco adatta allo studio delle IgA, rimane limitata alle malattie IgG mediate
• metodica complessa e costosa
• contatto con isotopi radiattivi
PEMFIGOPEMFIGO
PEMFIGOPEMFIGO
P. volgareP. superficialeP. erpetiformeP. erpetiforme
P. farmaco indottoP. paraneoplastico
P. a IgA
Strutture di adesione intercellulari e Strutture di adesione intercellulari e della giunzione dermodella giunzione dermo--epidermicaepidermica
IFI su tessuti epiteliali pluristratificati
(esofago di scimmia)
P. volgareP. superficiale
• anticorpi della classe IgG diretti verso la membrana cheratinocitaria
P. superficialeP. farmaco indottoP. erpetiformeP. paraneoplastico
IFI su tessuti epiteliali di transizione (vescica di ratto):
• anticorpi della classe IgG diretti verso la membrana cheratinocitaria
• Pemfigo paraneoplastico
Deposito alla membrana cheratinocitariaDeposito alla membrana cheratinocitaria
Desmogleina 3 : P. volgare mucoso puro
Desmogleina 1 e 3: P. volgare muco-cutaneo,P. erpetiforme
Desmogleina 1: P. superficiale
Desmocollina I/II: P. IgADesmocollina I/II: P. IgA
Envoplachina
Periplachina P. paraneoplastico
Desmoplachina I/II
Immunoblotting con estratto di cheratinociti
160
130
160
ELISA:
per la diagnosi indiretta del pemfigo: disponibili 2 ELISA per la Dsg1 e 3
Immunoprecipitazione:
utile soprattutto per confermare le reattività multiple in immunoblotting nella diagnosi del pemfigo paraneoplastico
Desmoplachina I
BPAgIBPAgI
Desmoplachina II
Periplachina
Envoplachina
PEMFIGOIDEPEMFIGOIDE
PEMFIGOIDEPEMFIGOIDE
P. bolloso di LeverP. della gravidanzaP. della gravidanzaP. delle mucoseP. anti p-200
Dermatite a IgA lineari
Strutture di adesione Strutture di adesione della giunzione dermodella giunzione dermo--epidermicaepidermica
IFI su tessuti epiteliali pluristratificati (cute umana normale, esofago di scimmia)
• anticorpi della classe IgG diretti verso la membrana basale
Pemfigoide
Pemfigoide delle mucose
Deposito alla membrana basale
Pemfigoide delle mucose
Epidermolisi bollosa acquisita
IFI su cute separata in NaCl (split):
Immunofluorescenza indiretta su cute “ split “:
• sensibilità del 50-80%
Deposito lineare alla giunzione dermo epidermica al tetto della bolla
• Antigene di 230 kDa:
Pemfigoide bolloso
(Pemfigo paraneoplastico)
• Antigene di 180 kDa:
Pemfigoide bolloso, delle mucose e della gravidanza
con le IgA: dermatite IgA lineari
Deposito lineare alla giunzione dermo-epidermica, al pavimento della bolla
Antigene di 290 kDa: EBA
Antigene 200-165 kDa (αααα3 lamina 5) : PM
Antigene 140 kDa (ββββ2 laminina 5): PM
Antigene 150 kDa (γγγγ2 laminina 5): PM
Antigene 200 kDa: PB
Deposito lineare alla giunzione dermo-epidermica
al tetto e al pavimento della bolla
• Antigene di 180 kDa:
Pemfigoide delle mucose
ELISA:
per la diagnosi indiretta del pemfigoide: disponibili 2 ELISA per l’antigene di 180 e 230 kDa
Immunoblotting con estratto epidermico
EPIDERMOLISI BOLLOSA EPIDERMOLISI BOLLOSA ACQUISITAACQUISITA
Deposito lineare alla giunzione dermo-epidermica,
al pavimento della bolla
Antigene di 290 kDa: EBA
Immunoblotting con estratto di derma:
• anticorpi classe IgG diretti verso l’antigene di 290 kDa (collagene VII)
• EBA
DERMATITE ERPETIFORME DERMATITE ERPETIFORME DI DUHRINGDI DUHRING
DERMATITE ERPETIFORME DERMATITE ERPETIFORME DI DUHRINGDI DUHRING
DERMATITE ERPETIFORME DERMATITE ERPETIFORME DI DUHRINGDI DUHRING
ELISA: anticorpi anti-transglutaminasi
Immunomicroscopia elettronica indiretta:
• utile soprattutto per valutare la sede degli immunodepositi
• metodica poco utilizzata nella pratica clinica
Percorso diagnostico
Anamnesi/Clinica
Istologia/Immunofluorescenza direttaIstologia/Immunofluorescenza diretta
Immunofluorescenza indiretta
ELISA/Immunoblotting
Immunoprecipitazione