1 La Cromatografia Prof. S. Consoli Prof. A. Percolla.

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La CromatografiaLa Cromatografia

Prof. S. ConsoliProf. S. ConsoliProf. A. PercollaProf. A. Percolla

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La Cromatografia è una tecnica di separazione

La Cromatografia è una tecnica di separazione

Essa trova impiego sia in Essa trova impiego sia in campo analitico che preparativoche preparativo

Il nome cromatografia significa Il nome cromatografia significa disegno disegno coloratocolorato ee deriva dalle esperienze iniziali deriva dalle esperienze iniziali effettuate dal botanico russo Tswett che effettuate dal botanico russo Tswett che impiegò il metodo per la prima volta allo impiegò il metodo per la prima volta allo scopo di separare i pigmenti colorati delle scopo di separare i pigmenti colorati delle foglie.foglie.

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Esperienza di Tswett


Una colonna di vetro è Una colonna di vetro è riempita con Alriempita con Al22OO33 in in

polvere (fase fissa) ed polvere (fase fissa) ed un solventeun solvente

in cima alla colonna si in cima alla colonna si versa una soluzione di versa una soluzione di pigmenti.pigmenti.

Si procede quindi al Si procede quindi al lavaggio (eluizione) lavaggio (eluizione) della colonna con un della colonna con un solvente (fase mobile)solvente (fase mobile)

eluente(fase mobile)

colonnacromatografica

bande cromatografiche

riempimento AlAl22OO33

(fase fissa)(fase fissa)

I

IIIII

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man mano che si man mano che si aggiunge solvente e aggiunge solvente e procede l’eluizioneprocede l’eluizione

le bande si spostano le bande si spostano verso il bassoverso il basso

finché si raccolgono finché si raccolgono nei vasi posti in bassonei vasi posti in basso

eluente


bande cromatografiche in cammino

I

II

III

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L’eluizione è quasi L’eluizione è quasi completacompleta

Le bande I e II adesso Le bande I e II adesso sono uscite e sono sono uscite e sono state raccolte in due state raccolte in due contenitori diversicontenitori diversi

Per la sostanza III Per la sostanza III bisogna continuare bisogna continuare l’eluizione.l’eluizione.

eluente


la bandacromatografica III

si è spostata in fondo alla colonna

I

bande cromatografiche già eluite I e II

II

III

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La cromatografia è basata su quattro fenomeni fondamentali:La cromatografia è basata su quattro fenomeni fondamentali:

AdsorbimentoAdsorbimento RipartizioneRipartizione Scambio ionicoScambio ionico EsclusioneEsclusione

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AdsorbimentoAdsorbimento E’ dovuto alle E’ dovuto alle deboli deboli forze di attrazione forze di attrazione che che

esistono esistono tra le molecole di un solido e quelle di tra le molecole di un solido e quelle di un liquido un liquido (o di un gas) con cui il solido si trova a (o di un gas) con cui il solido si trova a contatto.contatto.

Un esempio comune di adsorbimento si verifica tra Un esempio comune di adsorbimento si verifica tra il fumo di sigaretta e la lana dei vestiti o i capelli.il fumo di sigaretta e la lana dei vestiti o i capelli.

L’adsorbimento è un fenomeno reversibileL’adsorbimento è un fenomeno reversibile

infatti basta far arieggiare gli indumenti per infatti basta far arieggiare gli indumenti per attenuare l’odore del fumo.attenuare l’odore del fumo.

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AdsorbimentoAdsorbimento la quantità di adsorbato dipende dalla superfice la quantità di adsorbato dipende dalla superfice

di contatto tra il gas ed il solido.di contatto tra il gas ed il solido.

•ma dipende anche dallapressione del gas e dalla temperatura.

