1 CHIMICA ANALITICA Analisi Strumentale (II a parte) Prof. Elio Desimoni.
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1 CHIMICA ANALITICA CHIMICA ANALITICA Analisi Strumentale Analisi Strumentale (II (II a a parte) parte) Prof. Elio Prof. Elio Desimoni Desimoni Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Alimentari
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CHIMICA ANALITICACHIMICA ANALITICA
Analisi Strumentale (IIAnalisi Strumentale (IIa a parte)parte)
Prof. Elio DesimoniProf. Elio Desimoni
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INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICIINTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI – 26A: Descrizione – 26A: Descrizione generale della cromatografia; 26B: Velocità di migrazione dei soluti; generale della cromatografia; 26B: Velocità di migrazione dei soluti; 26C: efficienza delle colonne cromatografiche; 26D: risoluzione di una 26C: efficienza delle colonne cromatografiche; 26D: risoluzione di una colonna; 26E: colonna; 26E: Applicazioni della cromatografia.Applicazioni della cromatografia.
APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA – APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA – 27A: Cromatografia 27A: Cromatografia gas-liquido; 27B: Cromatografia liquida ad alta efficienza.gas-liquido; 27B: Cromatografia liquida ad alta efficienza.
SELEZIONE DEI METODI DI ANALISI SELEZIONE DEI METODI DI ANALISI – Leggere e memorizzare le – Leggere e memorizzare le possibili applicazioni.possibili applicazioni.
SPETTROSCOPIA ATOMICASPETTROSCOPIA ATOMICA – 24A: Origine degli spettri atomici;24B: – 24A: Origine degli spettri atomici;24B: Spettroscopia atomica basata sull’atomizzazione con fiamma; 24C: Spettroscopia atomica basata sull’atomizzazione con fiamma; 24C: Spettroscopia atomica con atomizzatori elettrotermici; 24D: Metodi di Spettroscopia atomica con atomizzatori elettrotermici; 24D: Metodi di emissione atomica basati su sorgenti a plasma.emissione atomica basati su sorgenti a plasma.
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Capitolo 24 SPETTROSCOPIA ATOMICACapitolo 24 SPETTROSCOPIA ATOMICA
Capitolo 26 INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICICapitolo 26 INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI
Capitolo 27 APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIACapitolo 27 APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA
Capitolo 29 SELEZIONE DEI METODI DI ANALISICapitolo 29 SELEZIONE DEI METODI DI ANALISI
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CAPITOLO 24 – SPETTROSCOPIA ATOMICACAPITOLO 24 – SPETTROSCOPIA ATOMICA
E0
E1
E2
UV-VIS
E
E0
E1
E2
v0
v1
v2
r0r1r2
UV-VIS
IR
E
In spettroscopia atomica l’analita è presente sotto forma di nube atomica. Essendo In spettroscopia atomica l’analita è presente sotto forma di nube atomica. Essendo impossibili vibrazioni e rotazioni, lo spettro atomico è a righe, non a bande (una impossibili vibrazioni e rotazioni, lo spettro atomico è a righe, non a bande (una banda è l’inviluppo di numerosissime righe).banda è l’inviluppo di numerosissime righe).
Livelli energetici possibili per Livelli energetici possibili per un atomo.un atomo.
Livelli energetici possibili per Livelli energetici possibili per una molecolauna molecola
p. 476
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Spettri atomici – a righe, e spettri molecolari - a bande
Spettro di assorbimento del permanganato nell’intervallo 450 – 650 nm.
Spettro di assorbimento di atomi di silicio nell’intervallo 250 – 253 nm.
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tari p. 477
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Atomizzazione in fiammaAtomizzazione in fiamma p. 479
soluzionenebulizzata
aerosolsoluzione-gas
aerosolfuso-gas
molecole
atomi
atomi eccitati
aerosolsolido-gas
combustibileossidante
soluzione
ossidantecondensa
nebulizzatore
atomi eccitati
ioni
molecoleeccitate
compostidifficilmentevaporizzabili
ossidi e idratidifficilmente
fusibilivapori disolvente
+T
fiamma
h
emissionebande
+T
+T
+e
emissioneatomica
composti difficilmentedisgregabili per reazionecon atomi della fiamma
soluzionenebulizzata
aerosolsoluzione-gas
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molecole
atomi
atomi eccitati
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combustibileossidante
soluzione
ossidantecondensa
nebulizzatore
atomi eccitati
ioni
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compostidifficilmentevaporizzabili
ossidi e idratidifficilmente
fusibilivapori disolvente
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composti difficilmentedisgregabili per reazionecon atomi della fiamma
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Bruciatori a flusso laminareBruciatori a flusso laminare p. 479
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p. 481
in cui n1 e n0 sono il numero di particelle negli stati E1 e E0, cost è una costante
dipendente dai livelli coinvolti nella transizione, k = 1,38.10-23 J/°K è la costante di Boltzmann e T la temperatura assoluta.
Il controllo della temperatura della fiamma è fondamentale al fine di ottimizzare la misurazione. A 2500°C, un aumento di 10°C aumenta del 3% il numero di atomi di Na aventi l’elettrone ottico nello stato 3p. Parallelamente, il numero di atomi di Na con l’elettrone nello stato fondamentale (3s) diminuisce dello 0,002%.
Il controllo della temperatura è più importante in assorbimento o in emissione?
Tk
EE
01
01
etcosnn
Si ricordi l’eq. di Boltzmann:
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Gli spettri di emissione in fiamma sono più ricchi di righe di quelli di assorbimento.
Si noti il contributo spettrale (a bande) del radicale MgOH.
p. 483
L’assorbimento da parte di specie atomiche, a righe, è detto specifico.
L’assorbimento da parte di specie molecolari o radicaliche, a bande, è un assorbimento aspecifico.
Quest’ultimo può essere eliminato mediante opportuni accorgimenti sperimentali (sottrazione del background).
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Spettroscopia di assorbimento atomico in fiammaSpettroscopia di assorbimento atomico in fiamma
Nella spettofotometria UV-VIS molecolare, il monocromatore permette di selezionare una stretta banda di lunghezze d’onda (per es. 0,1 – 2 nm) tra quelle emesse dalla sorgente. Questa banda passante può essere considerata monocromatica in quanto gli spettri di assorbimento molecolare sono costituiti da bande molto larghe.
1,0 nm
Che significa, in pratica, radiazione monocromatica?
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banda passante di unmonocromatore
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Confronto di spettri di assorbimento molecolari (blu) e atomici (rosso).
