1 Capitolo 4. Anticorpi ed antigeni

Gli anticorpi sono proteine circolanti prodotte nei vertebrati in risposta all’esposizione a struttureestranee. Queste molecole possono esistere in due forme:

• legate alla membrana dei linfociti B con funzione di recettori

• secrete in circolo dove agiscono neutralizzando tossine e prevenendo l’ingresso di agenti patogeni

Assieme al complesso maggiore di istocompatibilità e ai recettori per l’antigene dei linfociti T, costituis-cono le tre classi di molecole coinvolte nel riconoscimento dell’antigene. Le funzioni effettrici anticorpomediate mirano all’eliminazione dell’antigene mediante processi diversi tra i quali l’opsonizzazione, lacitotossicità diretta, l’attivazione del complemento e l’ipersensibilità immediata che attiva i mastociti.

1.1 Produzione e distribuzione degli anticorpi

Le uniche cellule in grado di produrre gli anticorpi sono i linfociti B in seguito ad esposizione conl’antigene. Le prime fasi avvengono principalmente negli organi linfoidi, soprattutto milza e tessutilinfoidi associati a mucose, anche se plasmacellule di lunga durata si ritrovano nel midollo osseo. Unavolta attivati i linfociti B diventano plasmacellule in grado di secernere anticorpi e tali cellule riesconoa persistere per lungo tempo. Un uomo adulto produce ogni giorno circa 2-3 g di anticorpi che tuttaviahanno una emivita molto breve, pari a circa tre settimane. Almeno i due terzi di questi anticorpi fannoparte della classe delle IgA. Gli anticorpi una volta prodotti spesso si attaccano a cellule effettrici delsistema immunitario quali cellule NK, fagociti mononucleati e mastociti.

1.2 Struttura molecolare

Prima di passare alla struttura vera e propria è opportuno fare una parentesi sugli anticorpi mono-clonali: questi sono stati essenziali per comprendere la struttura di tutti gli anticorpi. Visto che ognilinfocita B produce anticorpi con un’unica specificità, e purtroppo questi hanno emivita molto breve,per studiare la struttura degli anticorpi sono stati creati linfociti B immortali detti “ibridomi”. Questecellule sono state ottenute mediante fusione di linfociti B con cellule di mieloma multiplo, tumoremonoclonale delle plasmacellule. Gli anticorpi prodotti da tali cellule sono detti “anticorpi monoclon-ali”. Per osservare la struttura di un anticorpo di uno specifico antigene, si immunizza un ratto contale antigene e se ne isolano i linfociti B prodotti, utilizzati poi per la creazione dell ibridoma. Ogni ib-ridoma darà poi origine a progenie di ibridomi specifici per tali antigene. Per confermarne la specificitàsi effettuano saggi immunologici con l’antigene in questione. Questa scoperta degli ibridomi è statautilizzata in molte applicazioni e tra le più comuni ricordiamo:

• classificazione dei linfociti in base al fenotipo espresso mediante legame con anticorpi specifici.

• immunodiagnosi di molte malattie sistemiche mediante riconoscimento in circolo di determinatiantigeni

• diagnosi di tumori

• terapia ad esempio di artriti reumatoide o tumore alla mammella

• evidenziare presenza di citochine mediante valutazione se l’anticorpo stimola o inibisce una de-terminata cellula.

Essendo gli anticorpi monoclonali proteine estranee al nostro organismo, questi creavano un certogrado di resistenza. Sono stati creati i cosiddetti anticorpi umanizzati mediante inserimento geneticodel segmento che codifica per i siti di legami specifici dell antigene all’interno del segmento di DNAche codifica l’impalcatura dell’anticorpo. L’anticorpo ha cosi sembianze “umane” ma sito di legamespecifico.

Le immunoglobuline appartengono alla famiglia delle gammaglobuline (gamma per la velocitaelettroforetica e globuline per la solubilità). Tutti gli anticorpi condividono la stessa struttura di basee differiscono solo nel sito di legame antigenico in cui vi è elevatissima variabilità. Una molecolaanticorpale ha una struttura simmetrica composta da due catene leggere e due pesanti. Queste

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catene sono costituite dai cosiddetti domini Ig costituiti da una serie di circa 110 amminoacidi dispostia “sandwich”. Ogni dominio è costituito da due β foglietti costituiti da 5 nastri polipeptidici uniti da αeliche e ponti di solfuro. Molte proteine nel nostro organismo che mediano processi di riconoscimentosfruttano i domini Ig e tali proteine vengono classificate come appartenenti alla superfamiglia delleimmunoglobuline.