Riscaldando il sistema Riscaldando il sistema le molecole di gas le molecole di gas tendono a staccarsi tendono a staccarsi dalla fase fissa dalla fase fissa

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Equazione di FreundlichEquazione di Freundlich L’adsorbimento è illustrato dall’equazione L’adsorbimento è illustrato dall’equazione

di Freundlichdi Freundlich

CCff = a P = a P1/n1/n in cui :in cui :CCff = conc. nella fase fissa= conc. nella fase fissaP = pressione del gas a ed n dipendono dalla natura delle sostanze e dalla temperatura

pressione

CCffsaturazione

•In genere si scelgono le condizioni operative lontane dalla saturazione dove l’andamento è quasi rettilineo

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RipartizioneRipartizione Si abbia un sistema costituito da due fasi Si abbia un sistema costituito da due fasi L1L1 e e L2L2

(es.: (es.: gas/liquido gas/liquido come aria e acqua oppure due come aria e acqua oppure due liquidi non miscibililiquidi non miscibili comecome acquaacqua /olio/olio))

si aggiunga una terza sostanza si aggiunga una terza sostanza SS che sia solubile in che sia solubile in entrambi i liquidientrambi i liquidi

LL11

LL22

in questa rappresentazione i puntini indicano le molecole di sostanza SS ;

le freccette invece indicano il movimento di queste tra le due fasi sino al raggiungimento dell’equilibrio

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Ripartizione Equaz. di NernstRipartizione Equaz. di Nernst

La sostanza La sostanza SS si scioglie ripartendosi tra le si scioglie ripartendosi tra le due fasi due fasi LL11 e e LL22 secondo l’equazione di secondo l’equazione di Nernst Nernst CCLL11/C/CLL22 = K (costante) = K (costante)

CCLL11= Conc di S in L= Conc di S in L11 ; ; CCLL22 = Conc di S in L = Conc di S in L22

KK = dipende dalle sostanze presenti e dalla = dipende dalle sostanze presenti e dalla temperatura.temperatura.

CCLL22

CCLL11

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Nelle colonne Nelle colonne cromatografiche la cromatografiche la ripartizione si ripartizione si realizza realizza impregnando con impregnando con una sostanza oleosa i una sostanza oleosa i microgranuli che microgranuli che riempiono la colonnariempiono la colonna

RipartizioneRipartizione

sito di

adsorbim

ento

sito di ripartizione

molecole di gas

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Ripartizione /AdsorbimentoRipartizione /Adsorbimento Come si vede sia il diagramma Come si vede sia il diagramma

dell’adsorbimento a pag. 8 che quello della dell’adsorbimento a pag. 8 che quello della ripartizione a pag. 10 hanno lo stesso ripartizione a pag. 10 hanno lo stesso andamento.andamento.

Cmobile

Cf i

ssa Per descrivere la separazione si

preferisce quindi parlare di: concentrazione in fase fissa concentrazione in fase mobile

A

B

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Separazione tra due sostanze A e BSeparazione tra due sostanze A e BCome si vede la fase fissa trattiene la sostanza A con maggiore forza rispetto alla sostanza B

Infatti Cf A> Cf B

•Quindi il gas oppure il solvente della fase mobiletrascina la sostanza B mentre A resta indietro.

Cmobile

Cf i

ssa

A

B

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Scambio ionicoScambio ionico Alcune sostanze polimeriche hanno la Alcune sostanze polimeriche hanno la

proprietà di scambiare ioni Hproprietà di scambiare ioni H++ oppure ioni OH oppure ioni OH--

grazie alla presenza di particolari gruppi grazie alla presenza di particolari gruppi funzionalifunzionali

R--SO3H+ Na R--SO3 Na + H+

Una colonna cromatografica riempita con resina scambiatrice può separare sostanze ioniche

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Esclusione o permeazione di gelEsclusione o permeazione di gel Una sostanza polimerica dispersa in un solvente Una sostanza polimerica dispersa in un solvente

può cadere o meno entro le porosità di un gel a può cadere o meno entro le porosità di un gel a

seconda delle sue dimensioniseconda delle sue dimensioni..