In AAS, la larghezza di una riga può essere dell’ordine di 10-3 nm. Non esiste monocromatore in grado di fornire una simile banda passante. Inoltre, sarebbe molto difficile isolare la lunghezza d’onda d’interesse!
p. 485
Al fine di produrre una radiazione sufficientemente monocromatica, è necessario modificare radicalmente la sorgente.
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tari La lampada a catodo cavoLa lampada a catodo cavo
Una lampada a catodo cavo (HCL, Hollow Cathode Lamp) moderna consiste in un tubo di vetro riempito di un gas inerte (Ne o Ar) ad una pressione di circa 5 mmHg, nel quale sono inseriti un anodo formato da un filamento, di solito di tungsteno o nichel, e un catodo a forma di cilindro cavo, contenente il metallo o, più in generale, l’elemento di cui si desidera ottenere l’emissione delle righe di risonanza.
Applicando agli elettrodi un campo elettrico di alcune centinaia di volt, i pochi ioni ed elettroni presenti nel gas inerte vengono accelerati e, data la bassa pressione, riescono a raggiungere un’energia cinetica sufficiente a ionizzare per urto altri atomi.
p. 486
Ar (pochi mmHg)+
Ar+CQW
B
II
A
A: anodo; B: corpo della lampada; C: catodo cavo; I: setti isolanti; QW: finestra di quarzo.
Si ha quindi la formazione di un vero e proprio plasma, in cui gli ioni positivi colpiscono la superficie del catodo provocando lo sputtering (emissione di atomi da una superficie bombardata da particelle) degli atomi di cui essa è costituita.
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La lampada a catodo cavoLa lampada a catodo cavo
Gli atomi emessi dal catodo, passando attraverso la regione della scarica, ricca di ioni e atomi eccitati del gas nobile, sono eccitati a loro volta ed emettono le loro tipiche righe spettrali.
Grazie alla costruzione della lampada e alla forma geometrica del catodo il fascio di radiazione emesso risulta relativamente ben collimato.
Ar (pochi mmHg)+
Ar+CQW
B
II
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A: anodo; B: corpo della lampada; C: catodo cavo; I: setti isolanti; QW: finestra di quarzo.
p. 486
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La lampada a catodo cavoLa lampada a catodo cavo
La larghezza naturale è determinata dalla vita media dei livelli coinvolti nella transizione (tanto più un livello è eccitato, tanto minore è la sua vita media, tanto maggiore è la sua larghezza naturale).
La larghezza Doppler è originata dalla variazione di frequenza connessa con la componete della velocità dell’atomo emettitore/assorbitore nella direzione di osservazione, ed è prevalentemente funzione della temperatura.
La larghezza Lorentz è determinata dalle interazioni reciproche tra gli atomi emettitori/assorbitori, ed è quindi funzione della pressione.
p. 484-485
La larghezza di una riga atomica (FWHM: Full Width at Half Maximum) è determinata da tre componenti:
FWHM = FWHMNat + FWHMLorentz + FWHMDoppler
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La lampada a catodo cavoLa lampada a catodo cavo
La HCL lavora a pressione e temperatura inferiori a quelle della fiamma.
Le righe emesse dalla HCL sono quindi caratterizzate da minori allargamenti Doppler e Lorentz e hanno un’ampiezza inferiore a quella tipica delle righe di assorbimento degli atomi eccitati nell’atomizzatore.
Di conseguenza queste sorgenti sono in grado di fornire FWHM adeguatamente ridotte alla lunghezza d’onda specifica dell’analita di interesse. Perché?
Riga di assorbimento
Riga di emissione
p. 485
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La lampada a scarica senza elettrodiLa lampada a scarica senza elettrodi p. 487
Fra le sorgenti utilizzate in FAAS e FAFS, le lampade a scarica senza elettrodi (EDL) mostrano le più elevate intensità radianti, e le righe di emissione più strette.
Una EDL consiste in un tubo di quarzo lungo parecchi centimetri e del diametro dell’ordine di 5-10 mm.
Il tubo è riempito con pochi milligrammi dell’elemento di interesse (come metallo puro, alogenuro o metallo con aggiunta di iodio) sotto una pressione di argon di alcuni Torr. Il tubo è circondato dalle spire di un generatore di radiofrequenza. Questa lampada richiede quindi uno speciale alimentatore.
Quando viene attivato il campo di radiofrequenza, l’energia ad esso associata causa l’evaporazione del metallo; l’urto con gli atomi del gas inerte provoca l’emissione delle righe spettrali caratteristiche. Queste lampade sono di più complessa costruzione rispetto alle lampade a catodo cavo e presentano una vita relativamente
più breve.
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Schemi a blocchi degli spettrometri di assorbimento atomicoSchemi a blocchi degli spettrometri di assorbimento atomico
Schemi a blocchi di spettrometri di assorbimento atomico: a) strumento a singolo raggio/alimentazione continua; b) strumento a singolo raggio/alimentazione modulata; c) strumento a doppio raggio.
La modulazione della sorgente permette al rivelatore di distinguere la radiazione proveniente dalla HCL da quella emessa dalla fiamma. La modulazione può essere elettronica (modulazione dell’intensità di corrente applicata agli elettrodi della HCl) o meccanica (mediante chopper).
p. 487
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InterferenzeInterferenze
Interferenze chimiche: dovute prevalentemente alla formazione di composti che influiscono sul rendimento dell’atomizzazione o a ionizzazione dell’analita.
Interferenze spettrali:
quelle dovute alla presenza di righe di assorbimento di atomi diversi dall’analita sono relativamente rare.
quelle dovute alla presenza di specie radicaliche o molecolari sono molto frequenti e producono generalmente un aumento del fondo (background).
p. 488Le interferenze più comuni in AS sono di due tipi:
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Correzione del fondo
La correzione del fondo può essere eseguita dotando lo spettrometro di una lampada addizionale a deuterio.
p. 489
Il chopper è un disco rotante con settori vuoti alternati a settori muniti di specchio.
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La fenditura del monocromatore isola la riga di risonanza dello spettro emesso dalla HCL, con una FWHM dell’ordine di 0,002 nm, mentre separa dallo spettro continuo della lampada a deuterio con una FWHM dell’ordine di 0,2-0,7 nm;
Correzione del fondo mediante lampada a deuterio
La HCL emette uno spettro a righe, quella a deuterio uno spettro continuo.
