Metodo del PASREAZIONE ACIDO PERIODICO-reattivo di SCHIFF (PAS)

PRINCIPI SU CUI SI BASA LA REAZIONE

•Questa reazione fu introdotta in istochimica da Mc Manus•successivamente elaborata da altri Autori (Lillie, Hotchiss, Gomori) •ha un valore fondamentale per l’istochimica dei carboidrati•Si basa sull’utilizzo di Acido Periodico e del Reattivo di Schiff

Azione dell’acido periodico

• l’acido periodico (HIO4), viene usato come ossidante

• attacca selettivamente i gruppi: •1,2 glicolico •vic-glicolico •OH ossidrilico

glicogeno

glucosio

Azione dell’acido periodico� In conseguenza della ossidazione con acido periodico si

verifica:◦ rottura di un legame fra due atomi di carbonio adiacenti◦ formazione di almeno un gruppo aldeidico a livello degli

atomi di carbonio che rimangono alle estremità della catena rotta

REATTIVO DI SCHIFF• La presenza dei gruppi aldeidici che si sono formati viene

rivelata dal reattivo di Schiff• Il reattivo proposto da Schiff nel 1866 è utilizzato per rivelare

gruppi aldeidici ed è di largo impiego in istochimica• trova applicazione:

• nello studio dei polisaccaridi (reazione PAS)• nello studio degli acidi nucleici (reazione di Feulgen)• nello studio di alcuni lipidi e di alcune proteine

• Il reattivo di Schiff è un derivato della fucsina basica• E’ un colorante (ottenuto dalla fucsina), il cui principale

costituente è rappresentato dalla pararosanilina(triaminotrifenilmetano)

� Nelle preparazioni commerciali di fucsina basica sono contenute anche piccole quantità di altre sostanze, (impurezze del colorante) che possono condizionare la possibilità di ottenere un buon reattivo di Schiff

� Alcune industrie producono reattivo di Schiff già pronto per l’uso

PREPARAZIONE DEL REATTIVO DI SCHIFF� Per preparare il reattivo di Schiff si utilizza una soluzione di

fucsina basica 0,5% in acqua; si aggiungono quindi l’l% di tiosolfato di potassio e 5 ml di acido cloridrico 1N

� Queste ultime due sostanze reagiscono tra loro formando acido solforoso, che in acqua è in equilibrio con l’anidride solforosa

� L’anidride solforosa si lega alla fucsina e causa la decolorazione della fucsina a leucofucsina ( reattivo di Schiff)

leucofucsina

pararosanilina

� Per completare la preparazione, si aggiunge alla soluzione del carbone finemente tritato e si filtra, in modo da assorbire e allontanare tutte le impurità e presenti nella fucsina basica

� Si ottiene un liquido limpido, incolore o paglierino, con odore pungente (per la presenza di anidride solforosa in eccesso)

� Se il reattivo presenta una sfumatura rosa non va usato perché ciò indica la presenza di fucsina basica, che colorerebbe i substrati basofili, togliendo specificità alla reazione.

Azione del reattivo di Schiff� Il reattivo di Schiff reagisce specificamente con i gruppi

aldeidici, formando legami covalenti con il carbonio portatore del gruppo aldeidico e riacquistando colore (rosso Magenta)

� Rende identificabili le sedi dei gruppi aldeidici medesimi� La reazione è altamente specifica, tanto da essere usata

anche nei dosaggi chimici di molecole in soluzione

Perché la reazione risulti evidente è necessario che:

•i gruppi da ossidare siano liberi•il substrato suscettibile di reagire con l’acido periodico sia conservato durante le manipolazioni che precedono la reazione•i composti che si formano in seguito alla ossidazione non siano diffusibili•i gruppi aldeidici di questi composti siano in quantità sufficiente per essere rivelati istochimicamente

la elettività della reazione può essere testata mediante controlli

COME SI ESEGUE LA PAS REAZIONE

1. Fissazione in Formalina, Carnoy, Zenker, Susa, Bouin ecc.2. Disidratazione in etanolo, inclusione in paraffina3. sparaffinatura in xilolo o composti analoghi 4. idratazione attraverso la serie degli alcoli discendenti fino all’acqua .5. Ossidazione per 5-10 min in una sol. di ac. periodico 0,2 -1%.6. Lavaggio in acqua corrente per 5-10 min7. Passaggio delle sezioni nel reattivo di Schiff per 30-40 min8. Lavaggio in acqua di fonte per 5-10 min9. Colorazione dei nuclei con emallume di Mayer (ematossilina)10. Disidratazione e montaggio in resina sintetica

Le sostanze reattive appaiono colorate in varie gradazioni di rosso- violetto (magenta).