STRUTTURADNADNA <=> RNA -> PROTEINA <=> RNA -> PROTEINA 〈〈

FUNZIONEFUNZIONE

Modificazione selettiva o casuale di una proteina allo scopo di modificare la struttura o la funzione

INGEGNERIA PROTEICAINGEGNERIA PROTEICA

Ingegneria proteica

PROGETTARE

PRODURRECARATTERIZZARE

MODULARE ATTIVITA’ OINTRODURRE NUOVE FUNZIONI

PROTEINE NATURALIPROTEINE NATURALI

PROTEINE ARTIFICIALIPROTEINE ARTIFICIALI

APPLICAZIONI

INDUSTRIA

MOLECOLE STABILI ED ATTIVE INCONDIZIONI PARTICOLARI DI PH,TEMPERATURA E CONDIZIONI DIREAZIONE

BIOMEDICINA

MOLECOLE STABILI ED ATTIVE INCONDIZIONI FISIOLOGICHE, INPRESENZA DI ENZIMI ED INIBITORI,AD EMIVITA LUNGA E DA VEICOLAREEFFICACEMENTE AI BERSAGLICELLULARI

IN UN ESPERIMENTO DI INGEGNERIA PROTEICA SI POSSONO MODULAREMOLTE PROPRIETA’ DI UNA MOLECOLA

ALTRI PARAMETRI BIOLOGICI E CLINICI

Proprieta’ generaliRESIDUI IDROFOBICI ESPOSTISOLUBILITA’

SITI DI LEGAMEAFFINITA’SPECIFICITA’

TERMINALIFUSIONI CONPEPTIDI O PEG

LOOPSRESISTENZAPROTEOLISI

NUCLEOSTABILITA’CONTROLLOCONFORMAZIONALE

EPITOPIIMMUNOGENICITA’

DESIGN RAZIONALEEVOLUZIONE GUIDATA

BioinformaticaGenomica strutturaleGenomica funzionale

Biochimicastrutturale

(NMR, X-ray, Massa)

IDENTIFICAZIONE MOLECOLA

RACCOLTA INFORMAZIONI

Ingegneria genetica Ingegneria proteicaIngegneria metabolica

BIOMOLECOLE ATTIVE

L’INGEGNERIA PROTEICA RICHIEDE UN APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE

lamB

lamB

promotore terminatore

lamB

RBS

Di cosa ho bisogno per esprimere una proteina?

UN GENE

UNA UNITA’ DITRASCRIZIONE

UNA UNITA’ DITRADUZIONE

STOP

DNA RICOMBINANTE ED INGEGNERIA PROTEICA

Alcuni punti importanti da rispettare:

Qualità del prodotto proteico e Resa del sistema di produzione.Rapporto qualità/costo vantaggioso.Assenza di agenti infettivi per l’uomo.

FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI

1: Identificazione, isolamento e clonaggio gene codificante per proteinabersaglio

2: espressione in sistema eterologo

3: purificazione e caratterizzazione proteina wild type

4: progettazione, produzione e caratterizzazione versioni mutate

FASE 1: isolamento gene codificante

-INFORMAZIONI SULLA PROTEINA DI INTERESSE -INFORMAZIONI SU PROTEINE OMOLOGHE

(STRUTTURA/FUNZIONE)-ANTICORPO SPECIFICO

⇓

- ISOLAMENTO (SINTESI) SEQUENZA CODIFICANTE⇓

- ANALISI DI COLLEZIONI DI MOLECOLE (GENI O PRODOTTI)- REAZIONE A CATENA DI POLIMERASI TERMOSTABILI (PCR)

- SINTESI CHIMICA EX NOVO ⇓

-DETERMINAZIONE SEQUENZA NUCLEOTIDICA E CLONAGGIO

Alcuni casi difficiliproteina e/o mRNA poco abbondanteproteina oligomericacofattori e/o gruppi prostetici

Controllo trascrizionale Controllo traduzionale Controllo post-traduzionale

RNA polimerasi

Velocità di traduzione

Stabilità mRNA

Ribosoma

mRNA

Proteina

Modificazioni

post-traduzionali

Compartimenti

(periplasma procarioti)

DNA

procarioti

eucarioti

L’espressione eterologa di una proteina segue le regole della cellula ospite

-Scelta coppia sistema di espressione/ospite dipende dalle caratteristichemolecolari della proteina di interesse( importanza di qualità e resa).