Le intensità delle due sorgenti vengono eguagliate entro l’intervallo spettrale considerato;
In presenza di assorbimenti specifici (dell’analita in esame) Icc viene ridotta
proporzionalmente alla concentrazione dell’analita mentre ID non viene ridotta che di
una frazione trascurabile;
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tari In presenza di un assorbimento aspecifico
(fondo) le due correnti sono ridotte in ugual misura;
I correttori a deuterio compensano fino a circa 0,6 unità di assorbanza del fondo. Nei casi in cui tale compensazione non è sufficiente si deve necessariamente ricorre a metodi di correzione più sofisticati.
In presenza di un assorbimento specifico e, contemporaneamente, aspecifico, l’intensità della radiazione emessa dalla lampada a deuterio, ridotta dal solo assorbimento aspecifico, fornisce il valore di I0 da usare
nell’equazione 2.12 mentre l’intensità della radiazione emessa dalla HCL, ridotta da entrambi gli assorbimenti, fornisce il valore di I. L’assorbimento viene misurato in assenza del fondo.
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Analisi quantitativa mediante FAAS
L’analisi quantitativa in FAAS si basa su misurazioni relative. È necessario costruire curve di taratura analizzando un adeguato numero di soluzioni standard.
Il metodo più sicuro è quello dell’aggiunta standard. Allo scopo, prima dell’analisi il campione è suddiviso in subcampioni. Uno di essi è trattato come al solito, mentre gli altri vengono processati dopo aggiunte crescenti di misurando. La determinazione analitica viene eseguita su tutti i subcampioni.
Alternativamente è possibile eseguire aggiunte successive di analita nello stesso campione in esame (correggendo eventualmente le concentrazioni così realizzate per l’eventuale diluizione associata ad ogni aggiunta).
In generale, lo scopo di questo modo è di compensare gli errori proporzionali che deriverebbero dall’uso di standard aventi composizione diversa da quella della matrice dei campioni in esame. Al fine di ottenere una buona stima della sensibilità, è necessario aggiungere analita in quantità sufficiente almeno a raddoppiare il segnale.
Il metodo è valido se usato nel range lineare, e se il bianco non ha un segnale apprezzabile, dato che è impossibile verificare sperimentalmente la correttezza di questa condizione.
Vedere equazioni a p. 491 e 492. p. 491
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Metodo dell’aggiunta standard
p. 491
0 C1 C2-Cx0
C1+Cx
C2+Cx
Cx
S
C
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SPETTROMETRIA ATOMICA CON ATOMIZZAZIONE ELETTROTERMICA (ETAAS)
In questo tipo di AS l’atomizzazione viene ottenuta mediante effetto Joule. Il campione viene introdotto in un tubicino di grafite per mezzo di una micropipetta o di un campionatore automatico. Per mezzo di un opportuno programma termico automatizzato (essiccamento, incenerimento, atomizzazione) si provoca l’atomizzazione dell’analita in presenza di minimi residui di matrice. Il segnale è transiente, non continuo come in FAAS.
p. 497
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SPETTROMETRIA ATOMICA DI EMISSIONE CON SORGENTI A PLASMA
Questo tipo di spettroscopia atomica di emissione sfrutta le elevate temperature (6000 – 10000 K) realizzabili con sorgenti a plasma. Gli strumenti più popolari usano un plasma ad accoppiamento induttivo.
p. 501
Flusso Ar: 11 – 17 L/min
Potenza: 2 kW a circa 27 MHz
Ignizione: piezoelettrica
Iniezione analita: come aerosol
Interferenze: scarse
Ionizzazione: ridotta a causa dell’elevata concentrazione di ioni Ar+
Range lineare: 3-5 ordini di grandezza
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Sorgenti ICP
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CAPITOLO 26 – INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI DI CAPITOLO 26 – INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI DI ANALISIANALISI
Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantificazione Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantificazione dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime applicazioni in campo alimentare.applicazioni in campo alimentare.
Nei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separanoNei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi:distribuendosi tra due fasi:
una una fase stazionariafase stazionaria (un solido o un liquido su supporto solido inerte) (un solido o un liquido su supporto solido inerte)
una una fase mobilefase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella stazionaria.stazionaria.
p. 516
La separazione è dovuta principalmente alle relative affinità per la fase La separazione è dovuta principalmente alle relative affinità per la fase stazionaria.stazionaria.
Nella Nella cromatografia liquidacromatografia liquida (LC) la fase mobile è un liquido, nella (LC) la fase mobile è un liquido, nella gas gas cromatografiacromatografia (GC) la fase mobile è un gas. (GC) la fase mobile è un gas.
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CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICIp. 517
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PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIAPRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA
Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa. La Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa. La fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all’interno di un tubo fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all’interno di un tubo lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m):distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m):
XXmm X Xss
A: il campione viene iniettato all’entrata della colonnaB D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria
A B C D
Flu
sso
de
l sol
vent
e
p. 518
m
sX [X]
[X]K
Il Il coefficiente di ripartizione coefficiente di ripartizione (o (o didi distribuzione distribuzione) del componente X è definito come:) del componente X è definito come:
Quale componente ha K maggiore?
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Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita
dall’inizio all’uscita della colonna. Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che
passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna.
Analogamente si definiscono i corrispondenti:Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario ad eluire l’analita
dall’inizio all’uscita della colonna.Volume morto (VM): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto
(corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).
ttRR
ttMM
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Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di migrazione dell’analita lungo la colonna è il migrazione dell’analita lungo la colonna è il fattore di capacitàfattore di capacità,, k’ k’. .
Si dimostra che kSi dimostra che k ’’ può essere ricavato dai parametri del cromatogramma: può essere ricavato dai parametri del cromatogramma:
Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di kDue sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k ’’..
M
SAA V
VK
mobilefasenellaAdimoliditotalen
astazionarifasenellaAdimoliditotalen'k
M
MRA t
tt'k
p. 522
La La selettivitàselettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda la quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di capacità di un sistema cromatografico di distingueredistinguere fra due componenti ed è fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con stazionaria, con (ttRR))BB> (t> (tRR))AA..
MAR
MBR
A
B
t)t(
t)t(
'k
'k
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I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono:I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono:
1.1. diffusione longitudinalediffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela all’asse della colonna);concentrazione a quella a minore in direzione parallela all’asse della colonna);
2.2. percorsi multiplipercorsi multipli;;
p. 524
Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità: la Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo loro dispersione ha generalmente un profilo GaussianoGaussiano. Il centro del profilo (banda di . Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media.eluizione) rappresenta la velocità media.
3.3. trasferimento di massa trasferimento di massa tra fase tra fase mobile e fase stazionaria.mobile e fase stazionaria.