polimero di piccole dimensioni percorso

Una molecola di piccole dimensioni ritarda nell’uscire dallacolonna perchè penetra nei pori e compie un percorso più lungo

GEL

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Esclusione o permeazione di gelEsclusione o permeazione di gel Invece una molecola polimerica di grandi Invece una molecola polimerica di grandi

dimensioni trova difficoltà a penetrare nel gel e dimensioni trova difficoltà a penetrare nel gel e viaggia più velocemente lungo la colonna.viaggia più velocemente lungo la colonna.

polimero di grandi dimensioni

GEL

percorso

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Le principali modalità di esecuzione di una cromatografia

Le principali modalità di esecuzione di una cromatografia

in fase liquida (LC)in fase liquida (LC) su cartasu carta su colonnasu colonna su strato sottile (TLC)su strato sottile (TLC)

in fase gassosa (GC)in fase gassosa (GC) su colonna a su colonna a

riempimentoriempimento su colonna capillaresu colonna capillare

•Un ulteriore metodo è la cromatografia in fase liquida ad alta pressione (HPLC )

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Cromatografia su carta (ascendente)Cromatografia su carta (ascendente) Come supporto di adsorbimento o Come supporto di adsorbimento o

scambio ionico si usa una scambio ionico si usa una specialespeciale carta da filtro .carta da filtro .

Una goccia del campione viene Una goccia del campione viene depositata alla base del foglio ed depositata alla base del foglio ed asciugata.asciugata.

Il foglio così preparato viene Il foglio così preparato viene chiuso in una camera di vetro con chiuso in una camera di vetro con un po’ di solvente sul fondo, in un po’ di solvente sul fondo, in modo che il solvente tocchi la base modo che il solvente tocchi la base de fogliode foglio

Il foglio viene imbevuto Il foglio viene imbevuto lentamente per capillarità.lentamente per capillarità.

Mentre il solvente sale i Mentre il solvente sale i componenti vengono separati .componenti vengono separati . standards

di confronto

standardsdi confrontocampionecampione

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Cromatograia su strato sottile(TLC)Cromatograia su strato sottile(TLC) E analoga a quella su carta E analoga a quella su carta

con la differenza che come con la differenza che come supporto si usa il materiale supporto si usa il materiale di riempimento delle di riempimento delle colonne.colonne.

La polvere usata per La polvere usata per riempire la colonna viene riempire la colonna viene depositata su una lastra di depositata su una lastra di vetro, in forma di impasto vetro, in forma di impasto

in strato sottilein strato sottile. . I componenti sono I componenti sono

separati ed identificati per separati ed identificati per confronto con sostanze confronto con sostanze notenote

standardsdi confronto

standardsdi confrontocampionecampione

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Caratteristiche più appariscentiCaratteristiche più appariscenti

Sia la cromat. su carta che la TLC consentono con Sia la cromat. su carta che la TLC consentono con attrezzature elementari di effettuare separazioni non attrezzature elementari di effettuare separazioni non distruttive su quantità inferiori al milionesimo di distruttive su quantità inferiori al milionesimo di grammo, in condizioni operative blande.grammo, in condizioni operative blande.

I componenti possono essere recuperati ritagliando la I componenti possono essere recuperati ritagliando la carta oppure raschiando la polvere della lastra.carta oppure raschiando la polvere della lastra.

Se il composto non è colorato si può rivelare o Se il composto non è colorato si può rivelare o mediante fluorescenza ai raggi UV oppure con mediante fluorescenza ai raggi UV oppure con reazioni chimiche che danno una reazione cromatica. reazioni chimiche che danno una reazione cromatica.

