- Origine autonoma di replicazione (ORI) - Geni per la selezione: resistenza ad uno o due...

- Origine autonoma di replicazione (ORI)

- Geni per la selezione: resistenza ad uno o due antibiotici

- Altri geni per la selezione del plasmide ricombinante

- Siti multiplo di clonaggio

CARATTERISTICHE VETTORE PLASMIDICO DI CLONAGGIO

T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007

oppure elettroporazione


Piastramentosu terreno con antibiotico


Selezione per la presenza del vettore: resistenza ad

antibiotico

Batteriofago lambda 25 20-25 Infezione

VETTORI DI CLONAGGIO PER E. coli

Tipo Dimensioni (kb)

Dimensioni inserto (kb)

Sistemaselezione

Metodointroduzione

Plasmidi

pBR322 4,3 6 2 Antibiotici Trasformazione

pUC 2,1 8 Amp + Lac Z Trasformazione

Fago filamentoso M13 6,4 3 Lac Z Trasfezione

Cosmidi 5-6 35-50 Antibiotico Infezione

Cromosomi artificiali 7 fino a 300 Amp (CM) + Lac Z ElettroporazioneBAC

Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Plasmide pBR322


pBR322: screening dellecolonie ricombinanti


Vettori plasmidici (pUC18)


Il gene LacZ codifica per il polipeptide

β-galattosidasi (1021 a.a.)


•Ceppo di E.coli: gene Lac Z mutante: peptide parziale

•Vettore pUC: gene LacZ mutante: peptide parziale

Complementanoβ-galattosidasi

ATTIVA

•Ceppo di E.coli Lac Z mutante

•Vettore LacZ interrotto dal clonaggio

Non c’è complementazion

e

β-galattosidasiINATTIVA

Terreno + X-Gal

β-galattosidasi

ATTIVA

β-galattosidasi

INATTIVA

Metabolizzato

Non metabolizzato

Colonie Blu

Colonie bianche

X-Gal: 5-Bromo-4-Cloroindolil-β-galattoside (incolore)

(induttore)

Metodi di inserimento dei vettori ricombinanti nelle cellule batteriche

Trasformazione: plasmidi (DNA) trasformano cellule procariotiche rese competenti

Infezione: fagi (DNA con capsidi) che lisano il batterio

Trasduzione: cosmidi (DNA con capsidi) che nel batterio si comportano come plasmidi

Trasfezione: come una trasformazione ma con DNA fagico senza capsidiper es: per introdurre la forma replicativa di M13 a doppio filamento

BATTERIOFAGO LAMBDA COME VETTORE DI CLONAGGIO

Lambda w.t. = 50 KbEstremità “cos” di 12 nt per circolarizzazione

Infezione di E. coli

Batteriofago lambda


Batteriofago lambda

Lambda w.t. = 50 Kb

Lambda di sostituzione: eliminati geni ciclo lisogenico, inserti fino a 23 Kb

Clonaggio di frammenti DNA esogeno e packaging in vitro

Infezione


Formazione di catenani

Creati siti unici per clonaggio


Fago difettivo (siti cos alterati)non può replicarsi ma produce proteine per i capsidi che possonoessere purificate

Fagi difettivi che da soli non producono capsidi.Le singole proteine possono essere purificate


CLONAGGIO IN BATTERIOFAGI


Screening placche di lisiInfezione fagica


Fago filamentoso

La cellula batterica non viene lisata!

Fago filamentoso


Clonaggio in cosmidi

Formazione di catenani

Formazione di colonie


CROMOSOMI ARTIFICIALI DI BATTERIO (BAC)

Fattore di fertilità F di E. coli ha 3 geni (parA, parB, repE) per la replicazione e per mantenere basso il numero di copie del fattore (1- 2 per cellula)

Gene per la resistenza al cloramfenicolo (per selezione trasformanti)

Siti di clonaggio nel gene LacZ (identificazione ricombinanti per complementazione)

Inserto tra 150 e 350 Kb

Integrazione batterica per elettroporazione

Promotori per la trascrizione (T7 e SP6)

VETTORI DI CLONAGGIO IN LIEVITO:YAC (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOME)

Saccharomyces cerevisiae: 16 cromosomi da 250 kb a 2 Mb


Inserto: 300 kb – 1 MbSferoplasting: liticasi

SUP 4

CEN = CentromeroARS = sequenze autonome di replicazioneTRP1 e URA3 per selezione di molecole con entrambi i bracciURA 3 = gene per un enzima della sintesi dei nucleotidi pirimidiniciTRP1 = gene per un enzima della sintesi del triptofano

SUP 4 = gene per il tRNA per la tirosina che sopprime la mutazione non senso “ochre” nel gene ADE2 del ceppo di lievitoADE2 = gene per la sintesi di adenina: un precursore (fosforibosil amminoimidazolo) che sta a monte nella via biosintetica si accumula e dà colonie rosse

S. cerevisiae (w.t): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione “ochre”.Nel codone UAU (tyr) nel gene ADE2 si verifica la mutazione “ochre” UAA “non senso” e diventa ADE2(-): l’adenina non viene sintetizzata e si accumula come premetabolita rosso

S. cerevisiae (w.t): crescono se nel in terreno c’è uracile e triptofano S. cerevisiae (w.t): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione “ochre” accumulo di premetabolita dell’adenina colonie rosse

YAC con gene SUP 4 = gene per il tRNA con UAA Tyr*SUP 4 integro sopprime la mutazione non senso “ochre” nel gene ADE2 del ceppo di lievito: viene sintetizzata adenina, non c’è accumulo di premetabolita rosso colonie bianche

S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC senza inserto (SUP attivo) colonie bianche colonie biancheS. cerevisiae (terreno minimo) + YAC con inserto (SUP inattivo)

colonie rosse

VANTAGGI E SVANTAGGI DEL CLONAGGIO IN YAC:

- Chimerismo (co-saldatura di più regioni nello stesso YAC)- Instabilità (soprattutto a livello di regioni ripetute)- Co-trasformazione (più di uno YAC per cellula di lievito)

Distribuzione dei cloni in griglieProduzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare in screeningAllineamento dei cloni in contigui

ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

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