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L’L’altezza equivalente al piatto teoricoaltezza equivalente al piatto teorico (H = L/N) consente di confrontare l’efficienza di (H = L/N) consente di confrontare l’efficienza di colonne di differente lunghezza. colonne di differente lunghezza.
1)1) Altezza equivalente di piatto teorico HAltezza equivalente di piatto teorico H2)2) Numero di piatti teorici N Numero di piatti teorici N
L = lunghezza colonnaL = lunghezza colonna H
LN
Si può dimostrare che
W = larghezza del picco
2R
W
t16N
W p. 525 -527
Piatto teoricoPiatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio : sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, singola separazione, NN ha un significato puramente matematico. ha un significato puramente matematico.
Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna.lunghezza della colonna.
Parametri che descrivono quantitativamente l’Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienza efficienza di una colonna (ampiezza dei picchi):di una colonna (ampiezza dei picchi):
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Variabili che influenzano l’Variabili che influenzano l’efficienza efficienza di una colonna: di una colonna: p. 529
La principale variabile che influenza l’efficienza di una colonna è laLa principale variabile che influenza l’efficienza di una colonna è la velocità di flusso velocità di flusso lineare (cm/s) della fase mobilelineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il tempo di contatto tra fase . Questa infatti influenza il tempo di contatto tra fase mobile e fase stazionaria.mobile e fase stazionaria.
L’altezza equivalente del piatto teorico, H, il L’altezza equivalente del piatto teorico, H, il parametro che descrive l’efficienza della parametro che descrive l’efficienza della colonna, dipende proprio dalla velocità di colonna, dipende proprio dalla velocità di flusso della fase mobile (vedere Figura a flusso della fase mobile (vedere Figura a lato).lato).
Sia in LC che in GC la velocità di flusso Sia in LC che in GC la velocità di flusso ottimale è piuttosto bassa.ottimale è piuttosto bassa.
Quella ottimale della LC è inferiore a quella Quella ottimale della LC è inferiore a quella ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi troppo elevati, in LC si usano velocità un po’ troppo elevati, in LC si usano velocità un po’ maggiori di quella ottimale.maggiori di quella ottimale.
La LC è caratterizzata da valori di H inferiori La LC è caratterizzata da valori di H inferiori alla GC.alla GC.
In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50 m; LC: < 50 cm), la GC è In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50 m; LC: < 50 cm), la GC è comunque caratterizzata da valori più elevati di N, e quindi da migliore efficienza.comunque caratterizzata da valori più elevati di N, e quindi da migliore efficienza.
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Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del comportamento dei soluti (selettività) comportamento dei soluti (selettività) vedere equazione successiva. vedere equazione successiva.
La La risoluzionerisoluzione, R, è una misura quantitativa della capacità di separare due analiti. , R, è una misura quantitativa della capacità di separare due analiti. Essa è ricavabile dal cromatogramma:Essa è ricavabile dal cromatogramma:
p. 530
Vedere Figura 26-10
La risoluzione caratterizza la bontà di separazione fra due picchi sia con riferimento La risoluzione caratterizza la bontà di separazione fra due picchi sia con riferimento alla differenza fra i tempi di ritenzione (numeratore) sia riguardo all’efficienza di alla differenza fra i tempi di ritenzione (numeratore) sia riguardo all’efficienza di separazione (denominatore). separazione (denominatore).
BABA
ARBR
WW
Z2
WW
)t()t(2R
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1k
k1N
4
1R
IB
IB
Si può dimostrare che:Si può dimostrare che:
Effetto della selettività, dell’efficienza e del fattore di capacità sulla risoluzioneEffetto della selettività, dell’efficienza e del fattore di capacità sulla risoluzione
risoluzione scarsarisoluzione scarsa
buona risoluzione dovuta a buona buona risoluzione dovuta a buona efficienzaefficienza
risoluzione scarsa dovuta ad un basso risoluzione scarsa dovuta ad un basso fattore di capacitàfattore di capacità
buona risoluzione dovuta a buona buona risoluzione dovuta a buona selettivitàselettività
picchi non separatipicchi non separati
picchi strettipicchi stretti
picchi distantipicchi distanti
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Le applicazioni della cromatografia vanno dall’analisi Le applicazioni della cromatografia vanno dall’analisi qualitativaqualitativa a quella a quella quantitativa quantitativa di miscele anche molto complesse. di miscele anche molto complesse.
L’analisi quantitativa sfrutta la misurazione dell’altezza o dell’area dei picchi. L’analisi quantitativa sfrutta la misurazione dell’altezza o dell’area dei picchi. La misurazione dell’area è più affidabile in quanto non risente dell’eventuale La misurazione dell’area è più affidabile in quanto non risente dell’eventuale allargamento dei picchi in seguito a variazione delle condizioni di lavoro.allargamento dei picchi in seguito a variazione delle condizioni di lavoro.
I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una curva di I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una curva di calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la concentrazione dell’analita calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la concentrazione dell’analita nella miscela in esame mediante interpolazione.nella miscela in esame mediante interpolazione.
Il metodo dello standard interno è il più affidabile: una quantità nota di Il metodo dello standard interno è il più affidabile: una quantità nota di standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nel campione in esame; standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nel campione in esame; il parametro analitico è quindi costituito dal rapporto tra le aree dello il parametro analitico è quindi costituito dal rapporto tra le aree dello standard e dell’analita (il metodo funziona solo se il picco dello standard è standard e dell’analita (il metodo funziona solo se il picco dello standard è vicino ma separato da quello dell’analita).vicino ma separato da quello dell’analita).
p. 533
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Anion-exchange chromatogram with electrochemical detection of a mixed standard solution containing 0.125 mM of: 1) glycerol, 2) meso-erythritol, 3) adonitol, 4) histamine, 5) glucose. Flow Rate 0.4 mL/min. Isocratic elution with 0.4 M NaOH.
I.G. Casella, M. Gatta, E. Desimoni, Determination of histamine by high-pH anion-exchange cromatography with electrochemical detection, Food Chem., 73 (2001) 367)
I.G. Casella, M. Gatta, E. Desimoni, Determination of histamine by high-pH anion-exchange cromatography with electrochemical detection, Food Chem., 73 (2001) 367)
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CAPITOLO 27 – APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIACAPITOLO 27 – APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA
GASCROMATOGRAFIAGASCROMATOGRAFIA
La fase mobile è un gas. Le sostanze da separare (liquidi, solidi, gas) La fase mobile è un gas. Le sostanze da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle gassose o comunque portarle allo stato di vapore. gassose o comunque portarle allo stato di vapore.