Sia le catene pesanti che quelle leggere posseggono una regione variabile V amino terminale e unaregione costante C carbossiterminale. Nelle catene pesanti la regione V è composta da un dominio Ige la regione C da tre domini Ig. Nelle catene leggere sia la V che la C da un dominio Ig. Le estremitaC delle catene pesanti sono legate covalentemente tra di loro nella regione CH2 tra due cisteine vicinoalla regione “hinge” o cerniera. Queste regioni C sono quelle che tengono ancorate le Ig ai linfociti Be sono le responsabili della maggior parte delle interazioni con le cellule effettrici. Le interazioni con lecellule effettrici (es linfociti citotossici) sono ristrette a queste regioni che non hanno niente a che farecon il riconoscimento dell’antigene, evento legato alle regioni V. Le regioni C delle catene leggere sonolegate alle regioni C delle catene pesanti ma non interagiscono né all’ancoraggio né alle interazioni conaltre cellule.

Se si tratta un Ig con la papaina questa viene tagliata a livello della cerniera e si formano trepezzi separati: due pezzi identici detti Fab sono costituiti ciascuno da una catena leggera legata a unacatena pesante; tali segmenti hanno mantenuto la capacità di legare l’antigene. Il terzo pezzo detto Fc ècostuito da due segmenti identici di catena pesante Ch2 e Ch3 legati da ponti di solfuro; tale segmentonon ha capacita di legare antigeni.

Regioni variabili V Ogni anticorpo ha due catene leggere e due pesanti che vanno a delimitare duesiti di legame per due antigeni. La maggior parte delle differenze tra due anticorpi risiede in tre piccolisegmenti delle due regioni variabili: questi tre segmenti detti regioni ipervariabili sono situati nelleanse che connettono i β foglietti adiacenti nel dominio Ig e hanno una lunghezza di circa 10 amminoaci-di. Le tre regioni ipervariabili dette CDR1, CDR2, CDR3, della catena pesante si associano a quelledella catena leggera per formare quella struttura tridimensionale che costituisce il sito di legame perl’antigene. Le sequenza adiacenti a tali regioni sono altamente conservate e mantengono la forma deidomini Ig pressochè identica nei diversi anticorpi.

Regioni costanti C Gli anticorpi sono divisi in classi e sottoclassi in base alle differenze nella strut-tura presenti nelle regioni costanti delle catene pesanti. Le diverse classi anticorporali, dette isotipi,sono IgA, IgE, IgM, IgG e IgD. IgA e IgG sono ulteriormente divise in IgA 1 e 2 e IgG 1, 2, 3 e 4.

Le catene pesanti di uno stessi isotipo hanno la medesima sequenza amminoacidica e tali catenevengono nominate con la lettere greca corrispondente al loro isotipo (α, ε, γ, µ, δ). Isotipi diversisvolgono funzioni diverse, infatti abbiamo visto essere le regioni C delle catene pesanti a determinareil tipo di interazione e quindi di risposta delle cellule effettrici. Gli anticorpi sono capaci nonostantela loro forma a Y di legare antigeni situati a 180 gradi tra loro grazie alla loro flessibilità dovuta a duefattori:

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• capacità dei domini Vh (v delle catene pesanti) di ruotare attorno al corrispondente dominio Ch

• flessibilità della regione cerniera tra Ch1 e Ch2

Esistono due tipi di catene leggere, una κ e una λ. Ciascun anticorpo è omogeneo per le due catene,ovvero non contiene mai una catena κ e una λ ma sempre due catene dello stesso tipo. Nell’uomo il60% delle Ig è formato da catene κ. In pazienti con tumori delle cellule B ovviamente questo rapportovaria e dunque si usa questo dato per valutare la presenza di eventuali neoplasie. Abbiamo detto che lecatene pesanti sono costituite da tre domini Ig, e che gli anticorpi esistono in forma secreta o in formadi membrana; la sequenza amminoacidica C terminale dell’ultimo dominio Ig delle catene pesanti èquella che determina se un anticorpo sarà di secrezione o di membrana. La porzione carbossiterminaleè idrofila, negli anticorpi di membrana in aggiunta vi è una regione transmembrana idrofobica seguitada una regione intracellulare carica positvamente che la ancora alla membrana. Le IgG e IgE secretesono semplici monomeri ovvero due catene leggere e due pesanti. Le IgD non esistono in formasecreta, mentre le IgA sono spesso dimeri (4e4)e IgM sono o pentameri o esameri dotate di unpeptide addizionale detto catena j deputato a stabilizzare il complesso.