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Cromatografia preparativaCromatografia preparativa La cromatografia su colonna può essere effettuata sia su La cromatografia su colonna può essere effettuata sia su

scala analitica che su scala industriale.scala analitica che su scala industriale. In laboratorio si usano colonne con diametro 1-:-2 cm e In laboratorio si usano colonne con diametro 1-:-2 cm e

lungh. di 20-:-30 cmlungh. di 20-:-30 cm Su scala industriale si usano colonne con dimensioni 10 Su scala industriale si usano colonne con dimensioni 10

volte più grandi.volte più grandi. La cromatografia preparativa è importantissima nella La cromatografia preparativa è importantissima nella

separazione e purificazione di complesse sostanze naturali separazione e purificazione di complesse sostanze naturali termolabili e con caratteristiche similari come enzimi, o termolabili e con caratteristiche similari come enzimi, o proteine, ac. nucleici, immunopolisaccaridi,ormoni etc.proteine, ac. nucleici, immunopolisaccaridi,ormoni etc.

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Gas CromatografiaGas Cromatografia La condizione necessaria per la La condizione necessaria per la

separazione gas-cromatografica separazione gas-cromatografica è che le sostanze da analizzare è che le sostanze da analizzare siano facilmente vaporizzabilisiano facilmente vaporizzabili

1/1000 di cc di Campione viene 1/1000 di cc di Campione viene iniettato in un microevaporatore iniettato in un microevaporatore caldo , e quindi viene trascinato caldo , e quindi viene trascinato da una corrente dida una corrente di gas dettogas detto carrier.carrier.

La miscela gassosa passa quindi La miscela gassosa passa quindi in una colonna ove avviene la in una colonna ove avviene la separazione.separazione.

Un rivelatore posto all’uscita Un rivelatore posto all’uscita invia un segnale elettrico ad un invia un segnale elettrico ad un amplificatore e quindi ad un amplificatore e quindi ad un registratore grafico.registratore grafico.

colonna cromcolonna cromatografica

iniettoreiniettore

bombola carrierbombola carrier

detectordetector

uscita dei gas

registr.

amplif.

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Gas CromatografiaGas Cromatografia Anche la colonna deve essere riscaldata per evitare la condensazione Anche la colonna deve essere riscaldata per evitare la condensazione

del campionedel campione Come gas carrier si usanoCome gas carrier si usano IdrogenoIdrogeno,,oppureoppure AzotoAzoto,, oppureoppure ElioElio.. La separazione cromatografica somiglia alla distillazione frazionata.La separazione cromatografica somiglia alla distillazione frazionata. Quindi il potere separatore di una colonna cromatografica viene Quindi il potere separatore di una colonna cromatografica viene

contraddistinta dalcontraddistinta dal numero di piatti teorici numero di piatti teorici Una colonna impaccata ha Una colonna impaccata ha 5mm e lungh 3 -:- 5 m5mm e lungh 3 -:- 5 m Una colonna capillare ha Una colonna capillare ha mm e lungh 30-:- 100 mmm e lungh 30-:- 100 m

registratorecolonna cromatograficacolonna cromatografica

iniettoreiniettore

bombola carrierbombola carrier

detectordetector

uscita dei gas

amplificatorestufa termostatica

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Rivelatori per G.C.Rivelatori per G.C. HWDHWD : :hhot ot wwire ire ddetector , etector ,

in Inglese in Inglese rivelatore a filirivelatore a fili caldicaldi

HWD è basato sulla differenza HWD è basato sulla differenza di conducibilità termica delle di conducibilità termica delle sostanza rispetto al carrier.sostanza rispetto al carrier.

Una resistenza elettrica calda Una resistenza elettrica calda viene più o meno raffreddata al viene più o meno raffreddata al passaggio del gas. La resistenza passaggio del gas. La resistenza varia il proprio valore e genera varia il proprio valore e genera un segnale elettrico.un segnale elettrico.

Nell’HWD quattro resistenze Nell’HWD quattro resistenze sono collegate a formare un sono collegate a formare un ponte di Westone. Una delle ponte di Westone. Una delle resistenze è a contatto con il resistenze è a contatto con il carrier puro mentre un’altra è a carrier puro mentre un’altra è a contatto con il gas in uscita. contatto con il gas in uscita.