Cromatografia di adsorbimento gas-solidoCromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria = solido (fase stazionaria = solido adsorbente)adsorbente)
Cromatografia di ripartizione gas-liquidoCromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = liquido (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna)della colonna)
A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il gas il gas di trasporto serve solo per trascinare i componenti lungo la di trasporto serve solo per trascinare i componenti lungo la colonna.colonna.
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He, Ar, N2, H2
SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO
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Iniezione ed iniettoriIniezione ed iniettoriIl campione viene iniettato in quantità molto piccole (fino a 0,5 ml per impaccate, fino a 100 volte inf. per capillari). L’entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere l’evaporazione istantanea del campione e abbastanza grande da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro.
Colonne gascromatograficheColonne gascromatografiche
Si suddividono in impaccate e capillari.Si suddividono in impaccate e capillari.
Le Le impaccateimpaccate contengono particelle solide che contengono particelle solide che
vengono impaccate: diatomee o diatomee vengono impaccate: diatomee o diatomee
silanizzate, per ridurre la polarità mediante silanizzate, per ridurre la polarità mediante
arricchimento superficiale di gruppi metilici.arricchimento superficiale di gruppi metilici.
Le Le capillaricapillari sono tubi molto più sottili e lunghi sono tubi molto più sottili e lunghi
(diametro = 0.3-0.5 mm; lunghezza = 50-300 m) in (diametro = 0.3-0.5 mm; lunghezza = 50-300 m) in
cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti
interne. Queste ultime hanno un elevato numero di interne. Queste ultime hanno un elevato numero di
piatti teorici (anche 300.000) grazie alla loro piatti teorici (anche 300.000) grazie alla loro
elevata lunghezza.elevata lunghezza.
p. 539
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Colonna capillare standard a fase legataColonna capillare standard a fase legata
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p. 540 -541
Influenza della T sui tR:
più la temperatura è elevata più il
soluto tende a trasferirsi nella fase
gassosa aumentando T diminuisce tR
45°
145°
programma di T
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RivelatoriRivelatori
Dovrebbero avere le seguenti proprietà: risposta lineare, stabilità, risposta Dovrebbero avere le seguenti proprietà: risposta lineare, stabilità, risposta uniforme per i diversi analiti (o comunque prevedibile e più o meno selettiva).uniforme per i diversi analiti (o comunque prevedibile e più o meno selettiva). Il Il rivelatore ideale non esiste.rivelatore ideale non esiste.
4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce in una corrente di 4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce in una corrente di riferimento, l’altra coppia è circondata da gas di trasporto che proviene dalla riferimento, l’altra coppia è circondata da gas di trasporto che proviene dalla colonna. Quando il ponte è in equilibrio tra i punti colonna. Quando il ponte è in equilibrio tra i punti 11 e e 22 non appare alcun non appare alcun segnale. Una variazione della conducibilità termica del gas (dovuta all’eluizione segnale. Una variazione della conducibilità termica del gas (dovuta all’eluizione di analiti con il gas) produce un segnale tra di analiti con il gas) produce un segnale tra 11 e e 22 . .
p. 540
controllo della correntedel filamento
cella diriferimento
cella delcampione
registratore
attenuatorea ponte
Rivelatore a conducibilità termica:Rivelatore a conducibilità termica: si basa sul principio del ponte di Wheatstone. si basa sul principio del ponte di Wheatstone.
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Il rivelatore a ionizzazione di fiamma è forse il più diffuso. Si basa sul fatto che molti composti organici, quando bruciano, in una fiamma, producono intermedi ionici che possono aumentare la conducibilità della fiamma stessa.
È più sensibile di quello a conducibilità termica (fino a 10-13 g/mL).
+ -
p. 542
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La fase liquida per CGL deve essere caratterizzata da
Bassa volatilità
Stabilità termica
Inerzia chimica
Caratteristiche solventi (valori ottimali di k’ e
p. 543
FASI LIQUIDE PER CROMATOGRAFIA GL
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HPLC = CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA EFFICIENZA
Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori.
A BC
A.A. crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d > crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d > 150 150 m, D = 20-50 mm, L = 50-200 cm)m, D = 20-50 mm, L = 50-200 cm)
B.B. HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 m, D = 1-3 mm, L = 50-100 m, D = 1-3 mm, L = 50-100 cm)cm)
C.C. HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 m, D = 2-6 mm, L = m, D = 2-6 mm, L = 10-50 cm)10-50 cm)
d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonnad = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna
p. 546
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tari LCLC classica: classica:
dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto maggiori dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto maggiori
che nella HPLC; che nella HPLC;
velocità di flusso molto basse;velocità di flusso molto basse;
tempi di analisi lunghi. tempi di analisi lunghi.
Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e
risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei lunghi risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei lunghi
canali interparticellari.canali interparticellari.
HPLC: HPLC:
impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili; impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili;
contropressioni maggiori;contropressioni maggiori;
tempi d’ analisi contenuti. tempi d’ analisi contenuti.
Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l’uso di pompe ad Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l’uso di pompe ad
alta pressione. Efficienza aumentata di 10-100 e tempi di separazione diminuiti alta pressione. Efficienza aumentata di 10-100 e tempi di separazione diminuiti
(miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della
fase mobile).fase mobile).
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SCHEMA DI CROMATOGRAFO HPLC p. 547
SERBATOIOSOLVENTE
POMPA
FILTRO
MISURATOREPRESSIONE
SPURGO
INIETTORE
PRECOLONNA
COMPARTIMENTOTERMOSTATATO
COLONNA
RIVELATORE
COLLETTOREDI FRAZIONI
REGISTRATORE
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ELEMENTI DI CROMATOGRAFO HPLC
Riserva di fase mobile (degasamento, eluizione isocratica o a gradiente)
Sistema di pompaggio (pressioni fino a 6000 psi 400 atm)
Sistema di iniezionep. 548
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ColonneColonne (precolonne (precolonne**, colonne analitiche, le più diverse), colonne analitiche, le più diverse)
Rivelatori Rivelatori (Il rivelatore può essere (Il rivelatore può essere selettivoselettivo verso una classe di analiti (es: verso una classe di analiti (es: solo i composti che assorbono nell’UV, solo quelli fluorescenti, ecc) o solo i composti che assorbono nell’UV, solo quelli fluorescenti, ecc) o universaleuniversale (rivela (rivela tuttitutti i componenti). In cromatografia liquida i rivelatori più i componenti). In cromatografia liquida i rivelatori più usati sono:usati sono:
rivelatore UV-visrivelatore UV-vis
rivelatore a fluorescenzarivelatore a fluorescenza
rivelatore a indice di rifrazione (RI)rivelatore a indice di rifrazione (RI)
3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System™HPLC Columns
* Per rimuovere particolato, saturare la fase mobile con la stazionaria
* Per rimuovere particolato, saturare la fase mobile con la stazionaria
p. 548
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p. 550 HPLC DI RIPARTIZIONE
Fase stazionaria e mobile immiscibili l’una con l’altra: liquidi con proprietà solventi
notevolmente diverse.