-Procarioti o eucarioti? Differenze (vantaggi e svantaggi):

- Compartimentalizzazione- Uso del codice genetico (tRNA)- Stabilità cloni ricombinanti- Modificazioni post-traduzionali- Resa in biomassa- Purificazione- Crescite terreni modificati (isotopi o metalli pesanti)- Costo- fattibilità su piccola scala e larga scala

(a) Sistemi di espressione procariotici (Rese: µg-mg/litro coltura)

- Ospite più utilizzato: Escherichia coli-Plasmidi e virus batterici

1. Caratteristiche vettore

2. Efficienza trascrizionale

2. Efficienza traduzionale

3. Stabilità della proteina

DNA RNA Proteina

Parametri principali nei procarioti

NUMERO DI COPIE PER CELLULA:-Derivati di pBR322: 15-20 copie per cellula- Derivati di pUC: 150-200 copie per cellula

Il numero di copie influenza:- positivamente la stabilità del plasmide, cioè la sua presenza nellegenerazioni successive.-negativamente la velocità di crescita del ceppo ospite: crescono meglio lecellule con meno copie.

I PLASMIDI AD ALTO NUMERO DI COPIE NON SEMBRANOCONFERIRE UN VANTAGGIO PER LA PRODUZIONE DELLA PROTEINA

VETTORE DI ESPRESSIONE PROCARIOTICO

SELEZIONE: Ampicillina, tetraciclina, kanamicinaSconsigliata ampicillina perché:

- perdita di resistenza- potenzialmente allergenica

Densitàcellulare

Tempo di crescita

Fase lag

Fase logaritmica

Fase stazionaria

Morte cellulare

PROMOTORE: COSTITUTIVO O INDUCIBILE??

Promotore Induzione altrolac IPTG lattosiotac IPTG “trc IPTG “T7 IPTG “trp Trp

mancanzaAnalogo acidoindolacetico

araBAD L-ArabinosePL(l) termica Espr.basale/induzione

di hspPR(l) termica “lac(TS) termicaPSPA Costitutivo

PROMOTORE (costitutivo o inducibile):-costo dell’induttore-efficacia dell’induzione e della repressione in condizioni di non-induzione per bilanciare produzione di biomassa e resa in proteina-forza del promotore e resa in proteina (solubile)

E.coli lambda lisogeno (λDE3)

Il sistema di espressione pET

SEGNALI RELATIVI ALLA TRADUZIONE:

-SEQUENZA SHINE-DALGARNO OTTIMALE

5’-UAAGGAGG-3’

- POSIZIONE: 4-8 NUCLEOTIDI DA AUG (rimozione N-terminale?)

- SECONDO CODONE: di solito ricco in A nei geni moltoespressi. AAA(lys) è frequente (13%).

- 5’ RICCO IN GC DIMINUISCE EFFICIENZATRADUZIONE

CODON USAGEUSO DI CODONI RARI PUO’ PORTARE A PROBLEMI:STABILITA’ mRNA DIMINUITA TERMINAZIONE PREMATURA DI TRASCRIZIONE/TRADUZIONE FRAMESHIFT, DELEZIONI, INCORPORAZIONI ERRATE INIBIZIONE DELLA CRESCITA CELLULARE

CODONI USATI CONFREQUENZA BASSANELLE VARIE SPECIE(tRNA meno abbondanti)

FREQUENZA DIUSO DEI CODONIRARI DI E.coliIN ALTRE SPECIE

ESPRIMERE IN E.COLI UN GENE RICCO IN CODONI RARIABBASSA LA EFFICIENZA DI TRADUZIONE

BL21 (DE3)CodonPlus-RIL

AGG/AGA(arginine),AUA(isoleucine)and CUA(leucine)

Stratagene

BL21 (DE3)CodonPlus-RP

AGG/AGA(arginine)and CCC(proline)

Stratagene

Rosetta orRosetta (DE3)

AGG/AGA(arginine),CGG(arginine),AUA(isoleucine)CUA(leucine),CCC(proline),and GGA(glycine)

Novagen

CEPPI DI E.COLICHE ESPRIMONO tRNA RARI

QUALI SOLUZIONI?

-Geni mutati o costruiti (sintetici)

CEPPI CHE ESPRIMONO MENO PROTEASI

MANCATA O BASSA ESPRESSIONE

LA PROTEINA VIENE ESPRESSA IN CONDIZIONI NON DI INDUZIONE

* ESPRESSIONE COSTITUIVA DI UN REPRESSORElac repressor(the lacI or lacIq) PER PROMOTORE LAC* USARE UN PROMOTORE STRINGENTE, e.g. the arabinose promoter(PBAD).* USARE PLASMIDE A BASSO NUMERO DI COPIE* VETTORI PET: USARE CEPPI CON T7 Lisozima from a compatiblepLysS or pLysE plasmid (Novagen). IL LISOZIMA SI LEGA ALLA POLIMERASIED INATTIVA L’ENZIMA IN ASSENZA DI INDUTTORE•AGGIUNGERE 1% glucosio PER REPRIMERE IL PROMOTORE lac INDOTTO DALATTOSIO PRESENTE NEI MEZZI DI COLTURA MASSIMI ( LB, 2xYT).