--

++

iniettore colonna cromat.

uscitagas

segn

ale

segn

ale

--

++

resistenza

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Rivelatori per GCRivelatori per GC FIDFID: : FFlame lame IIonization onization

DDetector ; in Inglese etector ; in Inglese rivelatorerivelatore a ionizzazione di fiamma.a ionizzazione di fiamma.

Il Il gas in uscitagas in uscita dalla colonna dalla colonna viene immesso in una viene immesso in una microfiamma Hmicrofiamma H2 2 /aria ove /aria ove

vengono bruciate le sostanze vengono bruciate le sostanze analizzate.analizzate.

Nella combustione si formano Nella combustione si formano frammenti molecolari dotati di frammenti molecolari dotati di cariche elettriche. Questi ioni cariche elettriche. Questi ioni posti in un campo elettrico posti in un campo elettrico danno luogo ad un segnale. danno luogo ad un segnale. aria

Idrogenocarrier

++

--

++

--

+

segn

ale

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Segnale del detector e cromatogramma


Quando una sostanza esce dalla Quando una sostanza esce dalla colonna incontra il detector.colonna incontra il detector.

Le molecola di una sostanza non Le molecola di una sostanza non escono tutte escono tutte contemporaneamente, ma si contemporaneamente, ma si comportano come una folla che comportano come una folla che percorre una strada.percorre una strada.

All’inizio ci sono poche All’inizio ci sono poche molecole, poi queste aumentano molecole, poi queste aumentano raggiungendo un massimo per raggiungendo un massimo per poi diminuire sino a sparire .poi diminuire sino a sparire .

il grafico ottenuto è detto il grafico ottenuto è detto piccopicco cromatograficocromatografico o o cromatogrammacromatogramma

tempose

gnal

e

Profilo del segnaleProfilo del segnale

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tempo

segn

ale

Profilo del segnale nel caso di un campione Profilo del segnale nel caso di un campione contenente 4 componenticontenente 4 componenti

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Analisi Qualitativa/Quantitativain Cromatografia


Analisi qualitativaAnalisi qualitativa Stabilite le condizioni Stabilite le condizioni

sperimentali, un composto è sperimentali, un composto è individuato dal individuato dal tempo che la tempo che la sostanza impiega a sostanza impiega a percorrere tutta la colonna percorrere tutta la colonna (tempo di ritenzione)(tempo di ritenzione)

Il tempo di ritenzione si Il tempo di ritenzione si misura tra il momento misura tra il momento dell’iniezione ed il punto di dell’iniezione ed il punto di massimo del picco massimo del picco cromatografico.cromatografico.

Analisi quantitativaAnalisi quantitativa La quantità di sostanza è La quantità di sostanza è

proporzionale alla superfice del picco.proporzionale alla superfice del picco. Il picco ha una forma curvilinea, ma Il picco ha una forma curvilinea, ma

per semplicità di calcolo si approssima per semplicità di calcolo si approssima ad un triangoload un triangolo

Oggi esistono apparecchiature Oggi esistono apparecchiature automatiche dette automatiche dette integratori integratori che che calcolano la superfice.calcolano la superfice.

Per risalire alla concentrazione di ogni Per risalire alla concentrazione di ogni componente si calcola la superfice componente si calcola la superfice %ale di ogni componente, moltiplicata %ale di ogni componente, moltiplicata per un opprtuno coefficiente. per un opprtuno coefficiente.

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Per l’ individuazione di una Per l’ individuazione di una sostanza è necessario sostanza è necessario effettuare un confronto con la effettuare un confronto con la stessa sostanza allo stato puro stessa sostanza allo stato puro

La sostanza di confronto è La sostanza di confronto è detta detta standard.standard.

Per l’ individuazione di una Per l’ individuazione di una sostanza è necessario sostanza è necessario effettuare un confronto con la effettuare un confronto con la stessa sostanza allo stato puro stessa sostanza allo stato puro

La sostanza di confronto è La sostanza di confronto è detta detta standard.standard.