Limitata a composti con valori di k' relativamente bassi perché la fase stazionaria
deve essere un buon solvente per il campione, ma un cattivo solvente per la fase
mobile: aumentando la forza del solvente per poter eluire composti con valori elevati
di k' si aumenterà anche la solubilità della fase stazionaria;
utile per risolvere differenze molto piccole nella solubilità degli analiti: l’impiego della
coppia fase stazionaria/fase mobile appropriata permette un’alta selettività.
I primi lavori con cromatografia di ripartizione usavano fasi stazionarie altamente polari
(glicol, acqua,ecc.) e fase mobile non polare (esano, isopropiletere, ecc) ovvero
operavano in fase normale. Attualmente, la fase stazionaria più usata è apolare (un
idrocarburo) e quella mobile è un solvente relativamente polare (metanolo, acqua,
acetonitrile, ecc.): questo tipo di cromatografia viene detto a fase inversa.
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BPLC (Cromatografia a fasi chimicamente legate )
per i riempimenti della LC sono stati utilizzati tre tipi generali di legami chimici
nei quali i gruppi Si-OH possono essere :
1. esterificati per reazione con alcoli producendo esteri di silicati
2. silanizzati per reazione con organocloro- o organoalcossi-silani
3. trasformati per clorurazione in Si-Cl e, in seguito, in Si-C per reazioni di
Grignard o Wurtz, o qualche altra reazione tipica dei composti alogenati.
gli impaccamenti sono più stabili nel tempo.
Si-OH + HOR Si-O-R + H2O
Si-OH + SOCl2 Si-Cl + SO2 + HCl
Si-Cl + R-Mg-Br Si-R + MgClBr
Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HClR'
R'
R'
R'
1
2
3
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HPLC DI ADSORBIMENTO
Fase stazionaria: materiali adsorbenti come solidi porosi (silice, allumina) con
area superficiale specifica da 50-1000 m2/g preparati in particelle di dimensioni
appropriate. I gel di silice, per esempio, sono preparati facendo reagire silicato
di Na con un acido minerale (es. HCl) e poi mediante polimerizzazione con
formazione di un sistema tridimensionale di tetraedri di SiO4. A seguito della
disidratazione si forma un solido stabile poroso con terminazioni superficiali
silanoliche e silossaniche.
Le interazioni tra superficie adsorbente e soluto variano da non specifiche (forze di dispersione o di Van der Waals) a specifiche (interazioni elettrostatiche o interazioni tra accettori o donatori di elettroni -legami idrogeno).
gruppi silossanicigruppi
ossidriliciisolati
legami idrogeno
p. 552
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La ritenzione su silice o allumina dipende principalmente dalle interazioni con i La ritenzione su silice o allumina dipende principalmente dalle interazioni con i gruppi funzionali degli analiti: classi diverse di composti possono essere separate le gruppi funzionali degli analiti: classi diverse di composti possono essere separate le une dalle altre, ad es. alcoli (polari) e idrocarburi alifatici (non polari). Le posizioni une dalle altre, ad es. alcoli (polari) e idrocarburi alifatici (non polari). Le posizioni relative dei gruppi funzionali nella molecola di analita e il numero e disposizione relative dei gruppi funzionali nella molecola di analita e il numero e disposizione spaziale dei siti di adsorbimento sulla superficie rendono la LSC una tecnica di spaziale dei siti di adsorbimento sulla superficie rendono la LSC una tecnica di grande utilità per la separazione di composti polifunzionali, in particolare isomeri grande utilità per la separazione di composti polifunzionali, in particolare isomeri geometrici.geometrici.
para
meta
orto
Separazione LSC degli isomeri della Separazione LSC degli isomeri della nitroanilina su alluminanitroanilina su allumina
Il primo ad essere eluito è l’isomero Il primo ad essere eluito è l’isomero orto, che presenta legami ad H orto, che presenta legami ad H intramolecolari (minore tendenza intramolecolari (minore tendenza all’interazione con la superficie all’interazione con la superficie dell’allumina), mentre l’isomero dell’allumina), mentre l’isomero para è trattenuto più fortemente para è trattenuto più fortemente perché presenta più facilmente perché presenta più facilmente interazioni con l’allumina.interazioni con l’allumina.
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Influenza della fase mobile: le interazioni implicano una competizione tra le
molecole dell’analita e quelle della fase mobile per i siti di adsorbimento.
I solventi possono essere distinti a seconda della loro forza di adsorbimento (serie
eluotropica).
idrocarburi alif.idrocarburi alif.olefine olefine idrocarburi arom. idrocarburi arom. alogenuri alogenuri solfurisolfurieterieterinitrocompostinitrocompostiesteri, aldeidi e esteri, aldeidi e chetonichetoniammineamminesolfonisolfonisolfossidisolfossidiammidiammidiac. carbossiliciac. carbossiliciacquaacqua
ppoollaarriittàà
Nelle note a margine
p. 543
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Fase mobile deboleFase mobile debole : i componenti che sono ritenuti debolmente sono trattenuti e : i componenti che sono ritenuti debolmente sono trattenuti e separati ma quelli ritenuti fortemente saranno eluiti in tempi troppo lunghi (e separati ma quelli ritenuti fortemente saranno eluiti in tempi troppo lunghi (e probabilmente con picchi troppo allargati). probabilmente con picchi troppo allargati).
Fase mobile forteFase mobile forte: saranno eluiti troppo rapidamente i componenti poco ritenuti, : saranno eluiti troppo rapidamente i componenti poco ritenuti, e saranno separati correttamente quelli trattenuti fortemente. e saranno separati correttamente quelli trattenuti fortemente.
Come separare tutti i componenti con K’ molto diversi? Come separare tutti i componenti con K’ molto diversi? è necessario far variare è necessario far variare la velocità di migrazione delle bande durante il corso dell’analisi: la velocità di migrazione delle bande durante il corso dell’analisi: eluizione a eluizione a gradientegradiente..