1.2.1 Interazione con l’antigene

Un antigene è una qualsiasi molecola che possa legarsi a un anticorpo o a un linfocita T. Gli anticorpipossono legarsi praticamente a qualsiasi tipo di molecola mentre i linfociti principalmente a peptidi,tuttavia solo determinati antigeni riescono ad attivare i linfociti e questi sono definiti immunogeni. Adesempio perchè si attivi un linfocita B serve che sia una macromolecola, composti di piccole dimensionipossono si legarvisi ma non attivarlo; è neccessario che questi piccoli antigeni definiti apteni sianoaccompagnati da una macromolecola definita carrier. Il complesso aptene-carrier è molto piu grandedella regione di legame dell’anticorpo di conseguenza l’anticorpo si lega solo a una regione definitadeterminante o epitopo. Se un antigene presenta piu determinanti identici contemporaneamente èdetto polivalente. Se i determinanti sono ben separati più anticorpi identici potranno legarsi allo stessoantigene senza influenzarsi, se gli epitopi sono molto vicini ecco che compare un grado di interferenza. Ideterminanti costituiti dalla semplice sequenza amminoacidica sono detto determinanti lineari, quelliinvece costituiti da una struttura tridimensionale sono detti determinanti conformazionali e sonodovuti alla disposizione spaziale e non lineare degli amminoacidi. Modificazioni quali glicosilazione eccpossono, alterando la struttura proteica, creare nuovi epitopi detti determinanti neo-antigenici.

Il riconoscimento dell’antigene da parte dell’aticorpo è costituito da legami non covalenti re-versibili quali forze di van der Waals e interazioni idrofobiche. La forza di tale legame tra Ig e ilsuo antigene è detta affinità ed è espressa da una costante di dissociazione Kd: minore è la K emaggiore è la affinità. Un siero umano contiene una miscela di anticorpi per lo stesso antigene conaffinità differenti. Antigeni polivalenti posseggono piu siti di legame e la forza di legame sarà differenteda quella di un singolo legame: tale forza complessiva è detta avidità. In questo modo un Ig con bassaaffinità può comunque avere una grande avidità. Un antigene polivalente si associa con gli anticor-pi e, a una determinata concentrazione detta zona di equivalenza, vanno a formare una rete dettaimmunocomplesso. Aumentando le concentrazioni di antigene o anticorpo tali immunocomplessi sirompono in complessi più piccoli a causa della competitività.

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1.2.2 Riconoscimento dell’antigene

Gli anticorpi riconoscono una ampia varietà di antigeni e la loro efficienza è possibile grazie alleproprietà delle loro regioni V:

• Specificità: Gli anticorpi sono estremamente specifici essendo in grado di distinguere minimedifferenze nella struttura chimica degli Ag, addirittura la variazione di un singolo residuo am-minoacidico. Tuttavia alcuni possono legarsi anche a un Ag normalmente non correlati a causadella cosiddetta cross-reattività, tale fenomeno può essere la cause dell’insorgenza di malattieimmunitarie.

• Diversificazione: Un individuo è in grado di generare un numero enorme di anticorpi differenti el’insieme complessivo dei diversi isotipi è detto repertorio anticorpale.

• Maturazione dell’affinità: In seguito a stimolazione dall’antigene i linfociti B sono in grado diprodurre anticorpi con maggiore affinità di quelli che erano già in circolo per lo stesso antigene.

Abbiamo detto che è la porzione Fc a determinare la funzione effettrice. Tuttavia si è visto che isistemi effettori sono attivati dalla porzione Fc solo se l’anticorpo è contemporaneamente legato nellaporzione Fab, inoltre per attivare i recettori Fc (FcR) delle cellule effettrici servono almeno due molecoleanticorporali legate a “ponte”per ciascuna cellula. Nelle cellule B sono normalmente espressi le IgMe IgD, queste una volta legato l’antigene possono andare incontro a una modificazione della Fc dettaswitching isotopico che fa variare la regione C ma non la V, quindi varia l’effetto ma non il ligando.

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