Analisi quantitativaAnalisi quantitativa La risposta del detector è La risposta del detector è

diversa per ogni sostanza.diversa per ogni sostanza. La risposta del detector La risposta del detector

dipende dalle condizioni dipende dalle condizioni operative.operative.

Per conoscere la quantità di Per conoscere la quantità di un componente bisogna un componente bisogna effettuare il confronto con effettuare il confronto con una quantità nota di standarduna quantità nota di standard

Analisi quantitativaAnalisi quantitativa La risposta del detector è La risposta del detector è

diversa per ogni sostanza.diversa per ogni sostanza. La risposta del detector La risposta del detector

dipende dalle condizioni dipende dalle condizioni operative.operative.

Per conoscere la quantità di Per conoscere la quantità di un componente bisogna un componente bisogna effettuare il confronto con effettuare il confronto con una quantità nota di standarduna quantità nota di standard

Analisi qualitativaAnalisi qualitativa

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GC ISOTERMAGC ISOTERMA La gas cromatografia La gas cromatografia

deve essere condotta in deve essere condotta in condizioni di temperatura condizioni di temperatura controllata.controllata.

Se varia la temperatura Se varia la temperatura variano sia il coeff di variano sia il coeff di ripartizione che il coeff di ripartizione che il coeff di adsorbimento.adsorbimento.

Se variano i coefficienti Se variano i coefficienti varierà il tempo di varierà il tempo di ritenzione.ritenzione.

Gas Cromatografia e temperaturaGas Cromatografia e temperatura

GC a temperatura GC a temperatura ProgrammataProgrammata

Alcuni composti impieganoAlcuni composti impiegano tempi molto lunghi tempi molto lunghi per per attraversare la colonna con attraversare la colonna con conseguente conseguente diminuizione diminuizione del potere separatore..del potere separatore..

Per abbreviare il tempo di Per abbreviare il tempo di analisi, si aumenta analisi, si aumenta gradatamente la temperat. gradatamente la temperat. della colonnadella colonna

in questo caso si parla di in questo caso si parla di Temperatura programmataTemperatura programmata

T= cost

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Gas Cromatografia e temperaturaGas Cromatografia e temperatura

GC isoterma.GC isoterma. GC a temp. ProgrammataGC a temp. Programmata

tempotempo

Tem

pera

tura

Tem

pera

tura

T= cost

Tin

Tfin

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Gas Cromatografia a gradiente( temperatura programmata)

Gas Cromatografia a gradiente( temperatura programmata)

tempo

Tem

pera

tura

Tin

Tfin

1) fase iniziale di preriscaldamento

2) Rampa aumento di temperatura a gradiente costante T/t °C/min

3) fase finale di spurgo e pulizia della colonna.

4) raffreddamento e predisposizione per un nuovo ciclo( linea rossa )

ram

pa

inizio

fine raffreddamento

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HPLCHPLC HHigh igh PPressure ressure LLiquid iquid CChromatography hromatography

in Inglese : cromatografia liquida ad alta pressione.in Inglese : cromatografia liquida ad alta pressione. Per aumentare il potere separatore di una colonna si puòPer aumentare il potere separatore di una colonna si può

aumentare la lunghezza della colonnaaumentare la lunghezza della colonna aumentare la superfice di contatto rendendo la polvere di aumentare la superfice di contatto rendendo la polvere di

supporto più fina.supporto più fina. Quando si effettua la cromatografia Quando si effettua la cromatografia su colonna in fase liquida su colonna in fase liquida , il , il

liquido percola solo sotto l’azione della gravità. liquido percola solo sotto l’azione della gravità. Se la polvere e troppo fina la gravità è insufficiente e la colonna si Se la polvere e troppo fina la gravità è insufficiente e la colonna si