L’eluizione viene iniziata, ad esempio, con un solvente debole e la forza del L’eluizione viene iniziata, ad esempio, con un solvente debole e la forza del solvente viene progressivamente aumentata. L’effetto complessivo è quello di una solvente viene progressivamente aumentata. L’effetto complessivo è quello di una eluizione progressiva delle sostanze più fortemente ritenute e al tempo stesso, eluizione progressiva delle sostanze più fortemente ritenute e al tempo stesso, di una riduzione nella formazione di code.di una riduzione nella formazione di code.
In GC il gradiente è un gradiente di temperatura. Perché?In GC il gradiente è un gradiente di temperatura. Perché?
ELUIZIONE A GRADIENTEELUIZIONE A GRADIENTE
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SOLVENTESOLVENTEDEBOLEDEBOLE
SOLVENTESOLVENTEFORTEFORTE
FORZAFORZAINTERMEDIAINTERMEDIA
GRADIENTEGRADIENTEDI SOLVENTEDI SOLVENTE
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Fasi stazionarie: polimeri funzionalizzati con gruppi carichi (solfonici e carbossilici come scambiatori di cationi; -NHR2
+ , -NR3
+, come
scambiatori di anioni).Fase mobile: contiene generalmente un controione di carica opposta al gruppo ionico sulla superficie, in equilibrio con essa per formazione di una coppia ionica.
Fasi stazionarie: polimeri funzionalizzati con gruppi carichi (solfonici e carbossilici come scambiatori di cationi; -NHR2
+ , -NR3
+, come
scambiatori di anioni).Fase mobile: contiene generalmente un controione di carica opposta al gruppo ionico sulla superficie, in equilibrio con essa per formazione di una coppia ionica.
p. 554
scambio cationico X+ + R-Y+ Y+ + R-X+
scambio anionico X- + R+Y- Y- + R+X-
dove: X = ione del campioneY = ione della fase mobile (controione)R = sito ionico sullo scambiatore
Lo scambio dipende dal pH, temperatura, forza ionica, natura e concentrazione, dello ione competitore, ecc.
HPLC A SCAMBIO IONICO
Per composti ionici, ionizzabili (acidi e basi organiche), e che possono interagire con gruppi ionici.
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I.G. Casella, M. Contursi, E. Desimoni, Amperometric detection of sulphur-containing compounds in alcaline medium, Analyst, 127 (2002) 647-652
I.G. Casella, M. Contursi, E. Desimoni, Amperometric detection of sulphur-containing compounds in alcaline medium, Analyst, 127 (2002) 647-652
Liquid chromatogram of unspiked white wine (Grifo Bianco, diluted 1:200). Column: IonPac AS12A analytical column (200 x 4 mm I.D.) plus IonPac AG12A (50 x 4 mm I.D.) guard column (Dionex, Sunnyvale, CA). Applied potential: 0.55 V vs. Ag/AgCl. Carrier electrolyte: 0.1 M NaOH. Flow rate: 1.0 mL/min. Sample Loop: 20 mL.
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tari HPLC AD ESCLUSIONE
È utile nel caso di miscele di analiti ad alto peso molecolare (polipeptidi, proteine, enzimi, carboidrati, ecc.).
HPLC AD ESCLUSIONE
È utile nel caso di miscele di analiti ad alto peso molecolare (polipeptidi, proteine, enzimi, carboidrati, ecc.).
p. 557
Fasi stazionarie: particelle di polimeri e silice a porosità uniforme e controllata. Il tempo di residenza degli analiti nella fase stazionaria dipende dalle loro dimensioni. Se sono abbastanza piccole rimangono intrappolate nei percorsi multipli all’interno delle particelle. Se sono troppo elevate non penetrano nella fase stazionaria e vengono eluite velocemente. Le tecniche che usano impaccamenti idrofili ed idrofobi sono note rispettivamente come gel-filtrazione e, rispettivamente, gel-permeazione.Si usano rispettivamente per specie polari e specie non polari.Fase mobile: la fase mobile ha la stessa polarità dell’impaccamento (acquosa per impaccamenti idrofili e apolare per quelli idrofobi).
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Cromatogramma HPLC a gradiente in fase inversa di una miscela di proteine idrofobe depositate su lenti di contatto. Fase stazionaria: polistirene. Fase mobile: A (sol. Acq. Ac. formico 20%) + B (2-propanolo/acetonitrile 2/1) - gradiente: 5-70% B in 50 min. Rivelatore: UV (Hasan, Azeem; Hanson, Stacy; Smith, David; Smith, JeanResearch supported by a grant from the NIH, EY RO1 07609 and The Nebraska Center for Mass Spectrometry)
1: B2 – 23,3 kD; 2: D – 20,6 kD; 3: D – 20,2 kD; 4: A – 20,0 kD
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CAPITOLO 29 – SELEZIONE DEI METODI D’ANALISICAPITOLO 29 – SELEZIONE DEI METODI D’ANALISI
In prima approssimazione, un problema analitico può essere condensato nell’insieme delle seguenti informazioni:
Analita
Matrice
Analisi qualitativa, quantitativa o di speciazione
Livello di concentrazione
Risoluzione (laterale, in profondità)
Incertezza di misura (esattezza, precisione)
Numero di campioni
Tempi
Costo
Per aiutarsi nella selezione di una tecnica analitica potenzialmente idonea alla risoluzione del problema analitico, è utile esaminare le diverse classificazioni delle tecniche di analisi strumentale.