LA STABILITA’ DEL PLASMIDE E’ BASSA

*AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DELL’ANTIBIOTICO DI SELEZIONE

LA PROTEINA E’ TOSSICA

*ESPRESSIONE NEL PERIPLASMA O IN CORPI INCLUSI

LA PROTEINA RICOMBINANTE DEVE ESSERE SOLUBILE

SPESSO SI HA LA FORMAZIONE DI CORPI INCLUSI

(aggregati proteici insolubili in acqua)

STRATEGIE PER AUMENTARE LA SOLUBILITA’

RIDURRE LA VELOCITA’ DI TRADUZIONE

* ABBASSARE LA TEMPERATURA DI CRESCITA* USARE UN PROMOTORE PIU’ DEBOLE* USARE UN PLASMIDE A BASSO NUMERO DI COPIE* ABBASSARE LA CONCENTRAZIONE DI INDUTTORE

CAMBIARE LE CONDIZIONI DI CRESCITA* AGGIUNGERE COFATTORI NECESSARI PER FOLDING* CONTROLLARE LE VARIAZIONI DI PH* AGGIUNGERE GLUCOSIO 1% PER REPRIMERE LA ESPRESSIONE

DEL PROMOTORE LAC INDOTTO DA LATTOSIO PRESENTE NEI TERRENI MASSIMI ( LB, 2xYT).

* AGGIUNGERE ETANOLO, TIOLI A BASSO PESO MOLECOLARE, NaCl.

CO- ESPRIMERE CON IL GENE DI INTERESSE CON:

ALTRE SUBUNITA’ DELL’OLIGOMERO

CHAPERONES MOLECOLARI

* GroES-GroEL* DnaK-DnaJ-GrpE* ClpB

FOLDASI

• PEPTIDIL -PROLIL CIS/TRANS ISOMERASI (PPI's)• DISULFURO-OSSIDOREDUTTASI (DsbA)• DISULFURO ISOMERASI (DsbC)• PROTEINA DISOLFURO ISOMERASI (PDI) – EUCARIOTICA-CATALIZZA SIA OSSIDAZIONE DELLE CISTEINE CHE DSI: HA ANCHEATTIVITA’ CHAPERONE.

ESPRIMERE LA PROTEINA NEL PERIPLASMA MEDIANTE AGGIUNTA DI UNASEQUENZA SEGNALE (pelB/ompT)

• L’AMBIENTE E’ PIU’ OSSIDANTE CHE NEL CITOPLASMA• SONO PRESENTI DsbA E DsbC• ATTIVITA’ PROTEOLITICA RIDOTTA• PERMETTE ACCUMULO DI PROTEINE TOSSICHE NELCITOPLASMA• N-TERMINALE VERO

Svantaggi: livelli di espressioni minori

USARE CELLULE OSPITI “SPECIALI” CON CITOPLASMA OSSIDANTE

CEPPI COMMERCIALI

* AD494, mutato nella tioredossina reduttasi (trxB).* Origami, mutato nella tioredossina reduttasi (trxB) e glutatione reduttasi (gor).

PRODURRE UNA PROTEINA DI FUSIONE CON PROTEINA SOLUBILE

MALTOSE-BINDING PROTEINUBIQUITINDsbATIOREDOSSINAIgG-BINDING DOMAIN

SVANTAGGI: RECUPERO DELLA PROTEINA MEDIANTE PROTEOLISI

ESPRIMERE FRAMMENTI SOLUBILI DELLA PROTEINA

IN ALCUNI CASI LA ESPRESSIONE NEI CORPI INCLUSI PUO’ ESSERE UNVANTAGGIO:

• LA PROTEINA RICOMBINANTE E’ FINO AL 50% DELLE PROTEINE TOTALI

• E’ PROTETTA DALLA DEGRADAZIONE• NON PUO’ ESSERE TOSSICA PER LA CELLULA

LA PROTEINA NATIVA DEVE ESSERE RECUPERATA MEDIANTEDENATURAZIONE IN VITRO E REFOLDING

*ISOLAMENTO DEI CORPI INCLUSI. SHOCK OSMOTICO E CENTRIFUGAZIONE

*DENATURAZIONE IN PRESENZA DI AGENTI DENATURANTI COME GUANIDINA O UREA O CONDIZIONI RIDUCENTI(e.g. DTT).

*REFOLDING DELLA PROTEINA MEDIANTE LENTA RIMOZIONE DEL DENATURANTE CON DIALISI, DILUIZIONE O CROMATOGRAFIA(IN PRESENZA DI AGENTI RIDUCENTI )