intasa.intasa. Si ricorre quindi a pressioni elevate che possono arrivare a 400 Si ricorre quindi a pressioni elevate che possono arrivare a 400

atmatm

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HPLCHPLC Una tipica colonna per HPLC ha diametro di 3-:-4 mm e Una tipica colonna per HPLC ha diametro di 3-:-4 mm e

lungh. 10-:-20 cmlungh. 10-:-20 cm Il potere separatore delle colonne per HPLC supera Il potere separatore delle colonne per HPLC supera

facilmente 20.000 piatti teorici, contro il migliaio delle facilmente 20.000 piatti teorici, contro il migliaio delle colonne per gas-cromatografia lunghe alcuni metri.colonne per gas-cromatografia lunghe alcuni metri.

colonna colonna cromcrom.

iniettoreiniettore detectordetector

uscita del liquido

registr.

amplif.

pompa a siringapompa a siringa

riserva di solvente carrier

valvole

filtro

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Rivelatori per HPLCRivelatori per HPLCSpettrofotometrico UVSpettrofotometrico UV Il liquido in uscita viene Il liquido in uscita viene

posto sul cammino ottico di posto sul cammino ottico di un raggio Ultra Violetto in un raggio Ultra Violetto in un microspettrofotometro.un microspettrofotometro.

Quando passa una sostanza Quando passa una sostanza diversa dall’eluente, varia diversa dall’eluente, varia l’intensità della luce l’intensità della luce assorbita, che viene assorbita, che viene misurata da una fotocellula.misurata da una fotocellula.

RI : indice di rifrazioneRI : indice di rifrazione L’indice di rifrazione è un L’indice di rifrazione è un

indicatore molto sensibile indicatore molto sensibile della composizione di una della composizione di una soluzione.soluzione.

Quando passa una sostanza Quando passa una sostanza diversa dall’eluente, varia diversa dall’eluente, varia l’indice di rifrazione.Un l’indice di rifrazione.Un raggio di luce viene deviato raggio di luce viene deviato più o meno verso una più o meno verso una fotocellula.fotocellula.

Rivelatore conduttometricoRivelatore conduttometrico: Se la sostanza da rivelare è di natura ionica , allora conduce la corrente elettrica e può essere rivelata da un conduttometro.

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HPLC : complessità della strumentazioneHPLC : complessità della strumentazione

Il solvente da usare deve essere di Il solvente da usare deve essere di grande purezza e totalmente privo grande purezza e totalmente privo di gasdi gas

Per degasare il solvente si fa Per degasare il solvente si fa gorgogliare Elio nel solventegorgogliare Elio nel solvente

La pompa è uno strumento di La pompa è uno strumento di grande precisione dovendo grande precisione dovendo garantire alte pressioni(20-:-200 garantire alte pressioni(20-:-200 atm) portata , programmabile atm) portata , programmabile costante con incrementi di 0,1 costante con incrementi di 0,1 ml/minml/min

La pompa è fatta di zaffiroLa pompa è fatta di zaffiro Alcuni strumenti hanno pompe a Alcuni strumenti hanno pompe a

doppio corpo o due pompe per doppio corpo o due pompe per poter usare due solventipoter usare due solventi

Il solvente da usare deve essere di Il solvente da usare deve essere di grande purezza e totalmente privo grande purezza e totalmente privo di gasdi gas

Per degasare il solvente si fa Per degasare il solvente si fa gorgogliare Elio nel solventegorgogliare Elio nel solvente

La pompa è uno strumento di La pompa è uno strumento di grande precisione dovendo grande precisione dovendo garantire alte pressioni(20-:-200 garantire alte pressioni(20-:-200 atm) portata , programmabile atm) portata , programmabile costante con incrementi di 0,1 costante con incrementi di 0,1 ml/minml/min

La pompa è fatta di zaffiroLa pompa è fatta di zaffiro Alcuni strumenti hanno pompe a Alcuni strumenti hanno pompe a

doppio corpo o due pompe per doppio corpo o due pompe per poter usare due solventipoter usare due solventi

L’iniettore è piuttosto complesso per evitare spruzzi di solventi ad alta pressione contro l’operatore al momento dell’introduzione del campione

Il rivelatore UV può rilevare l’assorbanza solo su una fissa oppure tutto lo spettro di ogni sostanza in una frazione di secondo

Il potere separatore altissimo produce diagrammi con picchi alti e stretti per la cui elaborazione è assolutamente necessario un integratore collegato ad un PC.