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tari Tabella 1 - Tecniche di analisi strumentale in funzione della
profondità di campionamento
Profondità campionata
Tecniche di analisi di massa (bulk) > 100 nm
Tecniche di analisi di strato sottile (thin layer) 10-100 nm
Tecniche di analisi di superficie < 10 nm
Tabella 2 - Tecniche di analisi strumentale in funzione del principio fisico utilizzato
Tecniche spettroscopiche di analisi
Tecniche cromatografiche di analisi
Tecniche elettrochimiche di analisi
Tecniche mediante analisi termica
Tecniche radiochimiche di analisi
Tecniche ifenate
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Tabella 3 - Principali tecniche di analisi strumentale spettroscopica
Spettroscopia UV-visibile UV-VIS Spettroscopia infrarossa IR Spettroscopia IR a trasformata di Fourier FTIRS Spettroscopia Raman Spettroscopia di fluorescenza molecolare FS Spettroscopia di assorbimento atomico in fiamma FAAS Spettroscopia di assorbimento atomico elettrotermico EAAS o ETAAS Spettroscopia di assorbimento atomico a vapori freddi CVAAS Spettroscopia di emissione atomica AES Spettroscopia di emissione a plasma ICP Spettroscopia di fluorescenza atomica AFS Spettroscopia di assorbimento a raggi X XAS Spettroscopia di emissione a raggi X XES Spettroscopia di fluorescenza a raggi X XFS Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare NMR Spettroscopia di risonanza magnetica elettronica ESR Spettroscopia fotoacustica PAS Spettroscopia di massa MS
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Tabella 4 - Tecniche basate sulla spettrometria di massa
Spettrometria di massa MS
Spettrometria di massa di ioni secondari SIMS
Spett. di massa mediante bombardamento con atomi veloci FABS
Spettrometria di massa a tempo di volo TOF-SIMS
Tabella 5 - Principali tecniche di analisi cromatografica
Cromatografia gas-liquido GLC
Cromatografia gas-solido GSC
Cromatografia gas-fase legata BPGLC
Cromatografia liquido-liquido LLC
Cromatografia liquido-solido LSC
Cromatografia liquido-fase legata BPLLC
Cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC
Cromatografia su strato sottile TLC
Cromatografia a scambio ionico IEC
Cromatografia a esclusione molecolare SEC/GPC
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tari Tabella 6 - Principali tipi di rivelatori per analisi strumentale
cromatografica
Rivelatore a termoconducibilità
Rivelatore a cattura di elettroni
Rivelatore ad elio metastabile
Rivelatore ad emissione termoionica
Rivelatore a fotoionizzazione
Rivelatore a conducibilità elettrolitica
Rivelatore a spettrometro di massa
Rivelatore FTIR
Rivelatore UV
Rivelatore a indice di rifrazione
Rivelatore a fluorescenza
Rivelatore elettrochimico
Rivelatore a ionizzazione di fiamma
Rivelatore a spettrometro a plasma
Rivelatore a spettrometro di massa
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Tabella 7 - Principali tecniche di analisi strumentale elettrochimica
Tecnica Variabile Rispostacontrollata misurata
Potenziometria i (= 0) E
Voltammetria e polarografia
Polarografia a impulsi normali (NPP) E i vs. E
Polarografia a impulsi differenziali (DPP) “ “
Voltammetria di ridissoluzione anodica (ASV) “ “
Voltam. di ridiss. anodica diff. pul. (DPASV) “ “
Voltam. di adsorbimento e ridiss. (AdSV) “ “
Voltammetria ciclica (CV) “ “
Voltammetria ad onda quadra (SWV) “ “
Elettrogravimetria i o E massa
Coulometria i o E carica
Analisi mediante iniezione in flusso (FIA) E i vs. t
Tecniche conduttometriche E (AC) i (AC)
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Tabella 8a - Acronimi delle principali tecniche d’analisi strumentale
AAS Atomic Absorption SpectroscopyAES Atomic Emission SpectroscopyAFM Atomic Force MicroscopyAFS Atomic Fluorescence SpectroscopyASV Anodic Stripping VoltammetryBPGLC Bonded Phase Gas-Liquid ChromatographyBPLLC Bonded Phase Liquid-Liquid ChromatographyCV Cyclic VoltammetryCVAAS Cold Vapour Atomic Absorption SpectroscopyDPASV Differential Pulse Anodic Stripping VoltammetryDPP Differential Pulse PolarographyEC Exclusion ChromatographyEPR Electron Paramagnetic ResonanceESR Electron Spin ResonanceEAAS/ETAAS Electrothermal Atomic Absorption SpectroscopyFAAS Flame Atomic Absorption SpectroscopyFIA Flow Injection AnalysisFTIRS Fourier Transform IR SpectroscopyGC Gas Chromatography
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Tabella 8b - Acronimi delle principali tecniche d’analisi strumentale GLC Gas-Liquid ChromatographyGPC Gel Permeation ChromatographyGSC Gas-Solid ChromatographyHPLC High Performance Liquid ChromatographyICP Inductively Coupled PlasmaIR Infra-Red SpectroscopyLC Liquid ChromatographyLC-MS Liquid Chromatography-Mass SpectrometryLC-UV Liquid Chromatography-UV SpectroscopyLLC Liquid-Liquid ChromatographyLSC Liquid-Solid ChromatographyMS Mass SpectrometryNMR Nuclear Magnetic ResonanceNPP Normal Pulse PolarographyPAS Photoacustic SpectroscopySEC Size Exclusion ChromatographySTM Scanning Tunneling MicroscopyTLC Thin-layer ChromatographyTOF-SIMS Time-of-Flight Mass SpectrometryUV-VIS Ultraviolet and Visible (Spectroscopy)
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tari CONSIDERAZIONI GENERALI
Evidentemente è molto improbabile che si possa trovare in letteratura un metodo caratterizzato da precisione, limite di rivelabilità, specificità, semplicità, ecc. quali quelli da noi desiderati.
Di volta in volta bisogna limitare l’area di ricerca.
Se l’analita è un metallo (per es. Pb, Cd, Cr, ecc.), e quindi non sono richieste informazioni sulla sua speciazione, l’ideale è ricorrere alla spettroscopia atomica. La tecnica sarà scelta prevalentemente in funzione della concentrazione di analita (Vedere Tabella 24-4).
Se l’analita è una singola specie elementare (per es. Cr(VI), As(III), Se(IV) ecc.), e quindi si tratta di eseguire un’analisi di speciazione, sarà invece necessario dimenticarsi della spettroscopia atomica e ricorrere a metodi specifici (per es. ad un metodo CSV per il Cr(VI).
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tari Se l’analita è una miscela complessa di carboidrati, converrà pensare
subito a qualche metodo HPLC. In questo caso sarà meglio disporre del rivelatore più adatto alla concentrazione dei vari analiti. Nel caso più comune potrà bastare un rivelatore a indice di rifrazione (ldr: 0,1 -1 %). Ma questo rivelatore non ammette l’eluizione a gradiente.
Se gli analiti sono presenti a livelli più bassi di concentrazione, sarà necessario ricorrere a derivatizzazioni post-colonna ed a rivelatori UV.
Alternativamente, è possibile convertire gli zuccheri in composti volatili, mediante opportune reazioni, ed analizzare il risultato mediante cromatografia gas-liquido.
In numerosi casi si potrà ricorrere a metodi specifici, quali quello spettrofotometrico VIS per il Cr(VI) nelle acque (US EPA Method 7196A - range: 50 - 0.5 mg/L ) o quello, sempre nel visibile, per determinare la qualità dello zafferano (BS6145:1981 – ISO 3632-1980).
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Se l’analisi riguarda la quantificazione di cationi, o anioni, in un acqua di scarico, potrebbe convenire ricorrere alla cromatografia ionica.