Gli strumenti per HPLC sono quindi molto costosi e così anche i materiali di consumo

L’iniettore è piuttosto complesso per evitare spruzzi di solventi ad alta pressione contro l’operatore al momento dell’introduzione del campione

Il rivelatore UV può rilevare l’assorbanza solo su una fissa oppure tutto lo spettro di ogni sostanza in una frazione di secondo

Il potere separatore altissimo produce diagrammi con picchi alti e stretti per la cui elaborazione è assolutamente necessario un integratore collegato ad un PC.

Gli strumenti per HPLC sono quindi molto costosi e così anche i materiali di consumo

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Analisi qualitativa e quantitativa in HPLC

Analisi qualitativa e quantitativa in HPLC

Tutte le considerazioni Tutte le considerazioni fatte prima per la fatte prima per la cromatografia in fase cromatografia in fase gassosa ( tempo di gassosa ( tempo di ritenzione, forma e ritenzione, forma e superfice del picco) sono superfice del picco) sono valide anche per l’HPLC.valide anche per l’HPLC.

Tutte le considerazioni Tutte le considerazioni fatte prima per la fatte prima per la cromatografia in fase cromatografia in fase gassosa ( tempo di gassosa ( tempo di ritenzione, forma e ritenzione, forma e superfice del picco) sono superfice del picco) sono valide anche per l’HPLC.valide anche per l’HPLC.

L’analsi si conduce a L’analsi si conduce a temperatura ambiente con un temperatura ambiente con un solvente degassato.solvente degassato.

La presenza di bolle di gas La presenza di bolle di gas anche microscopiche provoca anche microscopiche provoca dei falsi segnali.dei falsi segnali.

L’analsi si conduce a L’analsi si conduce a temperatura ambiente con un temperatura ambiente con un solvente degassato.solvente degassato.

La presenza di bolle di gas La presenza di bolle di gas anche microscopiche provoca anche microscopiche provoca dei falsi segnali.dei falsi segnali.

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HPLC e composizione del solvente.HPLC e composizione del solvente.

Eluizione isocraticaEluizione isocratica L’analisi viene condotta L’analisi viene condotta

mantenendo costante la mantenendo costante la composizione del solvente composizione del solvente carriercarrier

Isocratico = uguale Isocratico = uguale miscelamiscela

L’eluizione isocratica L’eluizione isocratica corrisponde in GC alla corrisponde in GC alla eluizione isotermaeluizione isoterma

Eluizione isocraticaEluizione isocratica L’analisi viene condotta L’analisi viene condotta

mantenendo costante la mantenendo costante la composizione del solvente composizione del solvente carriercarrier

Isocratico = uguale Isocratico = uguale miscelamiscela

L’eluizione isocratica L’eluizione isocratica corrisponde in GC alla corrisponde in GC alla eluizione isotermaeluizione isoterma

Eluizione a gradienteEluizione a gradiente L’analisi viene condotta

variando la composizione della miscela di solvente carrier man mano che procede l’eluizione,

L’eluizione a gradiente corrisponde in GC alla eluizione a gradiente di temperatura.

Eluizione a gradienteEluizione a gradiente L’analisi viene condotta

variando la composizione della miscela di solvente carrier man mano che procede l’eluizione,

L’eluizione a gradiente corrisponde in GC alla eluizione a gradiente di temperatura.

1 La Cromatografia Prof. S. Consoli Prof. A. Percolla.

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